Evaluación de la incidencia de aflatoxinas en dos variedades de maiz (Zea mays) en Zamorano Jorge Alejandro Abastida Ulloa _ ' 'ICf·¡•c-~. ' ' ""~-~ ZAMORANO Departamento de Agronomía Abril; 1999 ¡ ' Evaluación de la incidencia de aflatoxinas en dos variedades de maíz en Zamorano Proyecto especial presentado como requisito parcial para optar al título de Ingeniero Agrónomo en el Grado Académico de Licenciatura. Presentado por Jorge Alejandro Abastída Ulloa Zamorano,Honduras Abril, 1999 DEDICATORIA A Dios todopoderoso par haber sida mi guia en toda momento y permitirme alcanzar una más de mis metas. A mis padres y hermanas par su invaluable ayuda y apoyo e¡¡ lodo momento. AGRADECIJ\UENTOS A Dios todopodemso por estar a mi lado en los momentos en que mis lo necesitl.ba. A mis padres, Jorge y Georgina por su confianza y todo el apoyo, comprensión y amor que me han brindado en el transcurso de mi vida. Al Dr. Rai.tl. Espinal por su apoyo y consejo~ que facilitaron la realización de este estudio y por ser más que Wl consejero, un amigo. Al Ing. Fr.mcisco Bue5o pm sus consejos oportunos y por su paciencia. Allng. Rodolfo Pacheco por su amistad y colabomción en el desarrollo del estudio. A Elialn Banegas por su desinteresada colaboración y por su amistad. A todo el personal del Depanamerrto de Agronomia, por su colaboración en la reali7..aclón del estudio. A mis compaiieros y amigo~ que hicieron de mi estadía en Zamorano una expcrie11cia inolvidable. "' AGRADECII\HENTO A PATROCINADORES Al Departarm:nto de Agronomla de la Escuela Agrlcola Panamericana por contribuir en el financiamiento de mis estudios en Zamorano. RES U?\-lEN A BASTIDA, J. 1999. Evaluación de la incidencia de aflatoxinas en dos variedades de mnfz en Zamorano, Proyecto Especial del Programa de Ingeniero Agrónomo, Zamorano, Honduras. 44 p. El oqjetivo del presente estudio fue el de cuantificar la incidencia de aflatoxinas en las variedades de mai:z Guayap~ y HB-104, cultivadas en Jos lotes de producción del Dcpart:nncnto de Agronomla de la Escuda Agrícola Pannmerieann. Et estudio se realizó pam dctcrminar la incidencia de afla.toxinas en las variedades y d~lerminar qué foctores t<:nían mayor influencia sobre la concentmción enconln!da de las mismas. Se realizaron tres muestreos en diferentes etapas (cosecha, secodo y almacenamiento) con tres repeticiones cnda uno. Las variedades fueron sembradas en seis lotes de producción (tres lotes para cadn variedad). Las variables que se evaluaron fueron el contenido de humedad del grano, duro:za del grano, densidad apurente, daño mecánico, daño por insectos y daño por hongos. El estudio demostró que no e.\isten diferencias significativas.entre las dos variedades de maíz evaluadas en cuanto a la concentración de aflatoxinas. También se detenninó que los factores evaluados que más influyeron en la producción de aflatoxinas ru~ron la hwn~dad, la dureza, d:til:o por insectos y daño p variedades evttlundas y que los factores que mas influyeron en la incidencia de esta wxina fueron la humedad del gmno, dureza., daño por insectos y daño por hongos. También se encontró que el manejo postcoseeha del grano juega posibl=ente, el papel mk imponantc en la disminución de aflatoxinas en mal7~ Este manejo incluye la ~. Porcrntaje de granos flotado~s en NaN03 encontrados por !ore de producción, variednd y etapa de muestreo en estudio realizado para determinar la incidencia de ailato:dnas en las variedades Guayape y HB-1 04, 1998... . . .. . .. .. .. . ..... .. .. . .. 22 6. Densidad aparente (lb.'bushel) del grano encontrada por lote de producción, variedad y etapa de muestreo en estudio realizado en Zamorano para determinar la incidencia de aflaroxinas en düs variedades de maíz, 1998... ... .. 23 7. Porcenbje de daño mecánico .:ncontrado por lote de producción. v:uiedad y etapa de mllestreo en estudio realizado en Zamorano para determinar la incidencia de aflatoxinas en dos variedades de maíz en, 1998... ...... ... ... ...... .. 24 E. Porcentaje de daño por insectos encontrado por lote de producción, variedad y crapa de muesrreo en estudio realizado en Zamorano para detenninar la incidencia de aflatoxinas en las variedades Guayape y HB-104, 1998... ... ... ..... 26 9. Porcentaje de daño hongos encontrado por lote de producción, variedad y etapa de mu~-streo en estudio realizado paro. determinar la incidencia de aDatoxinas en dos variedades de maíz en Zamorano, 1998 ..... , ...... , ............. , ............. , 27 10. Conccntnu.lión en (ppb) de ailato;-..inas encontrada pc~r lote de producciün, variedad y etapa de muestreo en estudio realizado para ddenninar la incidencia de aflato;dnas en dos variedades de malz en Zamorano, 1998... ...... .............. 29 Th"'DTC8 DE FIGURAS Figum l. C1.1rva de regn:ci6n para transformarabsorvancia a conc.:n!rnci6n de aflato:-..inas .•••.•.•.•.•.......••••. ,............................. .•.•.•............• 1 S 2. Precipitación mensual encontrada en Zamorano de agosto 1998 a enero 30 1999 ............................................................................... . 3. H1.1medad relativa encontrada ~n Zamorano de agosto 1998 a enero de 1999................................................................................ 31 ThTJ)ICE DE Ai\'EXOS Anexo l. Datos climatológicos en el valle de Zamorano ( 1 998·1999) ...............•.......... "." .........•........... ". . . . . ..•. .. .. . .•.•.•. 34 2. ANDEVA (Diferencia de medias) del ensayo para determinar la incidencia de aflatoxinas en dos varitdades de maiz realizado en Zamorano, \998.................................... ........... ..................... 43 3. An:ilisis de correlación (P«arson) entre concentración de ailatoxinus (ppb) y lus variables evaluadas en t:! ensayo para determinar la incidencia de aflatoxinas realizado en Zamorano, !998,.................... 44 L INTRODUCCIÓN 1.1 GEi\"'ERALIDADES En América Lntina, los granos constituyen u.n componente básico en la dieta de la mayoría de sus habitantes. Lns granos mayormente cultivados en estos paises son: maíz, sorgo, frijol, arroz y soya. &tos granos son la fuente principal de alimento de la ¡x1blación debido a que la mayoría de ésta no tiene acce~o n otros productos alimenticit>s. En Centro América, la dieta de un alto porcentaje de la poblaci6n t:5lá basada en el consumo principalmente de dos g:nmos hi~icos: el maiz y el frijol. En el c;¡su de Honduras, el mnlz rcpre:;enta la principal fuente de Cllrbohidratos en su dieta. Por esta razón la disponibilidad de este grano en el mercado juega un papel muy imponantc en la seguridad alimentaria del país. SegUn la FAO, durante 1998 en Honduras s.e cultil'l!Ion 390,000 ha de maíz produciéndose en cmal 619,136 ooneladas métricas, lo cual equivale al 82% de la producción total de ~os del pais. El maiz en Honduras es l.rtilizado principalmente para la ~tlimentación humana, la proporción destinada para alimentación animal es muy baja. Las condiciones de producción, cosecha y manejo postcoseha hacen al maíz un grano muy propenso a ser infectado por hongos que producen toxinas. Dado el alto consumo de este grano en nuestro pais, la población se eucuenlnt amenazada n con~umir en alguna medida cierta Cllrllidad de toxinas que pueden afectar su salud. La presencia de estas micotoxinas en los productos alimenticios depende de cepas es¡x.-clficas de hougos que están sujetas a factores ambientales como la humedad y la temp<:mrura (POSTCOSECHA, 1995). Los hoogos qwe produceu micoto:-..inas se encuentran en todo el mundo; aunque no haya presencia visible de hongos, ni cambios en el sabor. olor y aspecto del grano estos pueden estar contaminados. No todos los hongos producen micoto;>..inas, ni todos los gmnos comllminados con hongos son tóxicos. En la actualidad no existe .:n HondUTas ningün organismo ofici:al que regule los niveles de contamiu~ción de los granos que se encuentran en el mercado. Sin embargo, en Estados Unidos, la Agencia de Alimentos y Medicamentos (FDA), ha establecido límites máximos de aflatoxinas en los granos, 20 partes por billón (ppb) para conswno humano y 100 ppb pam conswuo animal. Se considera que lllla dosis de 400 ppb es mortal para el hombre {Bueso, 1998). 2 Actualim:me e.xisten diversos mérodos para detcctllr la presencia de micotoxinas en llls alimentos, estos pueden ,<:er me-todos presuntivos con luz ultravioleta, métodos semicuantitativos como EUSA (complejo antígeno-anticuerpo) y métodos cromatognHícos que son los más exactos pero toman más tiempo. Por el peligro que representan estas toxinas, se estima necesario realizar estudios de lo incidencia de aflato:>cinas en maíz en Honduras, para promover un mejor manejo postcosecha del grano y despertar el interés de desarrollar leyes fitosanitarias que velen por la seguridad de los consumidoD!S. Por esta razón es que se decidió reali7.;lf este tipo de estudio en Zamorano, para determinar la incidencia de aflaw.-.inas en la zona utili7.alldo las \~ .. ricdades Guayape y HB"104 que ~on las más utilizadas por los productores de la región. Zamorano e~ un productor importante de semilla de estas dos variedades. 1.2 OB.ffiTIVOS 1.2.1 Genenú Cuanrificur la incidencia de aflatoxinas en las variedades de malz Guayapc y HB-10-1- cultivadas <:n loslmes de producción de semilla y grano en Zamorano. 1.2.2 Especfficos l. Evaluar la inilu~ncia de los factores ambi<:ntnlcs y de manejo del cultivo en el cam¡x¡ después de madurez fisiológica que influyeron en la incidencia u., aflatoxinas. 2. Documentar los facmres de mant:jo postcostxha de gnmo a partir del roxibo Ud producto en la planta de procesamiento de semillas de Zamonmo. 3. Det.,rminar a partir de la cosecha Jos niveles de aflaro~ioas de las variedades do: ma!z Guaya pe y HB-104 a través de un método semicuantitulivo (Veratox). ----------------------------------------------------- ll. REVIS!ÓN DE LITERATUR.c\. 2.1 Definición de micoto:dnas El término micotoxina se deriva del las palabras griegas ''myke5n que significa hongos y ''toksikon~que significa veneno (FAO, 1991}. Las micotoxinas son metabriores del mismo. Las lesiones que penetran la capa aleurona son más problemMicas ya que C."\.-ponen eJ¡ejido del germen y el endospermo. Estas lesiones facilitan el de:;armllo principalmente d:: hongus de almacCn (Chelkowski, 1991). Los daños que se presentan cerca o alrededor del g~rmen son algunas veces más severos que los del cndospermo. La cosecha me('aniz:>da aumenta considerablemente el daño ocasionado al grano (Watson, 1997}. Este daño también puede dar.~e durante el procesamiento del gmoll, razón por la cual se debe calibrar regularmente el equipo para reducir al mínimo los daños ocasionados al "'"o 2.3 Prevención y control de m.icotoxinas 2.3.1 PreYención La mejor forma de controlar la presencia de micotoxinas en los grunos y concentrarlos para alimentación animal es prevt:nir que se formen, ya sea en el campo o dunmte el alnmcenamiento. Según Campos (1987), las medidas preventivas son las más eficaces para disminuir la contaminación de los alimentos con mieotoxinas. Los resultados de estas medidas no se notan inmediatamenk, p.: ro son e'~ dentes a laigo plazo. Las esporas de los hongos por estar ~n todas partes, al presentarse las condicione~ adecuada.~ para su desarrollo invaden el sustrato. Por esta razón es que las medidas preventivas tstán oricnm!Ws a evitar que estas condiciones fuvorabks se presenten. Según Jacobsen {1993) algunas medida.~ preventiva.~ son: • Destrucción de residuos de camno; Esto se hace pnra reducir el inoculo inicial de hongos mkotoxigénicos en el campo. ~ Reducir el daño mecinico: Se dehe ajustar bien el equipo de cosecha ( donde no sea manual) para reducir al máximo el daiio que este le caus:J al grano. Las rajaduras o fisuras son fueme de entrada para los hongos y ocasio= pérdidas enormes. Tambitn se debe ~1':itar secar el grano a altas temperaturas por un corto tiempo porque promueve la formación de rajaduras en el g:mno. • Cosecha en condiciones ambientaks favorables: Para lograr c.~to se puede adelanw o retrasar la época de siembra para lograr que el grano ~~a cosechado en la época seca. • Secar ~1 grano rápidamente: Por lo mt:nos a un 13.5% de humedad (llmilc mínimo para el desarrollo de hongos. lo ideal es !3%) lo mils rápido posible y no ,;.-.:cederse mils de 48 horas despu6; de cosechado. • Almacenar en e!>trllctura.s adecuadas: Que impidan la entrada de agua, insectos y ro~dor~s. Que sea hennético para poder hacer uso de plagui~idas. 2.3.2 Control Según Jacobsen (1993) entre las medidas de control que e:cisten actualmerrte encontramos las sigui emes: • Irradiación con ravos L'Uillma: Reck>JJ"tes C"-"Perimcnto~ han obtenido eliminación total de aflatoxina.s en granos, pero requieren dosis elevadas parm es considemdo principalmente Wl hongo de almacén, pero bajo condiciones adecuadas de hum~dad y temperntura pllede infectar el grano aun cuando este se eneuenrrc en el campo (FA O, 1982). r,:n el campo. Aspergillusj/m'll!i product: conidias amarillo-verdosas que funcionan como dispersoras y como inóculo infe<:tivo, así como tstructuras m.is duraderas llamadas esclerocios qll<' son dispt!rsados al suelo con la cosecha mecinica (Wicklow, 1991). Aspergil!Jis puede ser encontrado en el aire, en el suelo y en lo~ re:siduos dd cultivo arn.erior (Baird, 1995). El modelo de contaminación con Aspergtllu~ más aceptado comprende tres pasos principales: a) Contaminación con inoculo aéreo o trnnsmitido por insectos vectores. b) lvfazorca o granos dañados por insectos o pájaro~ ~t: contaminan al tener una v:ia de currada al grano. e) Factort:s culturales qut: c-dUSIIll estres a la planta, así como altllS tem¡x:ntturas que incremenw.n la susceptibilidad a la inf.:cción fungal (A.nderson, 1975). La sobrevivencia del ese!erocio fungoso está asociado con su abundante reserva nutricional y su habilidad para resistir esrres en el ambiente y resistencia al ataque microbiano (l.urnsden, 1981). En almacemomiento. Para que el hongo infecte el grano es necesario que el b'nlllO y/o el :unhiente presenten condiciones favorables para el hongo como ser 1u humedad dd grano, la bumetlad n:lativa y In temperatura. La remperntura puede ser variable pero debe existir humedad (Nyvali.I976). 2.4.4 Propkdndes La aflatoxinas presentan !luoreSJ:encia dependiendo de la to.>:ina involucrada (BJ, Gl, etc.)_ E~to nos permite realizar anáiÍ$ÍS preliminares Ue bajo costo como ser la prueba de ' luz uhraviolew.. Estas toXina!l son ligernmt:me solubles en agua (lO a :!O mgfml), son iruolubles ea solventes no polares, solubles en solventes mmkrndmnentc polares como el cloroformo y el metano! (Mimcha, 1980). Las aflatoxinas son inestables en presencia de bast:S. Los tratamientos con calor o coc\.':iones ptieden reducir los niveles de wxina en Jos alimentos p~ro !lQ la eliminan (Lillehoj y Wa!l, 1987). 2.4.5 Factare< que favorecen b producción de afl9tarina~ Existen ciertas condiciones que determinan la severidad de la contaminación del maíz Cllll aflaroxinns. Todas afectan directamente el crecimiento de A. jluvus que dCilpués produce aflatmdnas. Entre estoo factores se incluyen; El contenido de humedad del gnmo, la temperatura, daños Ilsicos, periodo de almacenamiento y dai\u por insecto. Según Nyvall (1976), un contenido de humedad inferior al 13% pre'\~enc la invasión por A. jltrvus sin importar el ri=po que se almacene. Si d contenido de humedad del [.!F.mo aumenta sobre este nivd, la incidencia y severidad de la invasión ineremcnia con la tempel1lllml y con el tiempo.A.jhll•uspuedc desarrollarse a bajos contenidos de humedad A mt:dida se desarrolla el hongo o cune respiración y la hl.ffiledod y el calor son liberados al ambiente que lo rodea provocando los llamados "focos de calor". A. jlavm; se desarrolla mejor a altas 1emperaturas. Las t~mperaturas bajas reducen su desarrollo pero no lo detient:n por oomplclO. La temperatura mfnima para la producci6n de aflatoxinas es de aproximadamente l2°C, la 6ptima 27°C y la máxima de 40°C (Mirocha, 1980). Se debe notar que las condiciones ambiemale.~ óptimas para el desarrollo del hongo son muy similares a las condicione~ necesarias para la producción de aflatoxinas pero no iguales. Cuadro l. Condiciones favorables ok humedad y temperatura para el d=rrollo de AspergiltusjfavtL~. El ti<:mpo de almacenamiento también juega un papel mu)' importante en el pmco:so de contaminación del g:r'.mU. El malz que va ser almacenado por un corto tiempo antes de ser procC5lldo puede ser almacenado ~un un conrenido de humedad superior al 13% }'a una tempo:nnura mayor que los lotes que permanecenin almacenados porYarlos meses o ai'ios. " 2.-!.6 Efectos tihicos en animale> Las uflawxinas producen un amplio número de efectos dañinos eu animales. El impacto ecunUmico de la reducción de la producti,~llad. incremento de la incidencia de enfermedades debido a la inmunosupresión, daños a órganos vitales e interferencias con la capacidad reproductiva es incluso ma.yor en algunos casos que la muerte debida a envcnenaruiemo (Jones, 1993). Según Jacobsen (1993), toda~ las especies animales son susceptibles de alguna manera a dailos causados por afla10xinas, aunque varia sensiblemente de una es)X'cie a otro. Por ejemplo las aves, pcccs, cerdos )' ganado ll't'hero apareman ser más susceptibles que el ganado vacuno para carne. En aves provoca problemas a los rÜ'iones y al hígado, problema de palas y huevos, así como mayor su.~ceplibilidad a coccidiosis. También puede llegar a suprimir por completo el sistema inm1.1nológico natural contra infecciones (Hesseltin~, 1977). Las ponedoras generalmente toleran niveles mfu; altos de oflatoxinas que las aves másjóven~ pem estos niveles siempre deben ser inferiores o 50 ppb. Se debe tener especial cuidado con grano con¡a¡r¡inado para alimentación de ponedoras yo qu~ los huevos se utilizan para alim~mación humana y se puede mmsmitir a tnwCs de la cadena alimenticia {Baird, 1995). Como regla general, aves en crecimiento no se deben alimentar con dieta:; que comengan má:i de 20 ppb. Sin embargo, alimentar ~Stas con niveles inferiores a 20 ppb p~.~ede todavía reducir su resistencia a enfermedades (Baird, 1995). En cerdos, las micotoxinas provocan r~ducciones en el consumo de alimento, pobre crecimiento y problemas en el sistema inmunológico. La aflatoxina Bl ha sido la mfu; estudiada ya que de 20 a 200 ppb provoca una reducción en el consumo de alimcn!O y por ende en el crecimiento. Esto p1.1ede ser aliviado adicionando nutrientes específicos a la dieta como ser lisina y metionina. En casos severos de intoxicación aguda (1000-5000 ppb) se puel.ien esperar consecuencias más graves que pueden causar incluso la m u ene de los animales (Jones, 1993). En el ganado, el alimento contaminado con atlatoxinas no solo reduce el rcndimicmo animal síno también su salud y crea un riesgo de transmitir w.;iduos de la toxina a la leche. La tasa de conversión de allatoxina B 1 a MI es de aproximadamente l% (Bueso, 1998). SegUn Jones (1993), No se debe alimentar ganado lechero con dictas que contengan más de 25 ppb. Este es un nivel con>ervadordebido a qu~: a) llay distribución l.lt:Suniforme de la toxina en la masa de grano y en la dieta. b) Existe incertidumbre en el métodlJ de anmsis. e) Puede existir más de un ingrediente que aporte la ll!xina. u 2.4.1 Efectos tíixicos en humanos La aflatoxinn Bl {la mlis abundante de los derivado~) es Ull carcinogénico, tcmtogénico y mutagénico, qut: por sus propiedades es considerado de principal importancia en la salud humana como animal {Mirocha, 19SO). En Ál'rica, India y Asia, el daño severo al bigado es comUn "ntre sus pobladores y se sospecha que es causudo por alimentos contaminados con hongos micotoxigénicos (ChristCIL'cn, 1976). Los manipuladores del ¡,>rano en las plantas de proce:>amiento deben usar mascarillas paia. protegerse del polvo de los granos ya qlli': se ha demostrado que este puede contener niveles altos de aflatoxina.s y que puL-de ser fatal ~¡ se ingiere o se inhala. Las perronas e:-.:puestas a grandes cantidades de polvo padecen de micotoxico~is pulmonar producida por la inhalación de hitll.s y esporas (Jacobsen, 1993). En Mé.xico y Guatemala se ha demostrado que en la prudua:ión de tortillas por procesos alcalinos (nixtamalización), se reduce inicialmente los niveles de aflatoxinas ¡JeTo al entrar en contacto con el medio ácido del esrómago, mucha de esta toxina se reg.:nera (Cam]Xls, 1987). :!Al! i\1 étod os de análi~i.~ de aflmo~inas Los métodos de análisis de aflatoxinas en los alüm:nlos puede dividirse en tres grupos principales: a) Presllltivos, b) Semieunntitativos, e) Cwmtitativos (Fiesen 1987; Wat.son, 1987). Actualmente se cuenta con diversos métodos para el análisis de af!atoxinas, se mencionnnin a continuación los más utilizados. 2.4.8.1 Luz ultnnioleta (PresuntiYo). Esta es una prueba presuntiva para la tklt:cción de aflatoxinns de muy bajo costo pero poco recomendada. Este método se basa err la inspección visual pare dctc<:tar si el grano presenta una fhmresccncia amarillo-verdosa. Esta puede observarse coloC11Udo la mucsua bajo una lw: ultravioleta de 365 nanómetros (nm) de longitud de onda. La fluorescencia del b'nlnO indica la posible presencia de A.pergillu.l"f/mtus pero no significa que eontengot la toxina (Nyvall, 1976). La fluorescencia es resultado de las propiedades dd dcido kójico que es otro compuesto producido por A. flm~r.s. y que no está relacionado direcmmente con las aflatoxinas. Las muestras que resulten positivas pueden contener cierta cantidml de to;;,.ina por lo que deben ser analizadas con mt\todos más precisos que nos indiquen su concemración (Tarr, ]996). 2.4.3.2 c~omatogn~fia de capa fina (TLC) (Cuautitativo). La tecnica es sencilla y relarivmnentc barata; consis-¡e en separar las toxina;; en placa.~ revestidas con gel de sílice mediante un frente de solvente migran te. La cuantificación se pued~ realizar mediante la comparación visual o den~iumétrica de la intensidad d!l los puntos f!uoresc~ntes de las ./">- ~~ (. ~(- •)_,._ •<., ''" ' ' "" '-;-, ,, . 'lb. '", ' . ·.-. ~ ... ,, . . '· .. ··,.-- "~-. -,..,. "'/-' ,,- -~4" ·~, ..... , sust:mcias dcsconoddas con una serie de modelos de ref~rcncia de concenrración conocida i.li~persos en In misma placa (Fiesen, 1987). Esta t&nica es un procedimiento d~< s~t.a es una técnica que puede ser utilizadas en todas pan~ (FAO, 1991). La formación del complejo antígeno-anticuerpo pu~de medirse indirectarnenk utilizando el antígeno marcado con enzimas de competencias. La cantidad de enzima es una medida de la cantidad del compkjo antigeno-onticucrpo. Este metodo utiliza una me7.cla de metano! y agua para realizar las cxlrncciones de las mucsuas de grano molido. Los extrJ.ctos finales que se utilizan para los ensayos son soluciones acuosas. Los limites de detección de los procedimientos son lo suficientemente bajos como pam hacer determinaciones de los niveles de tulemncfa (FA O, 1991 ). Estos ensayos inmunoquimicos selectivamente "atracan el compuesto de interes. permitiendo la eliminación de impure?.as o sustancias que interfieran ¡x¡r medio de lavados y son menos sensitivos a las impurt.:tracción previamente desinfectada con cloro al 70%. Se colocaron de 4 a 6 granos por pililo, desinfectados con una solución de cloro al 1% por 5 SCb'UOdos para evitar el crccimit:nto de organismos no presentes en el g:nmu. La transferencia se realizó frente a un m~-chero para evitar la Cllntaminación del cu!üvo. Los platos fueron ~ellados con papel parafina y colocados en una ciunam de crccimien¡o a25-27"C por tres días para facilitare! desarrollo de los hongos. 3.3 f'ARÁMETROS EVALUADOS EN LAS MUESTRAS 3.3.1 Humedad La humedad se determinó en todos los periodos (.]e muestreo, ya que esta representa uno de los fuctores m:i.s influyen¡cs sobre el desarrollo de hongos y por consiguieme en la producción de allatuxinas. Esta se determinó utilizando un medidor de humedad Moto meo 919. El procl-dimierrro consiste en pesar 250 g de muestra (maiz) y colocarla en d vaso recolector. El aparato se calibra a una lectura de 53 (par"ancia Figura l. Curva de regresión para transformar absorbancia a concentrnción de aflatoxiuas. El Veratox no determina directamente la com:errtraóón de aflatoxinas; la lectura que reali7.a es en unidades ópticas que por medio de la curva de regresión pueden ser transformadas a concenl.rnciún en ppb. Estas unidades ópticas son determinadas a rravés de la lectura de los controles proporcionados en el kit de reactivos (0, 5, 15, 50 ppb). Esto limita el análisis a determinar concentraciones dentro de este rango únicamente. El Veratox provee UIJ valor "r" qut: nos determina que tanto se ajusta el modelo a la absorbancia Este valor debe ser superior a r~ ..0.98 para que el análisis sea válido. 19 3.6 MATERIALES Y EQUIPO UTIL17.ADO i\lateriales: Semilla de llllliz Guayape y Htl-104, tamices {malla# 20), bolsas plásticas, reactivos (mdanol, NaNO}), pipetas, papel toalla, plaros pctri, marcadores, kit de reactivos para V eratox. Equipo : Medidor de humedad (Motomco 919), termómetro, divisor/homog~n~i:.ador Boemer, medidor de peso Bushel, molino o laburatorio, muestreadores alveolares, Verato.". 3.7 Al\'ALISIS ESTADISTICO hidrómetro, licuadow de Para el análisis esradlstico se utilizó el paquete "Statistical Analysis System" (SAS®) versión 6.12, realizando un anlilisis de varianza y una separación de medias Cfukey) para cada una de l!!S variables. Se utilizo este paquete para reali:1.ar un estudio de las correlaciones exiskntes entre: Humedad vrs. conc~mrnción de aflatoxinas Durt:za vrs. concentración de aflatox:inas Densidad vr:s. concenunción de aflatoxinas Daño mecánico vrs. concentracil!n de allatoxiaas Dailo por~ctos vrs. coucerrtración de afla1o:cinas Daiio por hongos vrs. concentración de aflawxinas En el modelo se evaluaron las do~ v-.ui~dades (Guaya:pe y HB-104) s~ realizaron tres mue..~treos con tres repeticiones cada uno. IV RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los datos recolectados fueron anali7__arlas en forma separada para cada variable. 4.1 CONTE:r-.'IDO DE HU.I\lEDAD El modelo utilizado fue altamente significativo para la variable humedad en los seis lotes donde se llevó a cabo la evaluación {P > 0.0001). Las medias obten.idas nos indican que en términos generales, no existió diferencia significativa entre la humedad de los Jotes {Cuadro 4). No se encontraron diferencias significativas con un alfa de 0.05 entre las repeticiones, lo que indica que las variables se comporta.Ion dt: una manera uniforme a lo largo del ensayu. En Zavala se encontró la media de contenido de humedad mi~ alta con 16.95%, con un CV de 5.1% y un R2 de 0.98 {Anexo 2). La media más baja se reportó en la Vega 5 de Monte Redondo {Cuadro 4). Las medias obtenidas oos indican que no existió diferencia significativa para la variable humedad con respecto a los lotes de producción .. Cuadro 4. Porcentaje de humedad del grano encontrada para lotes de producción, variedad y etapa de muestreo en estudio realizado para determinar la incidencia de aflatoxinas en dos variedades de maiz en Zamorano, 1998. *Medias con Not:a:J Medias 00 Según la comparación de medias utilizando la prueba Tukey a un alfa de 0.05, la humedad a cosecha se vió reducida de 25.98% a 12.60% durante el secado {Cuadro 5). Es\o concuerda con lo eA-pr=do por Jacobsen (1993) que indica que la humedad del grano debe ser reducida lo más pronto posible a un 13% para poder brindarle al gnmo un almacenamiento seguro y reducir al mismo tiempo el desarrollo de hongos que puedan causar daños al grano e incluso producir aflatoxinas. Se presentó una pequeña variación entre la humedad despues del secado y la de almacenamiento, posJblememe debido a 21 que el grano de maiz es muy higroscópico y toma o libera humedad al ambiente. Sin embargo, esta diferencia no fue significativa En las variedades evaluadas no se presentó ninguna difer=ia significativa para la humedad (Cuadro 4), ya que estás se comportaron de una manera muy similar debido a que el manejo que se les dio l1.1ego de la cosecha fue el mismo, La humedad a cosecha no presentó mayores variaciones eutre lotes y por ende entre variedades. La humedad presentó una correlación positiva de 0.904 c{)n relación a la concentración de aflatoxinas encontrada en los granos con una P> 0.0001 (Anexo 3). Esto nos indica que a medida se in<;rementa el contenido de hUIDedad en el grano, se produce una mayor concentración de aflatoxinas. La humedad es uno de los factores que está más relacionado mnto con el desarrullo de hongos como con la producción de aflaioxinas por ~ios hongos. La concentración de aflatoxinas se ve afectada por la humedad hasta un cierto punto ya que, contenidos de burnedad inferiores a 13.5% inhlben el crecimiento de hongo. Pero contenidos de humedad superiores a 20-25% también afectan el desarrollo de hongos en el grano. Por esta razón, es que la humedad del grano debe ser reducida lo más pronto posible a por lo menos un 13%. Asl evitamos que el grano sea e;,.-puesto a condiciones de humedad favorables para la infección y desarrollo de hDngos que se pueda presentar tmto en el campo como en el almacén. La humedad relativa encontrada en el campo y luego de la cosecha pudo haber favorecido d desarrollo de hongos en las mazorcas. ya que éstas variaban uniformemente entre los 75 y 85 % {humedad relativa adecuada para el desarrollo de hongos y producción de toxinas). Sin embargo, el exceso de humedad encontrado en el campo debido a las altas precipitaciones de finales de odubre e inicios de noviembre (Anexo 1), tiempo en que algunos lotes debieron ser cosechados, retrasaron la cm;echa porque los contenidos de humedad en el grano eran muy elevados. Este tiempo adicional en el campo pudo haber favorecido el desarrollo de hongos que afectaran la mazorca hasta su cosecha 4.1 DUREZA DEL GRANO Pan~ esta variable se encontraron diferencias altamente significativas entre muestreos (P :> 0.0001) al igual que entre los lotes (P :> 0.0025) OOnde se llevó acabo el ensayo, Jo mismo que entre las variedades con un alfa de 5%, un R' de 0.66 y un CV de 14.85%. La media más alta de flotadores para esta variable se eucorrtró en la Vega 6 de Monte Redundo con 58.33%, mientras que las más bajas se encontraron en Zavala y San Nicolás con 46.89 y 45.78, respectivamente (Cuadro 5). Cuadro S. Porcentaje de granos flotadores en NaN03 encontrados por lote de producción, variedad y etapa de muestreo en estudio realizado en Zamorano para determinar la incidencia de aflatoxinas en las variedades Guayape y HB-104, 1998. *'Medias OO•o ¡¡;;¡¡ Nota: letras x,y,z utilizadas para denotar diferencias entre muestreos; a, b y e para diferencias entre lotes y variedades. Entre los muestreos las diferencias fueron muy marcadas presenúindose la mayor cantidad de flotadores a cosecha con 6!.22% y la menar en almacenamiento de 41.72% (Cuadro 5). Según Watson (1987) esto se debe a que la dureza también está directamente relacionada con el contenido de humedad del grana ya que el agua tiene una menor densidad que el grano. Por esta razón se ili:ben realizar las pruebas de dureza a granos con contenidos de humedad similares para evitar que existan fluctuaciones debido a la humedad. En general la variedad HB-104 mo~tró el mayor número de flotadores (54.30"/o) indicando que presenta una consistencia más suave que la variedad Guayape con 46.27'/o de flotadores (Cuadro 5). Esta es una de las principales razones para que exista diferencia entre los diferenteS lotes de producción. La dureza del grano está directamente relacionada con la composición del grano, esto se refiere a que el grano presente endospermo harinoso o corneo. Así, los granos que contengan endosperroo harin050 son más propensos a la flotación. En el= de la variedad HB-104 se considera una flotación intermedia considerándose el grano de consistencia dentada. Otro factor que puede influir en la dureza es el grosor del pericarpio y la estructura de la célula en sí. Esta variable mostró una correlación positiva con un R2 de 0.6& con una p-.>Q.OOOl. La correlación se interpreta en qlle a mayor número de Hotadores la concentración de aflatoxinas en el grano tiende a aumentar dada su estrecha relación con la humedad. Según Watson (1987), la dureza es una caracterlstica intrlnsica del grano que puede ser modificada por condiciones de manejo post:cosecha. La dureza intrinsica del grano puede ser disminuida por un secado inadecuado del grano. Esto provoca fisuras internas en el grano que promueven la quebradura de los granos con mayor facilidad. Si el secado es realizado de manera adecuada estos problemas pueden reducirse sin afectar la calidad final del grano para Jos detenninados usos que se le den. 4.3DENSTDAD APAREi'I'TE La d~nsid:!d aparente de los granos fue determinada a través del peso bushel. El modelo no fue si¡;niflcativo para la variable densidad (P>O.l16) tenlendo un R 0.26 y un CV de 3.13% a un alfa de 5%. La única diferencia <:-ncontrada con una P>0.06 se dio entre los mu~treos donde la media de cosecha fue 59.24 lbibushel y In de secado con 57.54 lblbushel {Cuadro 6). Las variaciones no son muy acentuadas pt:ro concuerdan con lo exprL-sado pm Watson (1987) que indica que la humedad del grano afecta muchos factores como en este caso In densidad, ya que a 10% de C{)ntcnido de humedad del grano la dc!lSidad aparente es de 58% de la densidad re~~l del grano, y a 25% d.: humedad la densidad aparente es 54%. Según Chrütcnsen (1969) se puede L'Sperar que un grano híunedo tenga un mayor peso bushel que un grano seco. Cuadro ó. Densidad aparente (lblbushcl) del grnno encontrada por lote de producción, variedad y t1.apa de muestreo en L"Studio realizado en Zamorano para determinar la incidencia de aflatoxinas en dos variedades de mafz, 1998. "'Medias con 1 1 Nota: letras x, y, z pail! d¡mo\ar diH:n:ncias entre muestreos; a. b y e para diferencias entre lotes y variedades. Podemos afirmar que para los proPiisiws de t'Sie estudio la densidad aparente del grano 110 foc una medida importante en la incidencia de atlatoxinas, si no más bien otro factor que es afectado por la humedad del grnno que si tiene influencia directa en Jn rroducción de aflatoxinas. La densidad no se pudo correlacionar por no ajustarse al modelo utilizado y para el daño mecánico se obruvo un valor poco representativo que indicaba una correlaci(m negativa entre esm y la co!lccn!rnción de atlatoxinas debido a que la cosecha se realizó en forma manual. Por esta razón los daños a cosecha resultaron ser mlnimos en comparación cnn los daños presentes lllnto al se~ corno en el almacenamientu. E~10 nos indica que In reducción de la conccntrnción de aflatoxinas en los granos se debieron a otros factores mi~ relacionados y no 'fl.l porcentaje d~ da:r1o mecánico preserrte en cada ~tapa. 24 4.4 DARO MECA.NICO El modelo fue altamente significativo para esta variable (P > 0.0001), con un R2 de 0.72 y un CV de 11.78 (Ane.'m 2). Se encontraron diferencias altamente significativas entre lotes (P > 0,0002) y entre muestreos (P > 0.0001) a un alfa de 5%, y las variedades no presentaron ninguna diferencia significativa. La media más alta se en:contró en la terraut 5 de San Nicolás con 23.33% de daño mecánico (Cuadro 7), las mis bajas se dieron en Zavala y Sta Inés con medias de 18.67 y 17.89, respectivamente. El comportamiento de los otros lotes fue muy similar existiendo variaciones minimas. Cuadro 7. Porcentaje de daño mecánico encontrado por lotes de producción, variedad y etapa de muestreo en estudio realizado en Zamorano para determinar la incidencia de aflatoxinas en dos variedades de maíz:, 1998 . • Nota: letras x, z 'J diferencias entre ' • En general los lotes que presentaron mayor daño mecánico fueron los lotes de Monte Redondo, esto se puede atribuir a que la variedad HB-104 es más suave que Guayape y por consiguiente es más susceptible a este tipo de daño. Con respecto a la etapa del muestreo se encontraron diferencias únicamente entre cosecha y secado (16.39 y 23.22%, respectivamente). La cosecha presentó un menor porcentaje debido a que esta en la mayoría de los casos se realizó manualmente (los muestreos fueron todos realizados manualmente). El mayor porcemaje de daño lo presento la etapa de secado (Cuadro 7); esto se debe a qwl antes de realizar lus mtreS!reos, las mazorcas se sometieron a un desgrane mec11nizado cuando el contenido de hwnedad se había reducido. El porcentaje encontrado después del secado se redujo a un 2121% ya que antes de almacenarlo se sometió a una selección y limpie:>..a en la que se eliminó parte de los granos dañados en aproximadamente l %, La correlación entre dailo mecánico y CQUcentración de aflatoxinas resultó altamente significativa indicando una correlación negatiwt; sin embargo, este dato no debe tomarse en cuenta debido a que nos indica que a mayor dailo mecánico existe una menor concentración de aflatoxinas. Este resultado se debe principalmente a que la CQ!lcentración de aflatoxinas encontradas a cosecha fueron mayores que las que se =nrrtraron en almacenamiento y secado; pero en realidad la disminución de la conct:ntración de aflatoxinas se debió a otros factores que afectan directamente la COJJcentmción corno son humedad y daño por hongos. El daño al pericarpio puede ser Unicamente superficial penetrando (micamente las capas superiores del mismo. Watson (1987} encontró que los daños ocasionados al grano incrementan notablemente después del desgrane y secado, Estos daños se dan principalmente por los golpes que recibe el grano durante la cosecha mecánica y desgrane. Y también ocasionados por la temperatura de secado que se utiliza así como el tiempo que se destine para esta práctica (secado). El daño mecánico no tuvo mayor influencia en la conce=ación de aflatoxinas ya que se espt:raba que a mayor daño mecánico se facilitara la infección fungal y por ende la producción de ailatoxinas; sin embargo, esto no sucedió ya que el desarrollo de los hongos se vio afectado por otros factores como ser la reducción del contenido de humedad a un nivel seguro de almacenamiento (13%) y a la selección de los granos. 4.5 DAÑO POR INSECTOS El modelo resultó altamente significativo para esta variable (P:>O.OOOl) con un R' cuadrado de 0.912. Se encontró diferencia altamente significativa para los lotes de producción con una pmbabilidad de 0.0001 y para los muestreos una P>O.OO}. Las variedades no presentaron diferencias significativas. Sta. Inés reportó las medias más altas para esta variable con un 5.22% de daño y la media más baja se encontró en San Nicolás donde el porcentaje de dano fue de apenas 1.39%, Las Vegas de Monte Redondo no mostraron diferencias significativas en cuanto al resto de los lotes al igual que Zavala (Cuadro 8). Estas diferencias se atribuyen principalmente a la localidad donde se encontraba cada lote, ya que se puedt: apreciar que las Vegas de Monte Redondo sufrieron un daño bastante uniforme al igual que Sta. Inés y Zavala que son lotes que se encuentran adyacentes y por Jo tanto no presentaron diferencias significativas. Sin embargo, San Nicol O.OOOL Este coeficiente nos indica que esta variable está muy ligada a la concentración de aflatoxinas. Los insectos encontrados en los granos pueden ocasionar muchas pérdidas tanto por los daños que causan directamente a los granos como por los daños indirectos que provocan Algunos de estos daños incluyen la posibilidad de facilitarle la entrada a otros organismos considerados como plagas secundarias que no pueden causar daños directos al grano. Además facilitan la contaminación de Jos granos con hongos. Los insectos son vectores de A. jlavus entre orros, siendo capaces de transportar el hongo de on Jugar a otro en su exoesqueleto. Los insectos de los granos almacenados tiene la capacidad de elevar lu temperatura en las masas de grano debido as u alta pruliÜ:ffi(..-:iún y actividad metabólica Sta. Inés fue el Jote que presentó en promedio mayor daño por insectos y podemos apreciar que coincide con la concentración más alta de ailalox.irms encontmdas en los lotes de producción (Cuadro S). De igual manera se puede comparar el lote de San Nicolás que presentó los menores daños por insectos y también las menores concentraciones de aflatox.inas. 27 4.6 DAJ'i'O POR HONGOS El daDo por hongos t:S una variable mu}' importante para determinar la posible presencia de las toxinas en el grano. Sin embargo, como e..'\plicamos amerionnente, la presencia de hongos en los granos no significa necesariameme que e: 0.0002). Los lotes de producción que se vieron más afuctados por el ataque de hongos en general fueron )'ltn. lmls y San Nicolás (8.0% de daño). Los menos afectados de Jos lot~ fueron los de las Ve~as 2 y 3 de Monte Redondo que obtuvieron Uil promedio de 3.78% de daño (Cuadro 9). Cuadro 9. Porcentaje de dan o por hongos encontrado por lote de producción, variedad y muestreo en estudio rcalizudo en Zamorano para determinar la incidencia de aflatoxinas en dos variedades de muir., 199S. • Medias con Nota: letras x, y, z: para denotar diferencias emrc [()les y variedades. En el caso de Sta. Inés y Zavala, el daño por hongos pudo haber sido influenciado por la incidencia de mayor dai)o por in.'>ectos, que contribuyeron a f 0.0001. Se sabe que los hongos pueden estar presentes en el grano y no producir la toxina pero al estar presences nos da una mayor probabilidad de incidencia. Esta correlación nos indica que a mayor daño por bongos mayor concentración de aflatoxinas en la nmestra. Los granos normal mente se encuentran infectados por más de un hongo que pueden producir diferentes to>..ina~. 4. 7 CONCE.l\'TRACIÓN DE AFLATOXINAS (en pph) La concentración de aflatoxinas se encontró altmnente significativa paro los lotes así como para los muestreos (P >0.0001 ). Entre las variedades no se percibieron diferencias. Los lotes de Sta. In6s y Zavala fueron en promedio los que presentaron mayor incidencia de aflatoxinas (>a 3.0 ppb). Sn. Nicolás fue el lote que presentó menor incidencia con un promedio de 1.1 ppb, a pesar de ser el lote que preserrtó el mayor porcerrtaje de daño por hongos (Cuadro 10). Los lotes de Monte Redondo presentaron un comportamiento muy similar conteniendo en promedio menos de 2_6 ppb_ 29 Cuadro JO. Concentración (ppb) de aflatmdnas eJXOutrada por lote de producción, variedad y muestreo en esrndio realizado en Zamorano para determinar la incidencia de aflatoxinas en dos variedades de maíz, 1998. *Medias con j Nota: letras x, y, z para denotar diferencias entre muestreos; a, b y e parn diferencias entre lotes y variedades. Durante la cosecha se reportó la mayor concc=acJOn de aflato;.._inas llegando a promediar 5.22 ppb. En el almacenamiento se logró reducir la concentración a niveles muy bajos (cuadro 10). En algunos casos después del secado se realizó una seg~.~nda selección del grano junto con una limpieza que red\!io aun más los niveles de aflatoxinas encontrados. Estos niveles de aflatoxinas encontrados no oon niveles alarmantes, pero no todos los productores practican la selección de los granos; por "ganar un poco más" dejan mucho grrmo infectado que dependiendo de las condiciones de almacenamiento o el manejo posterior que se le de puede ocasionar pérdidas enormes. Es importarrte la creación de l.lll organismo oficial que regule la confllmimción de los granos que son destinados tanto para el consumo humano y animal, ya que muchas instituciones encargadas del almacenamiento y procesamiento de gnmos no toman las medidas necesarias para evitar que estos problemas se presenten en sus instalaciones. 4.8 CONDICIONES CLIMÁTICAS ENCONTRA-DAS EN ZAMORANO DURANTE LA REALIZACIÓN DEL Er-."SAYO. La precipitación en Zamorano dmante Jos meses en q(l(l se llevó a cabo el ensayo fue muy variable entre los meses. Los meses que se incluyeron en el estudio fueron de agosto a diciembre de 1998 y enero de 1999, que fueron los meses que de alguna == pudieron afecmrcl gnmo tanto en el campo como a comienzos del almacenamiento. La precipitación más alta se dio en el mes de octubre,. llegando a los 595.79 mm (Figura 2). Esto se debió a las infl~cias del desastre natural (!Ylitch) que azotara a ouestro país durante finales de octubre y principios de noviembre. La precipitación más baja se 30 encontró en los meses de diciembre y enero las cuales no superaron los 17 mm. Durante octubre las lluvias se distribuyeron muy bien a lo largo del mes; sin embargo, 1a precipitación más alta se reportó el día 31 con 133.6 mm (Anexo 1). El primero de noviembre se reportaron 155.60 mm de precipitación, siendo esta la más alta de todos los meses, también ocasionada por el huracán "!vlitch". Precipitación mensual en Zamorano 1998-1 S99 700!~~~tlii~~~~~~ • 600 ~ 500 .j 4CC iooof':7i7 ' 12oo 100 o Ago"" Octubre M~~e~ Diciembre Figura 2. Precipitación mensual encontrada en Zamo,l'>lllo de agosto 1993 a enero 1999 La humedad relativa es un factor muy importante para calcular e! tiempo de secado que se le debe dar a un gmno y para deterruinar- el contenido de humedad en el grano necesario para un almacenamiento seguro del grano. La lrumedad relativa también tiene mucha influencia en el desarrollo de hongos y en la producdón de toxinas. La humedad relativa tuvo menos variaciones q_ue la precipitación. Sin embargo la más alta se reportó en el mes de octubre debido a que fue en este mes donde se encontró la mayor precipitación (Figura 3). En el mes de agosto se reportó la humedad relativa más baja (72.39 %) debido a la escasa precipitación encontmda en es:te mes. 31 Humedad relativa en Zamorano 1998-1999 Figura 3. Humedad relativa encontrada en Zamorano de agosto 1998 a enero 1999 Las temperaturas miximao y mínimas no variaron a través de los meoeo encontrándose en promedio aproximadamente 28QC para la mixima y 18"C para la mínima (Anexo 1). V. CONCLUSlONES l. No existió diferencia en relación a la incidencia y concentración de aflatoxinas entre las variedades HH 104 y Guayape. 2. La concentración de aflatoxinas correlacionó positivamente con la humedad, durv.a, dai1o por in5ectu5 y daño por hongos. 3. Ln densidad aparente fue igual para ambas variedades y no ti~ne int1uencia sobre la concentración de afluto:dnas y su variación durante los muestreos est:i relacionada con el contenido de hmnedad. ~- La ~elección de los ¡,:ranos antes del secado y la rcd1.1cción del contenido de humedad a l3% disminuyen nut~blcmente la incidencia de ailatoxinas y proporcionan un almacenamiento seguro. 5. El mano:jo postcosechu (selección, secado, desgrane, almacenamiento, etc.) del gr-ea de.o;tinadn para alimentación humnna o animal. 6. Realizar un estudio posterior para evaluar la incidencia de otras micotoxinas en el grano de mafz. VII. BIBLIOGRt-\FÍA ANDERSON, H.W. 1975. Aflato:-cin wnmmimuion of wm in the fiel d. J. Agric. Food Chem. 23: 775" 782. BATRD, RE. 1995. Corn rnycoto:-cins. Georgia Suue University Cooperdtive E:,."l.ension Serviec. Georgia, Estados Unidos. SEFP. 26 p. BUESO, F.J. 1998. Micmoxinas en granos para la alimentación humana y animal. Folleto de módulo de Te~nologla de Alimentos. Escuela Agrfcola Panamericana. Honduras. ll p. CAMPOS, M. 1YS7. Relación entre m.iwtoxinas y alimentación en los paises en Desarrollo. 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