Evaluación de fertilizantes en medios de cultivo como reemplazo de reactivos químicos puros en el cultivo in vitro de malanga (Colocasia esculenta (L.) Schott) Manuel Elías Gómez Lugo Escuela Agrícola Panamericana, Zamorano Honduras Noviembre, 2017 i ZAMORANO CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA Evaluación del efecto de reemplazar cinco reactivos químicos por fertilizantes en el cultivo in vitro de malanga (Colocasia esculenta (L.) Schott) Proyecto especial de graduación presentado como requisito parcial para optar al título de Ingeniero Agrónomo en el Grado Académico de Licenciatura Presentado por Manuel Elías Gómez Lugo Zamorano, Honduras Noviembre 2017 iii Evaluación de fertilizantes en medios de cultivo como reemplazo de reactivos químicos puros en el cultivo in vitro de malanga (Colocasia esculenta (L.) Schott) Manuel Elías Gómez Lugo Resumen. La malanga es una planta herbácea perenne tropical y subtropical, su cormo tiene valor nutricional por su alto contenido de carbohidratos. La propagación de plántulas de malanga a través del cultivo in vitro se ha convertido en una alternativa para la producción rápida, masiva y libre de enfermedades. El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de sustituir los macroelementos descritos en la formulación de Murashige y Skoog añadidos comúnmente en forma de reactivos químicos puros por fertilizantes de alta solubilidad en la producción in vitro de brotes de malanga en las etapas de establecimiento y multiplicación. Se realizaron equiparaciones molares para proveer con los fertilizantes la misma cantidad de nutrientes dada por la formulación de Murashige y Skoog. Se evaluaron cuatro tratamientos donde la solución de macroelementos se preparó con: 1. reactivos químicos (testigo); 2. fertilizantes; 3. nitratos de amonio y nitrato de potasio como fertilizantes y los otros tres macroelementos como reactivos químicos; 4. nitrato de amonio y nitrato de potasio como reactivos químicos y los otros tres macroelementos como fertilizantes. Se midió el número de brotes por plántula a los 7,14 y 21 días. Los resultados muestran que no existen diferencias significativas en la formación de brotes entre tratamientos en el establecimiento ni en la multiplicación. Es posible sustituir macronutrientes en forma de reactivos químicos puros por fertilizantes comerciales en las etapas de establecimiento y multiplicación en el cultivo in vitro de malanga si se realiza equiparación molar. Palabras clave: Brotes, equiparación molar, macronutrientes MS. Abstract. Taro is a perennial tropical and subtropical herbaceous plant, its corm has nutritional value because of its high carbohydrate content. The propagation of taro seedlings through in vitro culture has become an alternative for rapid, massive and disease-free production. The objective of this study was to evaluate the effect of replacing the macroelements described in the Murashige and Skoog formulation commonly added as pure chemical reagents by high solubility fertilizers in the in vitro production of taro shoots in the establishment and multiplication stages. Molar equations were made to provide the same amount of nutrients with the fertilizers given by the Murashige and Skoog formulation. Four treatments were evaluated where the macroelement solution was prepared with: 1. chemical reagents (control); 2. fertilizers; 3. ammonium nitrates and potassium nitrate as fertilizers and the other three macroelements as chemical reagents; 4. ammonium nitrate and potassium nitrate as chemical reagents and the other three macro elements as fertilizers. The number of shoots per plantlet was measured at 7, 14 and 21 days. The results show that there are no significant differences in the formation of shoots between treatments in the establishment or multiplication. It is possible to replace macronutrients in the form of pure chemical reagents by commercial fertilizers in the stages of establishment and multiplication in the in vitro culture of taro if molar equalization is made. Key words: Macroelement MS, molar equations, shoots. iv CONTENIDO Portadilla ....................................................................................................... i Página de firmas ............................................................................................ ii Resumen ........................................................................................................ iii Contenido ...................................................................................................... iv Índice de Cuadros, Figuras y Anexos .......................................................... v 1. INTRODUCCIÓN ....................................................................................... 1 2. METODOLOGÍA........................................................................................ 3 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................. 10 4. CONCLUSIÓN ............................................................................................ 12 5. RECOMENDACIONES ............................................................................. 13 6. LITERATURA CITADA ............................................................................ 14 7. ANEXOS ...................................................................................................... 16 v ÍNDICE DE CUADROS, FIGURAS Y ANEXOS Cuadros Página 1. Medio de cultivo basal de Murashige y Skoog modificado para establecimiento in vitro de malanga (Colocasia esculenta (L.) Shott)............................................. 5 2. Medio de cultivo basal de Murashige y Skoog modificado para multiplicación in vitro de malanga (Colocasia esculenta (L.) Shott)............................................. 6 3. Fertilizantes utilizados para reemplazar cinco reactivos químicos de los macroelementos de Murashige y Skoog para la multiplicación in vitro de malanga (Colocasia esculenta (L.) Shott) .............................................................. 7 4. Diferencia de nutrientes aplicados entre los reactivos químicos puros y los fertilizantes. ............................................................................................................ 8 5. Efecto de reemplazar reactivos químicos por fertilizantes en la formación de brotes por explante durante el establecimiento y multiplicación in vitro de malanga (Colocasia esculenta (L.) Shott) .............................................................. 10 Figuras Página 1. Preparación del material vegetal de los cormos de malanga (Colocasia esculenta (L.) Shott) desde campo hasta la siembra in vitro.. ................................ 3 2. Cormos de malanga (Colocasia esculenta (L.) Shott) reducidos en el proceso de desinfección previo a la siembra in vitro. ............................................................... 4 3. Comparación de la apariencia de las vitro plantas de malanga (Colocasia esculenta (L.) Shott) entre tratamientos en la etapa de establecimiento.. .............. 11 4. Comparación de la apariencia de las vitro plantas de malanga (Colocasia esculenta (L.) Shott) entre tratamientos en la etapa de multiplicación.. ................ 11 Anexos Página 1. Solución madre del tratamiento Reactivos Químicos. .......................................... 16 2. Solución madre del tratamiento Fertilizantes. ....................................................... 16 3. Solución madre del tratamiento Nitratados Fertilizantes. ..................................... 16 4. Solución madre del tratamiento Nitratados Reactivos Químicos. ......................... 17 1 1. INTRODUCCIÓN La malanga (Colocasia esculenta (L.) Schott) es una planta herbácea perenne tropical y subtropical miembro de la familia de Araceae. No tiene tallos aéreos y tiene hojas grandes que provienen de un cormo subterráneo y que forma un pseudotallo pequeño. El pH del suelo para el cultivo de malanga oscila de 5.5 a 7.8. La temperatura tiene un rango óptimo de 25° a 35°C para su máxima tasa fotosintética, necesita mucha humedad en el suelo por lo que tiene un desarrollo óptimo con precipitación de 2500 mm anuales y en alturas entre 600 a 1800 msnm, aunque se podría cultivar a nivel del mar (Manner y Taylor 2011). La producción mundial de malanga para el año 2014 fue de aproximadamente 10 millones de toneladas y se concentra en la zona central y occidental de África Tropical, China y Oceanía (FAOSTAT 2017). Honduras generó más de 3.5 millones de dólares en las exportaciones de malanga entre 2015 y 2016 (SAG 2017). El cormo de esta planta tiene valor nutricional por su alto contenido de carbohidratos. Los almidones de raíces y tubérculos representan una alternativa para solucionar problemas de hambre y dependencia de importaciones. Dado que el cultivo presenta porcentajes de almidón superiores al 80%, es comúnmente utilizada para remplazar materias primas convencionales de la industria alimentaria como maíz, ñame, yuca y papa (Torres Rapelo et al. 2013). Además, en países en vías de desarrollo la malanga es un cultivo que constituye una fuente de ingresos para pequeños productores de zonas rurales (Viloria y Córdova 2008). La malanga es uno de los cultivos más cotizados por la población antillana, por su riqueza energética y fácil digestión. Es el único alimento cuya digestión se realiza a pH neutro o cercano a éste, por lo que es recomendable en la dieta de personas con trastornos digestivos (González Vásquez et al. 2012). La malanga es comúnmente un cultivo de propagación vegetativa. Hay esencialmente cinco tipos de material de propagación: chupones, cormillos, trozos de cormo, tallos rastreros o estolones y plántulas de cultivo de tejidos. El material de propagación se produce generalmente en el campo al mismo tiempo que el cultivo, lo cual significa que las mejores prácticas usadas para la producción de malanga también beneficiarán al material de propagación (Taylor 2007). La forma de propagación convencional de la malanga facilita la diseminación de plagas y enfermedades. Estas son diseminadas en las nuevas áreas de producción a través del material de siembra. Uno de los mayores problemas es la presencia del virus del mosaico Dasheen (DsMV) o virus del mosaico de la malanga (Enríquez Juárez y Mairena Úbeda 2 2011). Se conocen varios virus que infectan la malanga siendo este el más común (Taylor 2007). El virus del mosaico de la malanga se encuentra distribuido en las regiones tropicales y subtropicales donde se cultivan varios géneros y especies de malanga. Produce desde mosaico intenso hasta la deformación de las hojas, y conllevan a la evidente reducción de pigmentos fotosintéticos. La pérdida de pigmentos en el material afectado puede conducir a disminuir la eficiencia en la producción de hidratos de carbono durante la fotosíntesis y la consiguiente reducción de los rendimientos (Cabrera et al. 2010). El virus del mosaico de la malanga (DsMV, del inglés “Dasheen mosaic virus”) constituye una de las principales enfermedades de este cultivo. Es la enfermedad viral más difundida a nivel mundial. El traslado indiscriminado de la semilla ha aumentado su incidencia con pérdidas que alcanzan el 60% (González Vásquez et al. 2012). La propagación de plántulas de malanga a través del cultivo in vitro se ha convertido en una alternativa para la producción rápida, masiva y libre de enfermedades. El cultivo de tejidos sirve para recuperar material de interés libre de patógenos en líneas infectadas. A través del cultivo de meristemos es posible eliminar virus, bacterias y fitoplasmas (Castañeda-Castro et al. 2014). Utilizando la técnica del cultivo in vitro vía organogénesis directa, a través de yemas axilares se propagan diversos clones de malanga. Sin embargo, la organogénesis directa está limitada como metodología eficiente de aplicabilidad comercial, principalmente por su intensa labor y altos costos de producción (Santos Pino et al. 2011). Estudios anteriores demostraron que es posible disminuir costos de producción en los cultivos in vitro sustituyendo ciertos ingredientes del medio de cultivo como los productos comerciales con alta pureza que suelen ser difíciles de conseguir por procesos de importación que resultan en incremento de costos y demora. Se obtuvo resultados en los que, tratamientos sustituyendo macronutrientes y micronutrientes del medio de cultivo por fertilizantes foliares, no se encontró diferencias significativas en el número de yemas en el brote principal, la longitud del brote principal, número de raíces por planta y cantidad de plantas sin síntomas de deficiencias nutricionales en el cultivo de papa (Solanum tuberosum) (Azofeifa et al.2008). Otro estudio demuestra que sustituir las sales inorgánicas por fertilizantes comerciales en el medio de cultivo da buenos resultados para la propagación in vitro de Laelia anceps. Fertilizantes como el Peters (24-8-16) al 25% promueve la generación de pseudobulbos y plantas con mayor tamaño (Romero-Tirado et al. 2007). Por estas razones se busca conseguir una alternativa para la producción in vitro de malanga reduciendo los costos de producción manteniendo las cualidades que se obtienen en un medio de cultivo ya probado. El objetivo de este estudio fue:  Evaluar el efecto de remplazar cinco reactivos químicos por fertilizantes en la formulación de macroelementos de Murashige y Skoog en la producción in vitro de plántulas de malanga (Colocasia esculenta (L.) Schott). 3 2. METODOLOGÍA Ubicación. El proyecto de investigación se realizó en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del Departamento de Ciencia y Producción Agropecuaria de la Escuela Agrícola Panamericana, Zamorano Honduras. Material Vegetal. Se utilizaron cormos de aproximadamente 150 g para la obtener los meristemos apicales. Luego de su cosecha los cormos fueron reducidos en tamaño y sumergidos en solución de Clorotalonil 0.5 mL/L y Estreptomicina y Oxitetraciclina 3 g/L y puestos a secar sobre papel absorbente y se mantuvieron en un lugar fresco y seco por cuatro días hasta su siembra en el laboratorio. Figura 1. Preparación del material vegetal de los cormos de malanga (Colocasia esculenta (L.) Shott) desde campo hasta la siembra in vitro. A- Cormo de sin hojas, B- Cormo sin la base, C- Meristemo reducido y listo para siembra, D- Meristemo sembrado en el medio de cultivo. Desinfección superficial del material vegetal. Los cormos desinfectaron superficialmente, se lavaron tres veces con agua corriente y jabón líquido comercial, luego se sumergieron en alcohol al 70% por un minuto, después se sumergieron por 20 minutos en una solución de NaClO al 30% (v/v) (cloro líquido comercial con hipoclorito de sodio al 4.72% de ingrediente activo) a esta solución se le aplicó dos gotas de Tween® 80 por cada 100 mL de la solución (Figura 2). Dentro de la cámara de flujo laminar se decantó la solución de NaClO y se realizaron tres enjuagues con agua destilada estéril (Astudillo Robles 2013). 4 Figura 2. Cormos de malanga (Colocasia esculenta (L.) Shott) reducidos en el proceso de desinfección previo a la siembra in vitro. Medio de cultivo. Los explantes se establecieron en el medio de cultivo de Murashige y Skoog modificado para el establecimiento in vitro de malanga semisólido y suplementado con 2 mg/L de BAP + 0.3 mg/L de AIB (Cuadro 1). Para la etapa de multiplicación se usó el medio de Murashige y Skoog modificado y suplementado 3 mg/L de BAP (Cuadro 2). Para la preparación de los medios de cultivo se utilizó agua destilada, se ajustó el pH a 5.7 utilizando KOH y/o HCL Phytagel ® (1.8 g/L) para gelificar el medio, se dispensaron 20 mL de medio en cada frasco luego se sellaron con papel aluminio y se esterilizó a 15 PSI, 121°C por 20 minutos. 5 Cuadro 1. Medio de cultivo basal de Murashige y Skoog modificado para establecimiento in vitro de malanga (Colocasia esculenta (L.) Shott) Componentes Fórmula química Nombre Común mg/L Macroelementos CaCl₂.2H₂O Cloruro de calcio bihidratado 440.000 KH₂PO₄ Fosfato monobásico de potasio 170.000 KNO₃ Nitrato de potasio 1,900.000 MgSO₄.7H₂O Sulfato de magnesio heptahidratado 370.000 NH₄NO₃ Nitrato de amonio 1,650.000 Microelementos H₃BO₃ Ácido bórico 6.200 CoCl₂.6H₂O Cloruro de cobalto hexahidratado 0.025 CuSO₄.5H₂O Sulfato de cobre pentahidratado 0.025 KI Yoduro de potasio 0.830 MnSO₄.4H₂O Sulfato de manganeso tetrahidratado 22.300 Na₂MoO₄.2H₂O Molibdato de sodio bihidratado 0.250 ZnSO₄.7H₂O Sulfato de zinc heptahidratado 8.600 FeNa EDTA Sal férrica sódica de ácido 50.000 Etilendiaminotetraacético Vitaminas Myo-inositol 100.000 Tiamina 0.400 Hormonas BAP 2.000 AIB 0.300 Carbohidrato Sacarosa 30,000.000 Fuente: Navarro Paniagua 2013 6 Cuadro 2. Medio de cultivo basal de Murashige y Skoog modificado para multiplicación in vitro de malanga (Colocasia esculenta (L.) Shott) Componentes Fórmula química Nombre Común mg/L Macroelementos CaCl₂.2H₂O Cloruro de calcio bihidratado 440.000 KH₂PO₄ Fosfato monobásico de potasio 170.000 KNO₃ Nitrato de potasio 1,900.000 MgSO₄.7H₂O Sulfato de magnesio heptahidratado 370.000 NH₄NO₃ Nitrato de amonio 1,650.000 Microelementos H₃BO₃ Ácido bórico 6.200 CoCl₂.6H₂O Cloruro de cobalto hexahidratado 0.025 CuSO₄.5H₂O Sulfato de cobre pentahidratado 0.025 KI Yoduro de potasio 0.830 MnSO₄.4H₂O Sulfato de manganeso tetrahidratado 22.300 Na₂MoO₄.2H₂O Molibdato de sodio bihidratado 0.250 ZnSO₄.7H₂O Sulfato de zinc heptahidratado 8.600 FeNa EDTA Sal férrica sódica de ácido 5.000 Etilendiaminotetraacético Vitaminas Myo-inositol 100.000 Tiamina 0.100 Piridoxina 0.500 Ácido Nicotínico 0.500 Aminoácidos Glicina 2.000 Hormonas BAP 3.000 Carbohidrato Sacarosa 30,000.000 Fuente: Astudillo Robles 2013 Para la sustitución de los macroelementos agregados en forma de reactivos químicos puros se utilizaron fertilizantes de alta solubilidad, estos son fáciles de conseguir y representan una alternativa más económica y accesible (Cuadro 3). 7 Cuadro 3. Fertilizantes utilizados para reemplazar cinco reactivos químicos de los macroelementos de Murashige y Skoog para la multiplicación in vitro de malanga (Colocasia esculenta (L.) Shott) Nombre común y fórmula química Fórmula Dosis (N-P-K-Ca-Mg-S-Cl) (mg/L) Nitrato de amonio (NH4NO3) 34.5-0-0-0-0-0-0 1,640 Nitrato de potasio (KNO3) 13.5-36.5-0-0-0-0-0 2,040 Sulfato de magnesio Heptahidratado (MgSO4.7H2O) 0-0-0-0-9.8-13-0 372 Fosfato monobásico de potasio (KH2PO4) 0-52-34-0-0-0-0 170 Cloruro de calcio (CaCl2) 0-0-0-93(CaCl2)+0.25 (CaOH2)-0-0- Cl 93 345 Se realizó equiparación molar para proveer a los propágulos la misma cantidad de nutrientes que los reactivos químicos. Para realizarla se tomó en cuenta el peso molecular del reactivo y del elemento, el porcentaje del elemento deseado en los fertilizantes comerciales y el peso total de la molécula. Con estas variables se calculó la cantidad del fertilizante a utilizar para proporcionar la cantidad de nutrientes lo más parecida a la dosis recomendada por Murashige y Skoog (Cuadro 4). 8 Cuadro 4. Diferencia de nutrientes aplicados entre los reactivos químicos puros y los fertilizantes. Insumo Nutrientes Peso reactivo (mg) Peso fertilizante (mg) Dif (mg) % NH4NO3 1650 1640 N 577.50 565.80 -11.7 -2.0 KNO3 1900 2040 N 263.37 275.40 12.0 4.6 K 733.66 744.82 11.2 1.5 MgSO4.7H2O 370 372 Mg 36.10 36.46 0.4 1.0 S 48.13 48.36 0.2 0.5 KH2PO4 170 170 K 48.04 47.96 -0.1 -0.2 P 38.19 38.60 0.4 1.1 CaCl2.2H2O 440 345 Ca 117.33 117.14 -0.2 -0.2 Cl 205.33 204.18 -1.2 -0.6 5 Fertilizantes N 841 841 0.3 0.0 K 782 793 11.1 1.4 Mg 36.1 36.5 0.4 1.0 S 48.1 48.4 0.2 0.5 P 38.2 38.6 0.4 1.0 Ca 117.3 117.1 -0.2 -0.1 Cl 205.3 204.2 -1.1 -0.5 Total 2,068.0 2,079.0 12.0 3.0 Tratamientos. Se evaluaron cuatro tratamientos donde las soluciones de macroelementos fueron preparadas con: 1. Reactivos Químicos: Los macroelementos del medio fueron agregados como reactivos químicos puros y siguiendo la recomendación de Murashige y Skoog (Cuadros 1 y 2). 2. Fertilizantes: Los macroelementos fueron agregados como fertilizantes (Cuadro 4). 3. Nitratos Fertilizantes: Medio de cultivo preparado remplazando el nitrato de amonio y el nitrato de potasio por fertilizantes de alta solubilidad, el sulfato de magnesio heptahidratado, el cloruro de calcio y el fosfato monobásico de potasio se agregaron como reactivos químicos puros. 4. Nitratos Reactivos Químicos: Medio de cultivo preparado remplazando el sulfato de magnesio heptahidratado, el cloruro de calcio y el fosfato monobásico de potasio por fertilizantes de alta solubilidad, el nitrato de amonio y el nitrato de potasio se agregaron como reactivos químicos puros. 9 Refrescamiento. Cada 21 días se refrescó del medio de cultivo en el que se cambiaban las vitro plantas de frasco con medio nuevo. Incubación. Los frascos fueron incubados a una temperatura de 24°C, con una humedad relativa 70%, con intensidad lumínica de 2000 lux y un fotoperiodo de 16 horas luz por lámparas fluorescentes. Diseño experimental. Se utilizó un Diseño Completamente al Azar con cuatro tratamientos y 70 repeticiones por tratamiento. Cada repetición es considerada una unidad experimental. Variables medidas. Cada semana se contaron los brotes en cada una de las unidades experimentales. Se tomaron los datos del conteo anterior a cada multiplicación y se hizo un análisis estadístico para evaluar las diferencias entre tratamientos. Se contó el número de explantes establecidos al día 21 y número de brotes por explante a partir del día 21 cada 7 días hasta el día 111. Análisis estadístico. Se realizó un análisis de varianza con separación de medias con el método de Duncan exigiendo un nivel de significancia (P≤0.05). Se usó el programa estadístico “Statistical Analysis System” (SAS® versión 9.4). 10 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Sobrevivencia. El porcentaje de sobrevivencia fue de 100%, ya que no murió ninguna de las plántulas en ninguno de los tratamientos y en ninguna de las etapas del experimento. Número de brotes por explante. Después de analizar los datos y haber hecho la separación de medias se comprobó que no hubo diferencias significativas en el número de brotes entre los tratamientos evaluados en el establecimiento ni en las multiplicaciones (Cuadro 5). Esto significa que los tratamientos hacen que las vitro plantas tengan un comportamiento similar (Figura 3 y 4). Estos resultados concuerdan con los de Azofeifa et al. 2008 en los que se sustituyó abonos foliares comerciales en la elaboración de medios de cultivo in vitro para papa y no obtuvo diferencias significativas entre tratamientos en variables como altura, peso fresco y raíces. Cuadro 5. Efecto de reemplazar reactivos químicos por fertilizantes en la formación de brotes por explante durante el establecimiento y multiplicación in vitro de malanga (Colocasia esculenta (L.) Shott) Tratamientos Establecimiento Multiplicación 1 2 3 1 Testigo 1.45 ns 1.69 ns 2.75 ns 1.85 ns 2 Fertilizantes 1.43 1.63 2.48 1.86 3 Nitratos Fertilizantes 1.64 1.74 2.84 2.14 4 Nitratos Reactivos Químicos 1.54 1.67 2.82 1.80 Prueba F 0.33 0.09 2.1 1.12 Coeficiente de variación 40.98 41.43 42.54 58.31 Grados de libertad 51 72 81 199 Probabilidad 0.806 0.9665 0.1072 0.3441 ns: No hay diferencias significativas basadas en la prueba de separación Duncan (P≤0.05) Estos resultados no concuerdan con los de un estudio en el que, si hubo diferencias significativas entre tratamientos al sustituir nitrato de amonio, nitrato de potasio y sulfato de magnesio en forma de fertilizantes en el medio de cultivo para camote (Ipomoea batatas L.) (Tobar Hernández 2016). En este estudio no se realizó equiparación molar, lo que puede explicar esos resultados y destaca la importancia de hacer este procedimiento en estos tipos de estudios. 11 Figura 3. Comparación de la apariencia de las vitro plantas de malanga (Colocasia esculenta (L.) Shott) entre tratamientos en la etapa de establecimiento. A- Reactivos químicos, B- Fertilizantes, C- Nitratos Fertilizantes, D- Nitratos Reactivos Químicos. Figura 4. Comparación de la apariencia de las vitro plantas de malanga (Colocasia esculenta (L.) Shott) entre tratamientos en la etapa de multiplicación. A- Reactivos químicos, B- Fertilizantes, C- Nitratos Fertilizantes, D- Nitratos Reactivos Químicos. 12 4. CONCLUSIÓN Es posible sustituir macronutrientes en forma de reactivos químicos puros por fertilizantes comerciales en las etapas de establecimiento y multiplicación en el cultivo in vitro de malanga si se realiza equiparación molar. 13 5. RECOMENDACIONES  Repetir el estudio agregando los macronutrientes y micronutrientes en forma de fertilizantes de alta solubilidad.  Continuar el estudio en las etapas de enraizamiento y aclimatación. 14 6. LITERATURA CITADA Astudillo Robles JE. 2013. Establecimiento y multiplicación in vitro de malanga coco (Colocasia esculenta (L.) Schott) [Tesis]. Escuela Agrícola Panamericana, Zamorano-Honduras. 23 p. Azofeifa Á, Guevara E, Jiménez VM. 2008. Uso de abonos foliares comerciales en la elaboración de medios de cultivo in vitro. Agronomía Costarricense. [consultado 2017 jun 14]; 32(2): 149-160. eng. http://revistas.ucr.ac.cr/index.php/agrocost/article/view/6762 Cabrera D, González JE, Portal O, Hernández R. 2010. Influencia del virus del mosaico de la malanga sobre el contenido de clorofilas en Xanthosoma nigrum (vell.) genotipo inivit m 95-1. Revista Protección Vegetal. 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Macroelementos MS 10X g/L NH4NO3 16.500 KNO3 19.000 CaCl2.2H2O 4.400 MgSO4.7H2O 3.700 KH2PO4 (Agregar por último) 1.700 Anexo 2. Solución madre del tratamiento Fertilizantes. Macroelementos MS 10X g/L NH4NO3 Fertilizante 16.400 KNO3 Fertilizante 20.400 CaCl2 uso en Agroindustria 3.450 MgSO4.7H2O Fertilizante 3.720 KH2PO4 Fertilizante (agregar por último) 1.700 Anexo 3. Solución madre del tratamiento Nitratados Fertilizantes. Macroelementos MS 10X g/L NH4NO3 Fertilizante 16.400 KNO3 Fertilizante 20.400 CaCl2.2H2O reactivo químico 4.400 MgSO4.7H2O reactivo químico 3.700 KH2PO4 reactivo químico (agregar por último) 1.700 17 Anexo 4. Solución madre del tratamiento Nitratados Reactivos Químicos. Macroelementos MS 10X g/L NH4NO3 reactivo químico 16.500 KNO3 reactivo químico 19.000 CaCl2 uso en Agroindustria 3.450 MgSO4.7H2O Fertilizante 3.720 KH2PO4 Fertilizante (agregar por último) 1.700 Portada Portadilla Resumen Tabla de contenido Indice de cuadros, figuras y anexos Introducción Metodología Resultados y discusión Conclusión Recomendaciones Literatura citada