Evaluación de la encapsulación de fitoesteroles de palma africana (Elaeis guineensis) utilizando diferentes concentraciones de gelatina, maltodextrina y relaciones de acetona: agua Aryeri Stephanie Bardales Castellanos Javier Alfredo Alemán Martínez Escuela Agrícola Panamericana, Zamorano Honduras Noviembre, 2020 i ZAMORANO CARRERA DE AGROINDUSTRIA ALIMENTARIA PORTADILLA Evaluación de la encapsulación de fitoesteroles de palma africana (Elaeis guineensis) utilizando diferentes concentraciones de gelatina, maltodextrina y relaciones de acetona: agua Proyecto especial de graduación presentado como requisito parcial para optar al título de Ingenieros en Agroindustria Alimentaria en el Grado Académico de Licenciatura Presentado por Aryeri Stephanie Bardales Castellanos Javier Alfredo Alemán Martínez Zamorano, Honduras Noviembre, 2020 iii Evaluación de la encapsulación de fitoesteroles de palma africana (Elaeis guineensis) utilizando diferentes concentraciones de gelatina, maltodextrina y relaciones de acetona: agua Aryeri Stephanie Bardales Castellanos Javier Alfredo Alemán Martínez Resumen. La encapsulación de compuestos bioactivos con baja solubilidad acuosa se encuentra en auge. En el caso de los fitoesteroles, se han realizado diversos esfuerzos para mejorar su solubilidad en agua y su bioaccesibilidad. Debido a esto, en el presente estudio se utilizó diferentes concentraciones de maltodextrina (5 y 10%), gelatina (30 y 40 mg/mL) y relaciones acetona: agua (1:1, 1.5:1, y 2:1) para la encapsulación de fitoesteroles. Para ello, se utilizó la técnica de nanoprecipitación o coacervación simple. Los parámetros evaluados fueron, actividad de agua (aw), porcentaje de solubilidad en agua, eficiencia de encapsulación (E.E.), capacidad de carga (C.C.), tamaño y morfología de las partículas. Se empleó un Diseño Completamente al Azar (DCA) para el análisis de las variables. Se obtuvo diferencias significativas (P < 0.05) para las variables evaluadas, y se encontró que el porcentaje de maltodextrina tuvo un efecto significativo (P < 0.05) sobre la aw, C.C. y porcentaje de solubilidad en agua de las microcápsulas. Por otro lado, la concentración de proteína tuvo un efecto significativo (P < 0.05) sobre porcentaje de solubilidad y tamaño de partícula. Asimismo, la relación acetona: agua tuvo un efecto significativo (P < 0.05) sobre las variables E.E. y tamaño de partícula. Se determinó la presencia de partículas amorfas multipared en el rango de 40-60 μm para todos los tratamientos. Se logró encapsular y mejorar la solubilidad en agua de los fitoesteroles utilizando biopolímeros de grado alimenticio como la gelatina y maltodextrina. Palabras clave: Capacidad de carga, multipared, nanoprecipitación, solubilidad. Abstract. The encapsulation of bioactive compounds with low aqueous solubility is in high demand. In the case of phytosterols, various efforts have been made to improve their solubility in water and their bioaccessibility. As a result, in the present study different concentrations of maltodextrin (5 and 10%), gelatin (30 and 40 mg/mL) and acetone: water ratios (1:1, 1.5:1 and 2:1) were used for the encapsulation of phytosterols. The technique of nanoprecipitation or simple coacervation was used. The parameters evaluated were, water activity (aw), percentage of solubility in water, encapsulation efficiency (E.E.), loading capacity (L.C.), size and morphology of the particles. A Completely Randomized Design (DCA) was used for the analysis of the variables. Significant differences (P < 0.05) were found for the evaluated variables, and it was found that the percentage of maltodextrin had a significant effect (P < 0.05) on aw, C.C. and percentage of solubility in water of the microcapsules. On the other hand, protein concentration had a significant effect (P < 0.05) on solubility percentage and particle size. Similarly, acetone: water ratio had a significant effect (P < 0.05) on the E.E. and particle size. The presence of multi- wall amorphous particles in the range of 40-60 µm was determined for all treatments. It was possible to encapsulate and improve the water solubility of phytosterols using food-grade biopolymers such as gelatin and maltodextrin. Key words: Loading capacity, multi-wall, nanoprecipitation, solubility. iv ÍNDICE GENERAL Portadilla ............................................................................................................................ i Página de firmas…………………………………………………………………………. ii Resumen .............................................................................................................................. iii Índice General .................................................................................................................... iv Índice de Cuadros, Figuras y Anexos……………………………………………………. v 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 1 2. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................ 3 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...................................................................................... 8 4. CONCLUSIONES ............................................................................................................ 19 5. RECOMENDACIONES .................................................................................................. 20 6. LITERATURA CITADA ................................................................................................ 21 7. ANEXOS ........................................................................................................................... 25 v ÍNDICE DE CUADROS, FIGURAS Y ANEXOS Cuadros Página 1. Formulación para elaboración de encapsulados, según tratamientos establecidos. ........ 4 2. Condiciones de uso del secador por aspersión. ............................................................... 5 3. Tiempos de retención y concentración en porcentaje (%) de esteroles y estanoles encontrados en la muestra de concentrado utilizado en el presente estudio. .................. 9 4. Actividad de agua de promedio de los diferentes tratamientos y separación Duncan por tratamiento. ...................................................................................................................... 10 5. Probabilidades obtenidas en el análisis de varianza de la actividad de agua de las partículas. ........................................................................................................................ 10 6. Porcentaje de solubilidad promedio para los diferentes tratamientos y separación Duncan por tratamiento ................................................................................................... 11 7. Probabilidades obtenidas en el Análisis de varianza para el porcentaje de solubilidad (%) en agua de las partículas. .......................................................................................... 12 8. Tamaño promedio de partícula (μm) para los diferentes tratamientos y separación Duncan por tratamiento. .................................................................................................. 14 9. Probabilidades obtenidas en el Análisis de varianza para el tamaño de partícula (μm) de las partículas. .............................................................................................................. 14 10. Efecto de relación disolvente: agua sobre el tamaño promedio de partícula (μm) de fitoesteroles encapsulados y separación de medias Duncan para relación acetona agua. 15 11. Porcentaje de encapsulación promedio para los diferentes tratamientos y separación de medias Duncan por tratamiento. ...................................................................................... 16 12. Probabilidades obtenidas en el Análisis de varianza para la eficiencia de encapsulación (%) de las partículas. ....................................................................................................... 17 13. Capacidad de carga promedio para los diferentes tratamientos y separación de medias Duncan por tratamiento. .................................................................................................. 17 14. Probabilidades obtenidas en el Análisis de varianza para la capacidad de carga (mg/g) de las partículas. .............................................................................................................. 18 Figuras Página 1. Flujo de proceso de elaboración de encapsulados con fitoesteroles ............................... 4 2. Cromatograma obtenido de la muestra de concentrado de fitoesteroles. ........................ 8 3. Imágenes tomadas por microscopio Mshot MI11 óptico invertido, con un aumento de 400X ................................................................................................................................ 9 Anexos Página 1. Análisis de varianza de actividad de agua. ...................................................................... 25 2. Análisis de varianza para porcentaje de solubilidad (%) en agua ................................... 25 3. Análisis de varianza para tamaño de partícula ................................................................ 26 4. Análisis de varianza para capacidad de carga. ................................................................ 26 5. Análisis de varianza para eficiencia de encapsulación. ................................................... 26 1 1. INTRODUCCIÓN Actualmente los alimentos funcionales están en auge no solo por sus propiedades nutricionales sino también por sus funciones específicas. Las tendencias mundiales en alimentación humana señalan que existe un gran interés por parte de los consumidores hacia algunos alimentos qué además de dar un aporte nutritivo brindan otros beneficios a las funciones biológicas y fisiológicas del organismo (Jesch y Carr 2017). Existe un continuo desarrollo de nuevos productos alimenticios designados como funcionales. Estos tienen efectos benéficos para la salud de los consumidores con problemas de colesterol, hipertensión y otras enfermedades cardiovasculares (ECV). La ingesta de colesterol puede variar desde 250 hasta 500 mg/día aproximadamente, además, el 95-98% del colesterol que se ingiere se encuentra esterificado con ácidos grasos como: ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico y, en menor proporción, ácido linoleico (Martin-Aragón y Marcos 2008). Esto representa un problema de gran magnitud ya que a nivel mundial los porcentajes más altos de muerte se deben a las enfermedades cardiovasculares (ECV), más del 80% de las muertes se atribuyen en mucha mayor medida a los países de bajos recursos o bajos ingresos esto según los datos de la Organización Mundial de la Salud (OMS 2020). Algunos de los principales productos buscados son aquellos bajos en grasa debido a los altos índices de obesidad. En el tratamiento de estas afecciones, el control de las dietas y adición de compuestos bioactivos a matrices alimenticias cumple una función de controlar los niveles de colesterol dentro de los cuales se encuentran los fitoesteroles (Jesch y Carr 2017). Los fitoesteroles son compuestos con estructura y funcionalidad similares al colesterol, conforman una parte esencial de las membranas de la pared celular de las plantas. Estos compuestos análogos del colesterol son derivados exclusivamente de plantas. Definidos como Generalmente Aceptados como Seguros (GRAS, por sus siglas en inglés) son conocidos como lípidos funcionales que aportan beneficios a la salud (Di Battista et al. 2018). La encapsulación de compuestos consiste en cubrir partículas de interés a través del uso de una capa protectora que permita que el material encapsulado sea gradualmente disuelto bajo condiciones controladas (Calvo et al. 2010). Esta capa protectora actúa como una barrera entre el compuesto de interés y la matriz alimentaria. En este sentido, la capa permite que cualidades del compuesto como su textura arenosa e insolubilidad en agua sean oprimidas (Izadi et al. 2012). Debido a esto, el tipo de barrera a utilizar influye en la solubilidad del compuesto en agua, el cual se relaciona directamente con su biodisponibilidad en la administración oral (Hecq et al. 2005). Un ejemplo de esto es el uso de proteínas, estas otorgan una capacidad emulsificante debido a su naturaleza anfifílica. Por otro lado, polisacáridos como maltodextrina funcionan como un compuesto hidrofílico y biodegradable que permite una encapsulación como segunda capa de la proteína (Germershaus et al. 2015). Al final, ambos compuestos permiten que los fitoesteroles se vuelvan biodisponibles debido a su solubilidad en agua. Existen diferentes parámetros que afectan la encapsulación de compuestos. Una técnica muy utilizada es la nanoprecipitación. Esta técnica permite que, compuestos como la acetona, se 2 mezclen con fitoesteroles los cuales son solubles constituyendo así la fase orgánica. Por otro lado, la proteína es capaz de diluirse en agua comprendiendo de esta forma la fase acuosa.Al mezclar ambas fases la proteína es incapaz de estabilizarse en el no disolvente el cual lo conforma la fase orgánica precipitándose y formando así las nanopartículas (Sadeghi et al. 2014). La relación de ambas fases puede afectar parámetros como forma y tamaño de partícula de los compuestos encapsulados (Sadeghi et al. 2014). Estudios preliminares recomiendan hacer uso de solventes orgánicos con el propósito de aumentar la solubilidad de los fitoesteroles en agua, las técnicas de encapsulación revelan que se han utilizado diferentes solventes (como metanol, etanol, isopropanol o n-butanol) (Di Battista et al. 2018). Es por eso que la investigación tiene como propósito encontrar la relación ideal de acetona y agua para encapsular los fitoesteroles siendo una alternativa para mejorar su solubilidad. La composición del material de cobertura, en este caso la proteína, mejora la dispersión del agua y bio-accesibilidad de los fitoesteroles a través de un método de emulsificación. Las gelatinas poseen propiedades superiores que las hacen un buen material encapsulante (Meng y Cloutier 2014). Basado en lo anterior se establecieron los siguientes objetivos del estudio: • Evaluar el cambio en el perfil de fitoesteroles encapsulados con respecto al perfil inicial. • Establecer el efecto de diferentes concentraciones de maltodextrina, cantidad de gelatina y acetona sobre actividad de agua, porcentaje de solubilidad y tamaño de partícula. • Determinar la influencia de la concentración de maltodextrina y relación acetona: agua sobre la eficiencia de encapsulación y capacidad de carga de las partículas. 3 2. MATERIALES Y MÉTODOS Localización del estudio El presente estudio se realizó en el Laboratorio de Análisis de Alimentos Zamorano (LAAZ), en el cual se realizaron los análisis fisicoquímicos y preparación de muestras. El secado de las muestras se llevó a cabo en las instalaciones de la Planta de Innovación de Alimentos (PIA). La evaluación de tamaños de partículas y morfología del producto encapsulado se efectuó en el laboratorio de reproducción animal de la carrera de Ciencia y Producción Agropecuaria. Las instalaciones mencionadas anteriormente se encuentran en la Escuela Agrícola Panamericana, Zamorano, localizada en el km. 30, carretera de Tegucigalpa hacía Danlí, Valle del Yeguare, Municipio de San Antonio de Oriente, departamento de Francisco Morazán, Honduras. Materiales Acetona RA ACS (J.T Barker pureza de 99.5%), Gelatina bovina 250 Bloom malla 30 y Maltodextrina en polvo (DE:10-35). Mezcla de Fitoesteroles de Palma africana (Elaeis guineensis) composición (Campesterol, Stigmasterol y β-sitosterol, BIOSA®, Honduras) y agua desionizada. Se utilizó agua desionizada para todos experimentos, la cual fue obtenida de un sistema de purificación de agua “Barnstead™” “Nanopure™” (“Thermo Scientific”, Waltham, MA, EE. UU.). Pruebas preliminares Para poder definir las relaciones de los tratamientos para encapsulado, se realizó una serie de pruebas preliminares. El proceso consistió en prueba y error evaluando diferentes relaciones de solvente: no-solvente y concentraciones de proteína y maltodextrina a usar como materiales encapsulantes. La fase orgánica fue usada como solvente, en donde fueron disueltos los fitoesteroles. Para la fase acuosa, se preparó agua destilada y gelatina a diferentes concentraciones como se mencionó antes. Ambas fases fueron mezcladas, agregando de forma directa la fase orgánica a acuosa. Las proporciones fueron definidas evaluando la homogeneidad, estabilidad y observando que no se formara precipitado en la solución final. Para el disolvente (fase inorgánica) se establecieron tres proporciones, las cuales fueron 2:1, 1:1.5, 1:1 en relación con la mezcla de la solución acuosa (agua). Para el material encapsulante gelatina, las concentraciones establecidas fueron 30 y 40 mg/mL, en relación con la cantidad de agua. Los porcentajes usados para maltodextrina fueron de 5 y 10%, tomando en cuenta la cantidad de agua a utilizar. Se realizó una doble encapsulación agregando directamente la maltodextrina en polvo a la mezcla entre fase acuosa y orgánica, la cual ya contenía los fitoesteroles encapsulados. Antes de agregar la maltodextrina, el solvente orgánico se evaporó haciendo uso de un rotavapor® R-100 (BÜCHI Labortechnik AG, Flawil, Suiza). Las partículas encapsuladas fueron secadas mediante secado por aspersión, “LabPlant SD-Basic”(“Keison Products”, Reino Unido) y fueron analizadas para determinar su tamaño, morfología, actividad de agua, solubilidad, eficiencia de encapsulado y capacidad de carga de los diferentes tratamientos. La elaboración de los tratamientos siguió las 4 formulaciones según el Cuadro 1 y el orden establecido en la Figura 1, en la cual se estableció la preparación de la solución acuosa: orgánica, roto evaporación y secado de las muestras. Cuadro 1. Formulación para elaboración de encapsulados, según tratamientos establecidos. Tratamiento Gelatina (mg/mL) %Maltodextrina (p/v) Relación acetona: agua 1 30 5 2:1 2 40 5 2:1 3 30 10 2:1 4 40 10 2:1 5 30 5 1.5:1 6 40 5 1.5:1 7 30 10 1.5:1 8 40 10 1.5:1 9 30 5 1:1 10 40 5 1:1 11 30 10 1:1 12 40 10 1:1 Figura 1. Flujo de proceso de elaboración de encapsulados con fitoesteroles. Preparación de la solución acuosa. La solución acuosa se preparó a partir de dos concentraciones de gelatina: 30 y 40 mg/mL. La preparación de cada solución fue en base a las relaciones de agua Pesado de la gelatina según la concentración deseada Mezcla de agua desionizada y gelatina a 30 - 40 °C. Pesado de fitoesteroles Mezclado de fitoesteroles y acetona Inicio Mezcla de fase orgánica en y fase acuosa Adición de maltodextrina a la mezcla de fase acuosa y orgánica Roto evaporación de la muestra a 360 mbar 50 °C Deshidratado de la muestra en secador por aspersión 5 desionizada 2:1,1:1.5 y 1:1, respectivamente. El agua fue colocada en un beaker de 1000 mL, luego se agregó la proteína y se calentó en una plancha agitadora. La temperatura utilizada para facilitar la dilución de la proteína en el agua fue entre 30-40 °C. Se mantuvo en agitación constante a 600 rpm con un agitador magnético por un tiempo aproximado de 20 minutos. Preparación de la solución orgánica. La cantidad de fitoesteroles a utilizar fue determinada en base a la proporción de proteína utilizada en la solución acuosa. Se empleó acetona grado reactivo como solvente, a la cual se le agregó el fitoesterol según el tipo de tratamiento y relación de solventes a ser preparada. La cantidad de fitoesteroles planteada fue de 50% del total de proteína usado en la fase acuosa de cada tratamiento (para una relación de 1 parte de fitoesteroles por cada dos partes de gelatina). Para preparar esta solución se colocó la acetona en un beaker de 500 mL, se agregaron los fitoesteroles previamente pesados. La mezcla se puso en una plancha con agitación magnética constante a 600 rpm durante 12 minutos aproximadamente. Roto evaporación. Una vez fueron preparadas las soluciones acuosas y orgánicas, se agregó de manera directa la solución orgánica a la acuosa y se mantuvo en agitación magnética constante durante 8 minutos. Las proporciones definidas fueron de 2:1, 1:1.5, 1:1 (acetona: agua). La muestra con los fitoesteroles ya encapsulados se roto evaporó para remover la acetona. Adicionalmente, se agregó la maltodextrina como material de segunda encapsulación a la solución acuosa que contenía la proteína y los fitoesteroles encapsulados. La cantidad usada de maltodextrina (5 o 10%) fue en relación con la proporción de agua utilizada inicialmente antes de realizar el proceso de roto evaporación. Secado por aspersión. Para el deshidratado de los tratamientos se utilizó un secador por aspersión “LabPlant SD-Basic” (Keison Products, Reino Unido). Se hizo pasar aproximadamente 50 mL de agua por todo el equipo para eliminar cualquier suciedad que pudo haber quedado de muestras anteriores y que pudieron ser un potencial contaminante de la siguiente muestra a secar. El tratamiento fue inyectado a través de la manguera a una velocidad de 6 mL/min, 3 bares de presión, una temperatura de entrada 150 y 90 °C de temperatura de salida en flujo continuo como se establece en el Cuadro 2. Cuadro 2. Condiciones de uso del secador por aspersión. Condiciones de uso Parámetros Temperatura de entrada 150 ˚C Temperatura de salida 90 ˚C Velocidad de bomba peristáltica 6 rpm Presión de aire 3 bar Fase 1. Análisis químicos y físicos de los encapsulados con fitoesteroles Perfil de fitoesteroles. Para determinar el perfil de fitoesteroles de la muestra mezcla de fitoesteroles y los tratamientos, se realizó un análisis de Cromatografía de Gases (CG) Agilent modelo 6890 mediante el método AOCS Ce 12-16 (AOCS 2017c). Brevemente, se preparó la solución de estándar interno utilizando Epicoprostanol (5β-colestano-3α–ol) en tolueno como 6 solvente (5 mg/mL). A continuación, se pesó 1 g de la muestra encapsulada en un matraz de 50 mL, en el cual se añadieron perlas de ebullición. Seguidamente al matraz que contenía la muestra se le agregó 5 mL del estándar interno y 5 mL de HCL a 3 N y se colocó en planchas a 100 ℃ en el condensador de reflujo durante 45 minutos donde se llevó a cabo una hidrólisis ácida de la muestra. Se dejó enfriar la muestra a temperatura ambiente durante 20 minutos y luego se adicionó 40 mL de NaCl saturada hasta aforar para realizar el lavado de la muestra. Se agitó la muestra manualmente durante 2 minutos y se dejó en reposo durante 5 minutos o hasta que se llevara a cabo la separación de fases, luego con una micropipeta se extrajo la fase orgánica y se colocó en un nuevo matraz de 50 mL. Se le adicionó 5 mL de NaOH/MeOH a 2.3 N y se llevó a cabo una hidrólisis alcalina a 100 °C durante 15 minutos, después se dejó enfriar a temperatura ambiente por 20 minutos. Posteriormente se le agregó 7 mL de HCL 3 N y 40 mL de NaCl saturada hasta aforar el cuello del matraz. Luego se agitó por 2 minutos y se dejó en reposo hasta observar la separación de fases. Inmediatamente se preparó el vial para el análisis de cromatografía. El vial fue preparado con 0.1 g de sulfato de sodio, 0.3 mL de muestra de la fase orgánica, 0.5 mL de piridina y 0.5 mL de BSTFA (N, O-Bistrifluoroacetamida) para poder derivatizar y facilitar la cuantificación de los fitoesteroles recuperados. Se colocaron los viales dentro de tubos de centrifugación de 15 mL y fueron centrifugados a 6000 rpm durante 3 minutos. Los tratamientos realizados fueron sometidos a este método para calcular la eficiencia de encapsulación y la capacidad de carga. Actividad de Agua (aw). La actividad de agua de cada tratamiento se midió después de ser secados en el proceso de secado por aspersión. Se determinó usando el medidor AQUALAB modelo serie 3 por el método AOAC 978.18. Este equipo mide la temperatura superficial de las muestras mediante infrarrojo y el punto de rocío sobre un espejo enfriado. Primero se calibró el equipo utilizando un estándar de 0.500 de actividad de agua, seguidamente se procedió a llenar las copas de muestra de plástico hasta la mitad y se realizó el análisis hasta que el equipo logrará alcanzar el equilibrio. Se tomaron tres lecturas de cada tratamiento. Solubilidad. El índice de solubilidad en agua fue determinado según el método descrito por (Ahmed et al 2010), al cual se le realizaron modificaciones para adaptarlo a la investigación. Se tomaron 2 gramos de muestra de encapsulado por cada repetición y tratamiento, se colocó en un tubo plástico de centrífuga con capacidad de 50 mL, al cual se le agregó 24 mL de agua desionizada. Posteriormente, se mezcló la muestra en un Vortex durante 5 minutos a 2500 rpm. La mezcla se llevó por 30 minutos a 30 ℃ en baño maría y se centrifugó por 15 minutos a 3000 rpm, esto para poder separar el material no soluble. Se extrajo el sobrenadante y se trasladó a una placa Petri que fue previamente pesada en una balanza analítica. Se pesó la placa Petri junto con el residuo y se dejó en el horno durante 24 h a 105 ℃. Una vez transcurrido el tiempo necesario en el horno, las muestras se dejaron enfriar en un desecador por aproximadamente 20 minutos, se pesó la muestra seca y se realizaron los cálculos. El porcentaje de solubilidad se calculó utilizando la Ecuación 1: %Solubilidad= ( PMS PMI )×100 [1] Donde: PMS: Peso muestra seca. PMI: Peso de material inicial. Tamaño de partícula y morfología. El tamaño de partícula fue determinado mediante la observación y medición del valor promedio de 15 partículas de cada tratamiento. Se utilizó un 7 microscopio invertido de marca Mshot MI11, con un aumento de 400X. Seguidamente al microscopio se le colocó una cámara Dino-Eye AM-423X, esto permitió visualizar mejor las partículas. Las imágenes pudieron observarse y medirse usando el programa Dino capture 2 - 0 versión 2.0. La escala utilizada en la medición del tamaño y morfología de partículas fue en micrómetros. Fase 2. Capacidad de carga y eficiencia de encapsulación. Porcentaje (%) de Eficiencia de Encapsulación (EE). El análisis de eficiencia de encapsulación se midió a partir de una relación entre la cantidad de fitoesteroles iniciales (peso) añadidos en la mezcla del encapsulado, y la cantidad de fitoesteroles resultantes que fueron encapsulados (cuantificación), y esto se multiplicó por cien. Este diferencial se determinó por análisis de cromatografía de gases del material encapsulado para cuantificar la cantidad de fitoesteroles recuperados de las partículas elaboradas. Se calculó la E.E. según la Ecuación 2. % Eficiencia de Encapsulación= FF IF ×100 [2] Donde: FF = Fitoesteroles recuperados por cromatografía de gases. IF = Cantidad inicial de fitoesteroles. Capacidad de Carga (CC). Se obtuvo la cantidad de fitoesteroles por gramo de muestra según el resultado obtenido luego de integrar el área debajo de las curvas de la gráfica obtenida en cromatografía, según el método AOCS Ce 12-16. Luego se sumó la cantidad por gramo de cada uno de los fitoesteroles en el total de la muestra para determinar los miligramos de fitoesteroles por gramo de muestra. Se calculó la CC según la Ecuación [3]. Capacidad de carga= FR CMC [3] Donde: FR = Fitoesteroles recuperados por cromatografía de gases, mg. CMC = Cantidad de muestra utilizada para cromatografía de gases, g. Diseño experimental. Se utilizó un Diseño Completamente al Azar (DCA para ambas fases de los análisis químicos y físicos. Se evaluaron doce (12) tratamientos (tres relaciones de acetona:agua, dos concentraciones de proteína y dos porcentajes de maltodextrina) con tres repeticiones para cada tratamiento, para un total de 36 unidades experimentales (Cuadro 2). Los datos se analizaron utilizando un análisis de varianza (ANDEVA). Se utilizó la prueba de Duncan para la separación de medias de los tratamientos y LSMEANS para evaluar las interacciones entre las variables evaluadas con una probabilidad del 95%. Para el análisis de los datos se utilizó el programa “Statistical Analysis System” (SAS®) versión 9.4. 8 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Fase 1 Durante la primera fase del experimento se establecieron los parámetros de actividad de agua, porcentaje de solubilidad en agua, tamaño y morfología de las partículas de los diferentes tratamientos. Luego de obtener los resultados, se obtuvieron los mejores tratamientos por cada variable evaluada. De igual forma, se estableció el efecto del porcentaje (%) de maltodextrina, relación acetona: agua y gelatina sobre las variables evaluadas. Con esta información se procedió a elegir los tratamientos en los cuales se evaluaría la capacidad de carga y eficiencia de encapsulación. Se tomó en cuenta la información establecida por el análisis de separación de medias Duncan y de interacciones LS Means para elegir las variables a evaluar en capacidad de carga y eficiencia de encapsulación. Perfil de fitoesteroles. Se evaluó mediante cromatografía de gases el perfil de esteroles y estanoles presentes en el concentrado de fitoesteroles utilizados en el presente estudio. Para ello, los fitoesteroles se derivatizaron a éteres de trimetilsililo (TMS) y fueron separados y cuantificados utilizando el método AOCS Ce 12-16. El análisis de la mezcla de fitoesteroles demuestra que tenían una concentración total promedio de 98.85%, de los cuales 19.66% eran Campesteroles, 15.54% eran Estigmasteroles y 53.68% eran β-Sitoesteroles. Estos últimos datos son similares a los declarados en el certificado de análisis del producto. Otros fitoesteroles se encontraron en menor cantidad (9.67%) y fueron identificados en el Cuadro 3 y Figura 2. Por otro lado, los tratamientos de encapsulados también presentaron todos los mismos fitoesteroles en porcentajes similares, pero en cantidades diferentes, de acuerdo con su encapsulación. Por lo tanto, el proceso de encapsulación no afectó el perfil de fitoesteroles, sino la cantidad total de fitoesteroles recuperados. Figura 2. Cromatograma obtenido de la muestra de concentrado de fitoesteroles. La identificación de cada pico se presenta en el Cuadro 3. Eje Y=Pico amperios, pA; Eje X= Tiempo, min. 9 Cuadro 3. Tiempos de retención y concentración en porcentaje (%) de esteroles y estanoles encontrados en la muestra de concentrado utilizado en el presente estudio. Pico Compuesto Tiempo de retención (min) %Fitoesteroles en concentrado Promedio ± D.E. 1 5β-Colestano-3a-ol (Estándar Interno) 26.42 --- 2 Brasicasterol 35.16 0.86 ± 0.00 3 Ergosterol* 39.06 1.15 ± 0.41 4 24-Metileno Colesterol 39.06 0.47 ± 0.05 5 Campesterol 40.69 19.66 ± 0.03 6 Campestanol 41.42 0.69 ± 0.05 7 Estigmasterol 43.8 15.54 ± 0.46 8 Δ22-Estigmastenol 44.57 3.56 ± 1.36 9 Δ7-Campesterol 46.04 0.30 ± 0.09 10 Clerosterol + Δ5,23-Estigmastadienol 48.11 0.38 ± 0.06 11 β-Sitosterol 50.43 53.68 ± 1.65 12 Sitostanol 51.07 1.41 ± 0.08 13 Δ5-Avenasterol 52 1.17 ± 0.03 14 Fucosterol 53.68 0.46 ± 0.04 15 Δ7-Estigmastenol 54.94 0.39 ± 0.01 16 Δ7-Avenasterol 56.83 0.26 ± 0.07 * No incluido en el cálculo de esteroles; D.E.= Desviación Estándar. Actividad de agua. Un bajo valor en actividad de agua en los alimentos permite reducir su actividad microbiológica cuando es menor a 0.6. La actividad de agua de un polvo que se encuentra entre 0.2-0.4 provee de reducciones en procesos como oxidación y reacciones enzimáticas como empardeamiento (Caliskan y Dirim 2016). A baja actividad de agua se forma una capa de agua fina que protege las partículas del contacto con el oxígeno (Labuza et al. 1969). Se denota en el Cuadro 4 que el rango de actividad de agua se encontró entre 0.22 a 0.43. Los resultados obtenidos en el estudio son superiores a los obtenidos por Tolve et al. (2018). En dicho estudio se utilizó proteína de suero, inulina y quitosano como agentes encapsulantes de fitoesteroles secados por aspersión en los que se obtuvo un rango de actividad de agua de 0.24 a 0.44. La maltodextrina es altamente soluble en agua y con comportamiento hidrofílico (Barthold et al. 2019). Dada las propiedades de higroscopicidad de la partícula, se tuvo en cuenta que durante su manejo los valores en aw pudieron cambiar drásticamente. Según los resultados obtenidos en el Cuadro 5 y de acuerdo con el análisis de medias LS Means, se pudo establecer que existe un efecto estadísticamente significativo (P ˂ 0.05) del porcentaje de maltodextrina y relación acetona: agua sobre actividad de agua. De los parámetros evaluados, la cantidad de proteína no tuvo influencia significativa (P ˃ 0.05) sobre la actividad de agua. En un estudio realizado por Mishra et al. (2013), encontraron que el porcentaje de maltodextrina de 5 a 9% para polvo de jugo de Amla secado por aspersión provocó una disminución en el contenido de humedad de un 5.6 a un 3.8%. Esto demuestra que un aumento en el contenido de maltodextrina puede reducir el porcentaje de agua en la muestra a secar por aspersión. Esto se puede deber a que un aumento en el contenido de 10 sólidos provoca que se tenga que eliminar una menor cantidad de agua durante el secado (Kha et al. 2010). Por otro lado, la relación acetona: agua pudo tener un efecto en la aglomeración de las partículas. Al incrementar la aglomeración debido a un incremento en las interacciones Van der Waals se obtiene una menor eficiencia en el secado por aspersión (Birchal 2005). Cuadro 4. Actividad de agua de promedio de los diferentes tratamientos y separación Duncan por tratamiento. %Maltodextrina (p/v) Gelatina (mg/mL) Actividad de agua media ± D.E. 2:1 5 30 0.43 ± 0.025a 40 0.35 ± 0.024b 10 30 0.23 ± 0.036e 40 0.28 ± 0.019cd 1.5:1 5 30 0.31 ± 0.049bc 40 0.26 ± 0.016de 10 30 0.25 ± 0.017de 40 0.24 ± 0.014de 1:1 5 30 0.27 ± 0.019cd 40 0.26 ± 0.028de 10 30 0.28 ± 0.032cd 40 0.22 ± 0.019e C.V. (%) 17.02 C.V. (%) = Coeficiente de variación en porcentaje; D.E.= Desviación Estándar; (p/v) = peso/volumen; a-e = Valores seguidos por diferentes letras en la misma columna son estadísticamente diferentes (P ˂ 0.05). Cuadro 5. Probabilidades obtenidas en el análisis de varianza de la actividad de agua de las partículas. Variables Valor-p Gelatina 0.144 Relación acetona: agua 0.001 Concentración de maltodextrina 0.005 Proteína*Relación solventes 0.811 Proteína*Maltodextrina 0.229 Relaciones solventes*Maltodextrina 0.002 Proteína* Relación solventes*Maltodextrina 0.055 C.V. (%) 17.02 R2 0.70 C.V. (%) = Coeficiente de Variación en porcentaje. 11 Solubilidad. La utilización de compuestos a base de proteína mejora la solubilidad de los fitoesteroles al momento de ser encapsulados. Bajo este concepto se estableció el uso de gelatina y maltodextrina, ya que al poseer extremos hidrofílicos mejoran la solubilidad de las partículas en agua (Meng y Cloutier 2014). La solubilidad de los encapsulados con fitoesteroles fue mayor a 80% para la mayoría de los tratamientos evaluados como se muestra en el Cuadro 6. Solamente dos tratamientos presentaron una solubilidad menor al 80%. Cuadro 6. Porcentaje de solubilidad promedio para los diferentes tratamientos y separación Duncan por tratamiento. Relación acetona: agua %Maltodextrina (p/v) Gelatina (mg/mL) % Solubilidad en agua promedio ± D.E. 2:1 5 30 83.88 ± 2.95ab 40 82.37 ± 2.89bc 10 30 88.62 ± 1. 12a 40 88.01 ± 1.29ab 1.5:1 5 30 84.53 ± 3.40ab 40 77.83 ± 7.32cd 10 30 89.40 ± 0. 85a 40 88.87 ± 2. 31a 1:1 5 30 82.25 ± 2.14bc 40 75.42 ± 4.07d 10 30 88.69 ± 1. 65a 40 87.94 ± 0.85ab C.V. (%) 3.67 C.V. (%) = Coeficiente de variación en porcentaje; D.E.= Desviación Estándar; (p/v) = peso/volumen; a-d: Valores seguidos por diferentes letras en la misma columna son estadísticamente diferentes (P ˂ 0.05). Según el análisis de interacciones en el Cuadro 7, se puede observar que la relación entre porcentaje de maltodextrina y proteína promovió cambios estadísticamente significativos (P ˂ 0.05) en el % de solubilidad en agua. Por otro lado, se estableció que la relación acetona: agua no tuvo ninguna influencia significativa (P ˃ 0.05) sobre la solubilidad de las partículas. El aumento en el porcentaje (%) de maltodextrina provocó un aumento en la solubilidad de las partículas. Los resultados de solubilidad obtenidos en el presente estudio son comparables con los reportados por Siacor et al. (2020), en el cual se encapsuló compuestos fenólicos de semilla de mango. En dicho estudio se estableció que el incremento de un 2 a un 5% de maltodextrina resultó en un aumento significativo (P ˂ 0.05) en el índice de solubilidad en agua. Este comportamiento puede ser asociado al hecho de que la maltodextrina es una molécula altamente polar y con amplia cantidad de grupos hidroxilo (Do Valle Calomeni et al. 2017). Esto último resulta en un aumento de la solubilidad cuando los encapsulados se solubilizan en agua. Sumado a esto, la interacción entre la gelatina bovina y la maltodextrina, al contener ambas moléculas secciones hidrofílicas, estas interactúan y vuelven a la 12 partícula más soluble en ambientes acuosos (Semenova et al. 2002). Esto justifica el aumento en solubilidad y actividad de agua de las partículas al interaccionar con el agua. Cuadro 7. Probabilidades obtenidas en el Análisis de varianza para el porcentaje de solubilidad (%) en agua de las partículas. Variables Valor-p Gelatina 0.012 Relación acetona: agua 0.235 Concentración de maltodextrina <.0001 Proteína*Relación solventes 0.494 Proteína*Maltodextrina 0.045 Relaciones solventes*Maltodextrina 0.251 Proteína* Relación solventes*Maltodextrina 0.502 C.V. (%) 3.663 R2 0.755 C.V. (%) = Coeficiente de Variación en porcentaje. Morfología y tamaño de partícula. De acuerdo con la clasificación morfológica para microcápsulas establecida por Gharsallaoui et al. (2007), se clasificó la forma para los tratamientos. Para los tratamientos se encontraron microcápsulas de forma irregular como se ilustra en la Figura 3. Además, se encontraron microcápsulas multipared para todos los tratamientos, donde se puede observar la doble capa formada alrededor del fitoesterol. Las microcápsulas pueden ser clasificadas como Figuras amorfas, las cuales según Cao et al. (2016) aumentan la solubilidad en agua por su forma. En el caso de tamaño de partícula, este es uno de los factores más importantes de los compuestos encapsulados. Este parámetro permite determinar si el tamaño afectará la textura del alimento donde será incorporado (Comunian y Favaro-Trindade 2016). Por ello, es esencial monitorear el tamaño de partícula de los encapsulados con fitoesterol, ya que según Tolve et al. (2020), tamaños de partícula superiores a los 30 μm pueden afectar la textura de los alimentos en los que se incorporarán. Los resultados en el Cuadro 8 muestran que el tamaño de partícula fue estadísticamente diferente (P ˂ 0.05) entre los tratamientos evaluados. El rango de tamaños que se obtuvo fue de 43 a 60 μm. Los valores obtenidos están por encima de lo obtenido por Di Battista et al. (2018), en el cual se utilizó goma arábica y maltodextrina como agentes encapsulantes de fitoesterol con promedio de tamaño de partícula de 5 µm. Esta diferencia puede deberse a que en el estudio Di Battista et al. (2018), utilizaron un proceso de homogenización a la hora de preparar las muestras, contrario a lo realizado en el presente estudio. 13 Figura 3. Imágenes tomadas por microscopio óptico invertido. Aumento de 400X. Para: A = (Relación 2:1, 5% maltodextrina, 30 mg/mL gelatina); B = (Relación 1:1, 10% maltodextrina, 40 mg/mL gelatina); C = (Relación 2:1, 5% maltodextrina, 40 mg/mL gelatina); D = (Relación 1.5:1, 5% maltodextrina, 30 mg/mL gelatina). 14 Cuadro 8. Tamaño promedio de partícula (μm) para los diferentes tratamientos y separación Duncan por tratamiento. Relación acetona: agua % Maltodextrina (p/v) Gelatina (mg/mL) Tamaño de partícula(μm) promedio± D.E. 2:1 5 30 60.59 ± 5. 43a 40 56.62 ± 5.44ab 10 30 57.81 ± 5.44ab 40 54.78 ± 5.75bc 1.5:1 5 30 49.83 ± 4.36de 40 52.30 ± 6.00cd 10 30 50.44 ± 5.92ed 40 49.14 ± 4.83def 1:1 5 30 46.86 ± 5.46efg 40 43.17 ± 4.07g 10 30 45.28 ± 5.35fg 40 44.16 ± 4.68g C.V. (%) 10.5 C.V. (%) = Coeficiente de variación en porcentaje; (p/v) =peso/volumen; a-g: valores seguido por diferentes letras en la misma columna son estadísticamente diferentes (P ˂ 0.05); D.E.= Desviación Estándar. Según el análisis en el Cuadro 9, se estableció que el tamaño de partícula fue estadísticamente diferente (P ˂ 0.05), teniendo como parámetros de influencia la relación acetona: agua y el porcentaje de maltodextrina por muestra. Por otro lado, se ha reportado que el uso de compuestos orgánicos como acetona y etanol promueven la precipitación de la albumina de suero bovina al ser incompatibles (Sadeghi et al. 2014). Según el mismo autor, la incompatibilidad genera aglomerados al ser disueltos la fase orgánica con la fase acuosa conteniendo la proteína. Este efecto pudo ocurrir en el presente estudio, ya que se utilizó acetona como agente no solvente y gelatina (proteína) como material encapsulante. Cuadro 9. Probabilidades obtenidas en el Análisis de varianza para el tamaño de partícula (μm) de las partículas. Variables Valor-p Gelatina 0.078 Relación acetona:agua 0.007 Concentración de maltodextrina <.0001 Proteína*Relación solventes 0.759 Proteína*Maltodextrina 0.429 Relación solventes*Maltodextrina 0.034 Proteína* Relación solventes*Maltodextrina 0.152 C.V. (%) 10.16 R2 0.55 C.V. (%) = Coeficiente de variación en porcentaje. 15 Como se puede observar en el Cuadro 10, se determinó que a medida se incrementó la concentración de acetona en la mezcla de no-solvente: solvente, se obtuvo un mayor tamaño de partícula. Esto no concuerda con lo reportado por Etorki et al. (2016), quienes crearon nanoencapsulación de partículas utilizando α-lactalbumina y ovoalbúmina, en el uso de diferentes agentes disolventes no encontraron un efecto significativo en los tamaños de partículas. Para este efecto, ellos concluyeron que utilizar agentes disolventes en concentraciones alrededor del 70 al 80% causa que la proteína se despliegue y se pliega para agregarse y formar nanopartículas, y que la adición de más agente disolvente no tiene efecto sobre el tamaño. Sin embargo, en comparación con solventes orgánicos como el etanol, la polaridad de la acetona promueve una menor hidrofobicidad, lo cual reduce el tamaño de la partícula (Sahoo et al. 2015). El aporte que compuestos como la acetona establecen es un menor tamaño de partícula en albumina de suero (Sadeghi et al. 2014) y una mejor solubilidad de los fitoesteroles (Leong et al. 2011). Cuadro 10. Efecto de relación disolvente: agua sobre el tamaño promedio de partícula (μm) de fitoesteroles encapsulados y separación de medias Duncan para relación acetona: agua. Relación acetona: agua Tamaño de partícula (μm) promedio ± D.E. 2:1 57.45 ± 6. 19a 1.5:1 50.43 ± 5.32b 1:1 44.87 ± 4.76c CV (%) 10.5 P. ˂0.0001 C.V. (%) = Coeficiente de variación en porcentaje; P=Probabilidad; D.E= Desviación Estándar a-b: Valores seguidos por diferentes letras en la misma columna son estadísticamente diferentes (P ˂ 0.05). Fase 2 Se determinó que los factores que tuvieron mayor influencia en los parámetros como actividad de agua, tamaño de partícula y solubilidad fueron el porcentaje de maltodextrina y proteína. Para el caso de la concentración de gelatina, se encontró que 30 mg/mL de proteína produjo los mejores resultados en % de solubilidad en comparación con 40 mg/mL. Debido a esto, se seleccionaron solamente los tratamientos con 30 mg/mL para los análisis de capacidad de carga y eficiencia de encapsulación. Por lo cual, solamente se evaluaron las variables de relación acetona: agua y porcentaje de maltodextrina. Además, los resultados en el Cuadro 7 demostraron que la maltodextrina fue más significativa para el parámetro de solubilidad en agua, por lo cual se decidió estudiar esta variable, ya que este ingrediente es más barato y se encuentra en mayor cantidad en la formulación de los encapsulados. Al final, se obtuvo la capacidad de carga y porcentaje de eficiencia de encapsulación para los siguientes tratamientos; 1) Relación acetona: agua (2:1), 5 % maltodextrina y 30 mg/mL de gelatina; 2) Relación acetona: agua (2:1), 10 % maltodextrina y 30 mg/mL de gelatina; 3) Relación acetona: agua (1.5:1), 5 % maltodextrina y 30 mg/mL de gelatina, y 4) Relación acetona: agua (1.5:1), 10 % maltodextrina y 30 mg/mL de gelatina. 16 Eficiencia de encapsulación. Los resultados del Cuadro 11 muestran que la eficiencia de encapsulación de los fitoesteroles fue mayor al 80%, alcanzando para algunos tratamientos hasta un 94%, lo cual demuestra que el método utilizado en conjunto con la gelatina y maltodextrina como materiales encapsulantes tienen un alto potencial para la encapsulación de fitoesteroles. Se encontró diferencia significativa (P < 0.05) entre tratamientos para eficiencia de encapsulación (Cuadro 11). Se estableció que, a menor cantidad de acetona utilizada, se encontró una tendencia al incremento en los resultados de eficiencia de encapsulación. Los resultados obtenidos son similares a los reportados por Cao et al. (2006), quienes reportaron eficiencias de encapsulación en el rango de 63 a 95% para fitoesteroles encapsulados en caseinato de sodio, proteína de soja o proteína de suero de leche. Cuadro 11. Porcentaje de encapsulación promedio para los diferentes tratamientos y separación de medias Duncan por tratamiento. Relación (acetona: agua) % Maltodextrina (p/v) % Eficiencia de encapsulación promedio ± D.E. 2:1 5 80.80 ± 5.31b 10 88.44 ± 2.85ab 1.5:1 5 88.76 ± 3.62ab 10 94.31 ± 4.05a C.V. (%) 6.48 C.V. (%) = Coeficiente de Variación en porcentaje; a-b: valores seguido por diferentes letras son estadísticamente diferentes (P ˂ 0.05); D.E= Desviación Estándar. En el Cuadro 12 se puede observar que la relación acetona: agua tuvo un efecto significativo (P ˂ 0.05) en el porcentaje (%) de eficiencia de encapsulación de los fitoesteroles. Esto concuerda con lo obtenido por Lee et al. (2010). En el estudio de Lee, se estableció que una reducción del no solvente (etanol) con relación al solvente provocó un aumento en el rendimiento de encapsulado de gelatina bovina. De igual forma, Castellanos et al. (2001) establecieron que cambios en la relación fase acuosa-orgánica provocó diferentes resultados en la eficiencia de encapsulación de albúmina de suero bovino (BSA) en microesferas de poli (lactida-co-glicólido) (PLG). Añadiendo a esto, Sadeghi et al. (2014) estableció que la acetona en comparación con solventes como etanol, produce la mejor eficiencia de encapsulado de nanopartículas de albumina de suero bovino y encapsulación de curcumina, el cual es un compuesto con características hidrofóbicas similares a los fitoesteroles. 17 Cuadro 12. Probabilidades obtenidas en el Análisis de varianza para la eficiencia de encapsulación (%) de las partículas. Variables Valor-p Relación acetona/agua 0.036 Concentración de Maltodextrina 0.030 Relaciones solventes*Maltodextrina 0.688 C.V. (%) 4.630 R2 0.671 C.V. (%) = Coeficiente de Variación en porcentaje. Otro factor significativo (P ˂ 0.05) fue el porcentaje (%) de maltodextrina, ya que a medida se incrementó el porcentaje de maltodextrina, se incrementó la eficiencia de encapsulación. Este comportamiento también fue reportado por Akhavan Mahdavi et al. (2016), quienes utilizaron maltodextrina, goma arábica y gelatina para encapsular antocianinas. La eficiencia de encapsulación estuvo en un rango entre un 89 a un 96%. Capacidad de carga. Según Joye y McClements (2014), la capacidad de carga es uno de los parámetros que evalúa el aporte del material encapsulante en el sistema de encapsulación. Como consecuencia de esto, se establece en el Cuadro 13 que en los tratamientos con menor cantidad de maltodextrina se obtuvo una mayor capacidad de carga. Con esta técnica se alcanzó una capacidad de carga de hasta 142 mg de fitoesteroles por cada gramo de encapsulados en polvo (Cuadro 13). Estos resultados son prometedores, ya que son consistentes con algunos valores reportados otros estudios previos para la encapsulación de fitoesteroles en caseinato de sodio, proteína de soja o proteína de suero de leche (Cao et al. 2006). En dicho estudio se reportaron capacidades de carga para los fitoesteroles en el rango de 49 – 270 mg/g, o de 4.9 – 270 g/100 g. Asimismo, ellos reportaron que a medida se incrementó el porcentaje de caseinato sodio, la capacidad de carga disminuyó. La capacidad de carga es dependiente de la cantidad de material núcleo a encapsular con relación a la cantidad de material encapsulante. Cuadro 13. Capacidad de carga promedio para los diferentes tratamientos y separación de medias Duncan por tratamiento. Relación (acetona: agua) % Maltodextrina (p/v) Capacidad de carga (mg ft. /g muestra) promedio ± D.E. 2:1 5 129.16 ± 8.48ª 10 86.99 ± 2.81b 1.5:1 5 141.88 ± 5.79a 10 88.06 ± 8.65b C.V. (%) 6.15 C.V. (%) = Coeficiente de variación en porcentaje; mg ft, /g muestra = mg de fitoesterol por gramo de producto de muestra; a-b: Valores seguido por diferentes letras en la misma columna son estadísticamente diferentes (P ˂ 0.05); D.E.= Desviación Estándar. 18 Según el análisis del Cuadro 14, el porcentaje (%) de maltodextrina fue el factor que afectó de forma significativa (P ˂ 0.05) la capacidad de carga de los fitoesteroles encapsulados. A medida se aumentó el porcentaje de maltodextrina, se observó una reducción en la capacidad de carga (mg/g). Esto se debe al aumento en la concentración de maltodextrina con respecto a los compuestos encapsulados, reduciendo así la cantidad de fitoesteroles por gramo de muestra. El efecto del aumento de concentración de maltodextrina en compuestos encapsulados fue demostrado en estudios previos (Barthold et al. 2019). En dicho estudio, se utilizaron 2 concentraciones de maltodextrina (2.5 y 10% w/w) y se concluyó que el aumento en porcentaje (%) de maltodextrina produjo una reducción en la concentración de fenoles totales de extractos de desechos de piña secados por aspersión. Cuadro 14. Probabilidades obtenidas en el Análisis de varianza para la capacidad de carga (mg/g) de las partículas. Variables Valor-p Relación acetona: agua 0.120 Concentración de maltodextrina <.0001 Rel*Malt 0.180 C.V. (%) 6.150 R2 0.950 C.V. (%) = Coeficiente de Variación en porcentaje. 19 4. CONCLUSIONES • El perfil de fitoesteroles no cambia al realizar el proceso de encapsulación. • Solamente el porcentaje de maltodextrina y la concentración de gelatina, de los factores evaluados, afectan la solubilidad de las partículas con fitoesteroles. • El porcentaje de maltodextrina, gelatina y la relación acetona: agua no afectan la actividad de agua de las partículas. • El tamaño de partícula se verá afectada por la interacción entre los factores acetona: agua y concentración de proteína. Se observa tamaños de partículas en un rango de 40 a 60 µm y con forma irregular y amorfa. • La concentración de maltodextrinas y relación acetona: agua afectan de manera directa dando un efecto significativo sobre la eficiencia de encapsulación y capacidad de carga de las partículas. 20 5. RECOMENDACIONES • Se recomienda evaluar el uso de un surfactante para mejorar tamaño promedio de partícula. • Se recomienda realizar pruebas de color, sabor y textura en una matriz alimenticia para establecer los cambios obtenidos. 21 6. LITERATURA CITADA [AOAC] Association of Official Analytical. 1995. Water Activity of Canned Vegetables in Official Methods of Analysis. Gaithersburg, MD. Method number 978.18 [AOCS] American Oil Chemists Society. 2017. Official Method Ce 12-16: Sterols and stanols infoods and dietary supplements containing added phytosterols. InM. W. Collison, (Ed.), Official methods and recommended practices of the AOCS(7th ed.). Urbana, IL: AOCS Press. Ahmed M, Akter MS, Lee J-C, Eun J-B. 2010. Encapsulation by spray drying of bioactive components, physicochemical and morphological properties from purple sweet potato. LWT - Food Science and Technology. 43(9):1307–1312. doi:10.1016/j.lwt.2010.05.014 Akhavan Mahdavi S, Jafari SM, Assadpoor E, Dehnad D. 2016. E. 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Interacción Probabilidad Gelatina 0.144 Relación acetona: agua 0.001 Concentración de maltodextrina 0.005 Gelatina*relación acetona: agua 0.811 Gelatina*concentración de maltodextrina 0.229 Relación acetona: agua*concentración de maltodextrina 0.002 Relación acetona: agua*concentración de maltodextrina*gelatina 0.055 C.V. (%) 17.018 R2 0.700 C.V. (%) = Coeficiente de variación en porcentaje. Anexo 2 Análisis de varianza para porcentaje de solubilidad (%) en agua. Interacción Probabilidad Gelatina 0.012 Relación acetona: agua 0.235 Concentración de maltodextrina <.0001 Gelatina*Relación acetona: agua 0.494 Gelatina*Concentración de maltodextrina 0.045 Relación acetona: agua*Concentración de maltodextrina 0.251 Relación acetona: agua*Concentración de maltodextrina*Gelatina 0.502 C.V. (%) 3.663 R2 0.755 C.V. (%) = Coeficiente de variación en porcentaje. 26 Anexo 3. Análisis de varianza para tamaño de partícula. Interacción Probabilidad Maltodextrina 0.078 Gelatina 0.007 Relación acetona:agua <.0001 Concentración de maltodextrina*gelatina 0.759 Concentración de maltodextrina*relación acetona:agua 0.429 Gelatina*relación acetona: agua 0.034 Concentración de maltodextrina*gelatina*relación acetona: agua 0.152 C.V. (%) 10.160 R2 0.552 C.V. (%) = Coeficiente de variación en porcentaje. Anexo 4. Análisis de varianza para capacidad de carga Interacción Probabilidad Relación acetona: agua 0.120 Concentración de maltodextrina <.0001 Relación acetona: agua*concentración de maltodextrina 0.180 C.V. (%) 6.150 R2 0.950 C.V. (%) = Coeficiente de variación en porcentaje. Anexo 5. Análisis de varianza para eficiencia de encapsulación. Interacción Probabilidad Relación acetona: agua 0.036 Concentración de maltodextrina 0.030 Relación acetona: agua*concentración de maltodextrina 0.688 C.V. (%) 4.630 R2 0.671 C.V. (%) = Coeficiente de variación en porcentaje.