Evaluación de la fermentación controlada con inoculación de levaduras (Saccharomyces cerevisiae) y su efecto en la calidad del café (Coffea arabica) Jimena Betancur Moreno Mateo Sebastián Zurita Sarzosa Escuela Agrícola Panamericana, Zamorano Honduras Noviembre, 2020 i ZAMORANO CARRERA DE AGROINDUSTRIA ALIMENTARIA Evaluación de la fermentación controlada con inoculación de levaduras (Saccharomyces cerevisiae) y su efecto en la calidad del café (Coffea arabica) Proyecto especial de graduación presentado como requisito parcial para optar al título de Ingenieros en Agroindustria Alimentaria en el Grado Académico de Licenciatura Presentado por: Jimena Betancur Moreno Mateo Sebastián Zurita Sarzosa Zamorano, Honduras Noviembre, 2020 iii Evaluación de la fermentación controlada con inoculación de levaduras (Saccharomyces cerevisiae) y su efecto en la calidad del café (Coffea arabica) Jimena Betancur Moreno Mateo Sebastián Zurita Sarzosa Resumen. El beneficio húmedo es determinante en el desarrollo de atributos en el café que pueden traducirse en mejores precios en mercados internacionales. En este estudio se evaluaron las condiciones de fermentación controlada en café variedad Caturra, cuyo princ ipal objetivo fue determinar el efecto de la fermentación asistida en sus características fisicoquímicas y sensoriales. El estudio se realizó en la Finca Kotowa, Boquete, Panamá. Se analizaron dos procesos de fermentación (lavado y natural) con o sin la adición de inóculo (levadura) y tratamientos control sin fermentación, con tres repeticiones. Durante los 6 días de fermentación se realizaron mediciones de pH, temperatura interna y sólidos solubles y análisis microbiológicos al iniciar y al finalizar el proceso. Después del periodo de secado, se efectuaron análisis de fenoles totales y cafeína. Finalmente, se realizó la evaluación sensorial (catación) en café tostado. Se evidenció una reducción de sólidos solubles, temperatura interna y pH durante la fermentación. La fermentación controlada favoreció el puntaje final de catación independientemente de la inclusión de inóculo en el proceso. Se obtuvo una diferencia en puntaje de taza de 0.8 puntos para café lavado y 1.16 para natural, entre tratamientos de fermentación asistida y sus respectivos controles. En general, los tratamientos con café natural y fermentación controlada presentaron mayor concentración de fenoles que los tratamientos con café lavado. No se encontraron diferencias en el contenido de cafeína y recuentos de microorganismos (hongos y levaduras) entre tratamientos. Se recomienda seguir evaluando inoculación, tiempos de fermentación y aplicación en otras variedades de café. Palabras clave: Acidez, beneficio, catación, lavado, microorganismos, natural. Abstract. The wet mill is decisive in the development of attributes in coffee which could lead to better princes in international markets. In this study, the controlled fermentation conditions in Caturra coffee were evaluated, whose main objective was to determine the effect of assisted fermentation on the coffee physicochemical and sensory characteristics. The study was carried out at Kotowa Farms, Boquete, Panama. Two fermentation processes (washed and natural) with or without the addition of inoculum (yeast) and control treatments without fermentation were analyzed, with three replicates. During the 6 days of fermentation, pH, internal temperature, and soluble solids were measured and microbiological analyses were carried out at the beginning and at the end of the process. After the drying period, analyses were made for total phenols and caffeine. Finally, sensory evaluation (cupping) was carried out in roasted coffee. A reduction in soluble solids, internal temperature and pH was evidenced during fermentation. Controlled fermentation favored the final cupping score regardless of the inclusion of inoculum in the process. A difference in cup score of 0.8 points was obtained for washed coffee and 1.16 for natural, between assisted fermentation treatments and their respective controls. In general, treatments with natural coffee and controlled fermentation presented a higher concentration of phenols than treatments with washed coffee. No differences were found in caffeine content and microbial count (yeast and molds) among treatments. It is recommended to continue evaluating inoculation, fermentation time and application in other varieties of coffee. Key words: Acidity, benefit, cupping, microorganisms, natural, washed. iv ÍNDICE GENERAL Portadilla ..................................................................................................................... i Página de firmas............................................................................................................ ii Resumen ....................................................................................................................... iii Contenido ..................................................................................................................... iv Índice de Cuadros, Figuras y Anexos ............................................................................. v 1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................... 1 2. MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................. 3 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN................................................................................. 7 4. CONCLUSIONES ..................................................................................................... 17 5. RECOMENDACIONES ............................................................................................ 18 6. LITERATURA CITADA........................................................................................... 19 7. ANEXOS.................................................................................................................... 25 v ÍNDICE DE CUADROS, FIGURAS Y ANEXOS Cuadros Página 1. Descripción de tratamientos......................................................................................... 3 2. Comportamiento del pH durante el periodo de fermentación. ........................................ 10 3. Comportamiento de sólidos solubles durante el periodo de fermentación....................... 10 4. Recuento de hongos y levaduras al inicio y al final de la fermentación. ......................... 12 5. Determinación del contenido de fenoles totales y cafeína.............................................. 13 Figuras Página 1. Temperatura de la masa durante la fermentación. ......................................................... 8 2. Resultados de cataciones realizadas a los seis tratamientos. .......................................... 15 Anexos Página 1. Curva de tostado para catación de café natural Kotowa................................................. 25 2. Curva de tostado para catación de café lavado Kotowa. ................................................ 25 3. Descriptores de los tratamientos en catación................................................................. 26 4. Nivel de significancia y correlación de factores en temperatura interna. ........................ 26 5. Nivel de significancia y correlación de factores en sólidos solubles............................... 26 6. Nivel de significancia en fenoles y cafeína. .................................................................. 26 7. Nivel de significancia y correlación de factores en pH. ................................................. 27 1 1. INTRODUCCIÓN El café es la segunda bebida más consumida a nivel mundial; con el paso del tiempo han ganado importancia en el mercado, los cafés diferenciados, de alta calidad, orgánicos y especiales (Pérez et al. 2015). El segmento de cafés especiales representa aproximadamente el 10% del consumo mundial, y según expertos el consumo de cafés especiales y con denominación de origen, continuará creciendo exponencialmente (Borém et al. 2016). La producción de café especial en Panamá se origina desde el año 1996, buscando un factor diferenciador (SCAA 2019). Para producir cafés especiales, los productores han desarrollado un sinnúmero de procesos, para tratar de desarrollar atributos positivos en sus cafés, controlando variables como el manejo en campo o el beneficiado. Diversos factores determinan la calidad del café, entre éstos se encuentran: las condiciones climáticas, el suelo, el tipo de manejo del cultivo, procesamiento postcosecha y la forma de preparación de la bebida (Puerta et al. 2016). El beneficio húmedo es el que más se acostumbra en los tipos de café de procedencia arábica; el proceso inicia con la recolección o cosecha de café cereza, al igual que una adecuada selección y limpieza, a partir de aquí se derivan varias etapas: despulpado, remoción del mucílago, lavado, secado, trillado, tostado y molienda (Giraldo et al. 2017). La variedad Caturra es reconocida por su porte bajo, alta capacidad productiva, susceptibilidad a la roya (Hemileia vastratrix) y su potencial a excelente calidad de taza (Enríquez y Chamorro 2017). Para obtener una buena percepción sensorial, se han desarrollado estrategias o innovación en los procesos, como adición de microbiota, que causa cambios en la composición química y llevan a desarrollar sabores y aromas que favorecen el puntaje final en la catación (Folmer 2014). De igual forma, el beneficio y los pretratamientos del café verde antes del tostado, como procesos de fermentación abierta o cerrada (Cruz y Pivaral 2018), maceración carbónica e inoculación (Samaniego 2019), influyen en su calidad sensorial. Se resalta la importancia de la fermentación, ya que en este proceso intervienen microorganismos que influyen en la calidad de taza (Mendoza 2019). Se han desarrollado tecnologías que permiten controlar condiciones como temperatura, calidad y sanidad del café, al igual de la duración del proceso (Puerta et al. 2015). Los procesos de fermentación han sido usados para dar sabor, aroma y conservar la calidad de alimentos y bebidas (López et al 2017). A medida que se han desarrollado investigaciones enfocadas en la fermentación, se ha pasado de una fermentación tradicional a una fermentación controlada, obteniendo bebidas de calidad superior con sabores y aromas muy peculiares, que agregan valor y permiten establecer una calidad constante en el producto (Cruz y Pivaral 2018). Mediante una fermentación controlada se desarrollan sabores especiales que deben ser conservados, por medio de prácticas adecuadas de lavado, secado, almacenamiento y tostado (Puerta et al. 2015). La fermentación es considerada un proceso biológico que consolida las ropiedades del producto, dentro de los factores más determinantes se encuen tra: la presencia de levaduras, el tiempo y la temperatura (Cruz et al. 2019). En la etapa de fermentación ocurren varias reacciones químicas; las levaduras y las bacterias presentes en el mucílago, mediante sus enzimas naturales oxidan parcialmente los azúcares; debido a esto se generan cambios en color, olor, densidad, acidez, pH y actividad de agua, los cuales se consideran relevantes en la calidad final y se relacionan directamente con el tiempo de duración de la etapa fermentativa (Córdoba y Guerrero 2016). 2 Durante el proceso de la fermentación en café, intervienen microorganismos, los cuales debido a su actividad degradan el sustrato a fermentar y generan cambios químicos. La mayoría de los microorganismos que actúan en la fermentación del café suelen ser mesófilos, y entre estos la mayoría son levaduras que crecen en un rango entre 5 y 39 °C, siendo de 28 a 35 °C la temperatura óptima para su crecimiento (Orozco 2019). Según Puerta (2012), las levaduras fermentadoras del mucílago que se encuentran presentes en la fermentación son Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, C. tropicalis, C. krusei, C. lipolytica, C. parasilopsis y C. pintolopesii, las cuales producen etanol y CO2, y las no fermentadoras como Cryptococcus terreus, Rhodotorula rubra y R. glutinis. A medida que el tiempo de fermentación aumenta, el pH de la masa fermentable disminuye y la cantidad de bacterias Gram negativas disminuye hasta desaparecer, como consecuencia de esto se obtiene un medio ácido que favorece e impulsa el crecimiento de bacterias Lactobacillus y levaduras que son predominantes en la fermentación del café (Puerta et al. 2015). Un café especial es aquel que obtiene una puntuación de catación mayor a 80, por lo cual podría acceder a un exclusivo mercado, asegurando un precio superior al del café tradicional (Velásquez y Trávez 2019). Este segmento del mercado de café define sus precios, en su mayoría, por medio de subastas a través de la Specialty Coffee Asociation (SCAA) y la Aliance for Coffee Excellence (ACE), además de las negociaciones independientes entre exportadores e importadores de este tipo de café (SCAA 2015). Según Madera y Torres (2016) en Panamá hay 43 empresas productoras de café Specialty, de las cuales sólo ocho son dueños de las marcas, dentro de las que está café Kotowa. El proceso de fermentación permite al caficultor diferenciar su café y entrar al mercado de especialidad, debido a que puede controlar las condiciones que le permitan desarrollar las características a resaltar y de esta forma dar un valor agregado al producto y posicionarse como café diferenciado (Puerta et al. 2015). Debido a la importancia de este proceso, es relevante investigar o evaluar las condiciones de fermentación y su efecto en la calidad de taza y las variables que influyen en la calidad final del café variedad Caturra. Por lo tanto, los objetivos del estudio fueron: • Determinar el comportamiento de: pH, sólidos solubles y temperatura interna durante la fermentación. • Cuantificar los microorganismos que intervienen en el proceso de fermentación controlada. • Evaluar el efecto de la fermentación controlada e inoculación en las características químicas y sensoriales del café. 3 2. MATERIALES Y MÉTODOS Ubicación del estudio. El estudio se realizó en la Finca Kotowa, ubicada en el lado Noreste de Boquete, Panamá, a 1,300- 1,400 msnm; con una precipitación promedio de 2,250 mm con lluvias principalmente del Pacífico, de mayo a noviembre y algunas del Atlántico de diciembre a febrero. La temperatura de la zona varía entre 15 y 26 ºC. Se empleó café variedad Caturra de diferentes lotes de la Finca Duncan, se les dio seis condiciones: natural sin enjuague y lavado (despulpado con miel), con o sin inoculación de levaduras y de igual manera se emplearon dos tratamientos control que no llevaron proceso de fermentación. La fermentación controlada se realizó en la Finca Río Cristal ubicada en el lado Norte de Boquete, con una altitud de 1,700-1,850 msnm y una precipitación promedio de 2,550 mm con una temperatura entre 13 y 22 ºC. El secado y catación se realizaron en las instalaciones de la Finca Kotowa. Los análisis microbiológicos se realizaron en el Centro de Investigación en Recursos Naturales (CIRN), de la Universidad Autónoma de Chiriquí (UNACHI) y los químicos se realizaron en el Laboratorio de Alimentos Aoxlab, en Medellín, Colombia. Diseño experimental. Se utilizó un Diseño Completamente al Azar, para los análisis microbiológicos y químicos. Los análisis fisicoquímicos y sensoriales se evaluaron mediante un diseño de Bloques Completos al Azar. Se empleó un arreglo factorial 2 × 3 dos procesos lavado y natural, en tres condiciones de fermentación con o sin inóculo y tratamiento control sin fermentación, con tres repeticiones. Se hicieron muestreos a los cuatro tratamientos fermentados con tres repeticiones cada uno, al iniciar y al finalizar el proceso, los cuales fueron analizados a nivel microbiológico, para un total de 24 unidades experimentales. Al inicio y durante los seis días del proceso se tomaron muestras líquidas de cada tratamiento fermentado, para medición de pH, temperatura interna y sólidos solubles, para las tres repeticiones un total de 84 unidades experimentales. Se realizaron análisis químicos (café verde) y sensoriales (café tostado) a los seis tratamientos en las tres repeticiones, sumando un total de 18 unidades experimentales (Cuadro 1). Cuadro 1. Descripción de tratamientos. Proceso Fermentación No Sí Con inóculo Sin inóculo Natural 1T1 T2 T3 Lavado T4 T5 T6 1Identificación de cada tratamiento. 4 Beneficio del café. El café fue cosechado en diferentes lotes de la Finca Kotowa ubicada en Boquete, Panamá a 1,700- 1,800 msnm. Se empleó la variedad de café Caturra, tipo arábica, cosechado en su punto óptimo de corte, el café fue recolectado en sacos limpios para disminuir la contaminación a nivel microbiológico de las cerezas. En cada repetición, la muestra homogénea cosechada se dividió en seis submuestras de 7 kg, obteniéndose tres muestras de café natural y tres muestras de café lavado. Para el estudio, se dividió el lote en café natural, que pasó a fermentación en bolsa y saco y café lavado, el cual después de ser cosechado, pasó a ser despulpado en una despulpadora marca Penagos y empacado en bolsa y saco despulpado con miel. A cada tratamiento se le dio un proceso diferente: natural sin enjuague y lavado (despulpado con miel), cada uno con y sin inoculación de levaduras, caracterizadas por maximizar el proceso de fermentación y realzar las características sensoriales del café y dos tratamientos control sin fermentación. La preparación del inóculo se realizó por medio de una dilución de la levadura en agua a 30 °C en una relación de 1:10 (g/mL). El inóculo fue añadido a la masa al inicio del proceso, la proporción empleada por tratamiento se determinó siguiendo la relación 1:1000 (g/g) de levadura: café, la fermentación se realizó en bolsa y saco, con la instalación de una apertura con tapón en la base, para la extracción de las muestras líquidas para los análisis fisicoquímicos y microbiológicos. Al iniciar el proceso y cada 24 horas hasta finalizar la fermentación al día 6 , se realizaron extracciones de muestras líquidas, para realizar mediciones de temperatura interna de la masa fermentable, pH con el método AOAC 981.12 (AOAC 2005) y sólidos solubles con el método AOAC 983.17 (AOAC 2005), por medio de un termómetro digital con sonda marca Acu-rite, potenciómetro marca Dr. Meter pH-100 y refractómetro portátil marca HHTEC, respectivamente. Al finalizar el tiempo de fermentación; los dos tratamientos de café natural con y sin inoculación, pasaron directamente a secado. Los dos tratamientos de café lavado (despulpado con miel, con y sin inóculo), se les hizo un enjuague mediante agitación, con el objetivo de remover el mucílago del café fermentado; se enjuagó hasta el punto donde el agua se tornó cristalina, lo que demostró que el mucílago fue removido completamente. Después del enjuague los tratamientos pasaron a secado. Análisis microbiológico. Se tomaron muestras líquidas de aproximadamente 5 mL que fueron extraídas de la masa fermentable al inicio y final de la fermentación (0 y 6 días). Se efectuó el recuento de los microorganismos que intervinieron en la fermentación controlada, hongos y levaduras. Se realizó la esterilización de la cristalería, en autoclave a 121 °C, 18 lb de presión por 15 min. Se depositaron 9 mL de agua destilada esterilizada en cada tubo, las muestras se agitaron en el vórtex para homogenizarlas y se pasó 1 mL de muestra al primer tubo, que fue la solución madre para las demás diluciones, se realizaron diluciones en serie hasta10 -6. Se empleó la técnica de vaciado en placa, con el medio Agar Papa Dextrosa (PDA, por sus siglas en inglés), se sembraron las diluciones10-3 y10-6. Una vez que se solidificó el medio, se dejaron incubando los platos durante 5 días, para el posterior recuento de hongos y levaduras. 5 Secado. Se realizó un secado controlado estándar para el café en un cajón deshumidificador con termostato para control de temperatura (25-30 °C), hasta reducir la humedad del grano a 11%, que se verificó con un medidor de humedad marca SINARTM AgriPro Modelo 6095. Descascarillado. Se realizó el trillado (descascarillado) para café utilizando la trilladora marca JM Estrada SA. de la finca, se limpió la maquinaria entre trillas para evitar contaminación cruzada, siguiendo el proceso estándar de la finca Kotowa. Análisis químicos. Se emplearon muestras de 100 gr de café verde, de cada tratamiento, que fueron debidamente empacadas en bolsa aluminizada con sellado térmico, para conservar sus propiedades y que pudieran ser transportadas hacia Medellín, Colombia, donde fueron analizadas en el laboratorio de análisis de alimentos Aoxlab. Contenido de fenoles totales. PROC-TC-127 Versión 1 2018.01.09 (Folin Ciocalteu). La cuantificación se hizo por medio de interpolación en curva de calibración que va desde aproximadamente 10 µg/mL hasta 50 µg/mL usando como patrón ácido gálico y reactivo de Folin Ciocalteu. Se pesaron aproximadamente 1.0 g de café verde en 10 mL de agua, se mezcló en el vórtex por 1 min, posteriormente se tomó una alícuota de la muestra y se le adicionó el reactivo de Foling Ciocalteu y Carbonato de Sodio para catalizar la reacción. Este análisis se basa en que los compuestos fenólicos reaccionan con el reactivo de Folin-Ciocalteu, a pH básico, dando lugar a una coloración azul. Se esperó a que desarrollara color por una hora, luego se leyó la absorbancia a 720 nm y se interpoló la absorbancia obtenida de la muestra contra la curva de calibración del patrón de ácido gálico. Cafeína por cromatografía líquida. NTC ISO 20481. Para llevar a cabo la extracción de la cafeína a partir de las muestras de café verde se pesaron 0.5 g de cada una de las muestras. A continuación, se introdujo cada muestra en un matraz Erlenmeyer al que se le añadieron 0.5 g de MgO y 50 mL de agua bidestilada, se agitó y se llevó a un baño a 90 ºC con agitación suave durante 20 min. Transcurrido este tiempo, las muestras se centrifugaron y filtraron empleando un filtro de celulosa regenerada de 0.45 µm. las disoluciones de los patrones se trasvasaron a un vial de cromatografía. Por último, los viales se introdujeron en el muestreador automático del equipo, donde se inyectaron 20 µL en el equipo cromatográfico. Las condiciones cromatográficas empleadas fueron: “High Performance Liquid Chromatography” (HPLC), con “Photometric Diode Array” (PDA), detector de 272 nm, fase móvil A: metanol, fase móvil B: agua, modo de elución: isocrático 25% metanol. La cuantificación se realizó por medio de interpolación en curva de calibración (1.5 µg/mL hasta 25 µg/mL). 6 Tostado y molienda. Se siguió el protocolo establecido por la SCAA para tostado y molienda de café, para la posterior catación. El tiempo de tostado fue de 7 a 10 minutos para cada muestra de 100 g para catación; se utilizó una tostadora marca Joper, modelo: CRG 100-1. Posteriormente se dejaron reposar las muestras, y se empacaron debidamente en bolsas plásticas para evitar la pérdida de las propiedades del café. La molienda de las muestras para catación se realizó en el molino de la Finca Kotowa marca Grindmaster modelo 810, justo antes de la catación, siguiendo lo establecido por la SCAA (2019). Análisis sensorial. Los análisis sensoriales se llevaron a cabo en la sala de cataciones de Kotowa Coffee y lo realizaron tres catadores, siguiendo los protocolos y métodos descrito por la SCAA (2019). Para la preparación de la infusión se usaron 12 g de café molido para cada taza, los cuales fueron pesados en una balanza marca Ohaus, modelo CS2000. Luego se preparó la mesa para la catación, depositando las muestras en las tazas para catación, marca Corona debidamente rotuladas con números de tres dígitos, para evitar sesgos en el análisis sensorial. Los catadores determinaron la fragancia de las muestras en seco (café molido), posteriormente se calentó agua hasta punto de ebullición en una tetera marca Proctor Silex modelo K4070Y y se proced ió a verter el agua caliente a las tazas con las muestras de café molido, para que los catadores evaluaran aroma, cuerpo, acidez, sabor y regusto de las muestras analizadas. Análisis estadístico. Los datos fueron analizados con el programa “Statistical Analysis System” (SAS Versión 9.6®), por medio de un Análisis de Varianza (ANDEVA), con una separación de medias ajustadas (LS- MEANS) y una separación de medias Duncan a un nivel de significancia del 95%. 7 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Temperatura de la masa fermentable. Los microclimas privilegiados con los que cuenta el territorio panameño lo hacen sumamente apto para la producción de café Specialty con tendencia hacia la exportación (Madera y Torres 2016). Las áreas productivas cafeteras de altura del país se localizan principalmente en zonas como Renacimiento, Boquete, Volcán y Cerro Punta, con altitudes que van cercanas a los 1,000 msnm, hasta alcanzar los 2,500 msnm. Boquete, Volcán y Cerro Punta representan cerca del 55% de la producción de café en la Provincia de Chiriquí (Valdespino y Jaramillo 2011). El sector cafetalero de Boquete se ha logrado destacar en la región en los últimos años por los resultados exitosos que ha obtenido su café, en distintas competencias tanto a nivel local como internacional; estos resultados se deben entre otras cosas a condiciones agroclimáticas y al manejo cultural (Madera y Torres 2016). La interacción del proceso, con el inóculo y el tiempo influyó de manera significativa (P < 0.05) en las variaciones de temperatura interna de la masa fermentable. La temperatura al inicio del proceso de fermentación fue mayor, debido al calor de campo del producto (20 °C). Se presentó una tendencia decreciente durante la fermentación (Figura 1), presentando una menor disminución al día uno y del dos al seis no se evidenciaron cambios de temperatura (P > 0.05). Las variaciones se debieron posiblemente, a que la temperatura de la masa fermentable depende hasta cierto punto de la temperatura y las condiciones ambientales donde se lleva a cabo el proceso de fermentación; que además influye en la proporción y tipo de aromas y sabores de la bebida, así como, las cantidades de sustancias volátiles del café tostado y del mucílago fermentado (Puerta y Echeverri 2015). La zona de Boquete presenta temperaturas que oscilan entre 14 y 22 °C y precipitaciones que van desde los 2,000 a 5,000 mm, al igual que suelos derivados de cenizas volcánicas con un horizonte superficial negro, de unos 45 cm de profundidad, ricos en materia orgánica (Valdespino y Jaramillo 2011). La temperatura de fermentación en este estudio, osciló entre 13 y 20 °C, para favorecer la calidad final del café; ya que en estudios como el de Puerta y Echeverri (2015) al realizar análisis sensorial a diferentes muestras de café, encontraron que a una temperatura promedio de fermentación de 15 ºC se presentó un incremento de sabores especiales, comparado con fermentaciones a temperaturas de 18 a 26 ºC; además, a mayores temperaturas se pueden desarrollar sabores más fuertes y menos favorables como vinagre o umami. En este estudio, la temperatura de fermentación (13 -20 °C), permitió alargar el tiempo de fermentación tradicional (48 a 60 h) hasta 144 h. Como lo explicaron Puerta y Ríos (2011). La temperatura tuvo un efecto en la velocidad de las degradaciones del mucílago de café, y esto hizo que las reacciones ocurrieran lentamente. La temperatura externa afectó el metabolismo mismo de los microorganismos, la velocidad y la clase de productos generados en la fermentación del café; de esta forma la actividad microbiana estuvo relacionada directamente a la temperatura interna de la masa fermentable (Puerta 2012). 8 Figura 1. Temperatura de la masa durante la fermentación. *Indica que no hubo diferencia estadística. a-b Valores seguidos de una letra diferente en cada día, representan diferencia estadística entre tratamientos (P < 0.05). pH. El comportamiento del pH sirvió como un indicador del proceso de fermentación, asociado a la evolución de este, y, por lo tanto, se convirtió en una herramienta para el control del tiempo adecuado de fermentación del café, sin generarse problemas en la bebida, asociadas a este proceso (Córdoba y Guerrero 2016). El pH presentó una tendencia a disminuir en todos los tratamientos durante el proceso de fermentación (Cuadro 2). Esto puede deberse a un aumento de la acidez de la masa fermentable, que coincide con la producción de ácidos orgánicos a partir de los azúcares y del rompimiento de pectinas presentes en el mucílago (Peñuela et al. 2014; Córdoba y Guerrero 2016). El proceso, inóculo y el tiempo, al igual que su interacción por pares tuvo un efecto significativo (P < 0.05) en el comportamiento del pH, sin embargo, al correlacionar los tres no se presentó diferencia estadística (P > 0.05). Se obtuvo un pH menor en los tratamientos de café natural en comparación con los lavados, al inicio del proceso; ya que en la pulpa se concentran los azúcares y la acidez del fruto y debido a la presencia de enzimas provenientes de la pulpa, junto con la acción de los microorganismos se acidifica el medio (Arellano et al. 2014). El tratamiento que llevó una fermentación natural con inoculación de levaduras presentó una d isminución del pH entre el día uno y dos ya que, durante la fermentación del café, el pH del sustrato disminuye más rápido en las primeras 20 horas por la formación y disociación de ácidos como son el ácido láctico, ácido acético y la acetificación del alcohol (Orozco 2019). 13.00 16.00 19.00 22.00 0 * 1 2 * 3 * 4 * 5 * 6 T em p er at u ra ° C Tiempo de fermentación (días) Lavado con inóculo Lavado sin inóculo Natural con inóculo Natural sin inóculo b a a b 9 En la fermentación se generan metabolitos como el ácido láctico y consumo de sustrato a través del tiempo, que lleva a la modificación en el pH de la masa de café (Córdoba y Guerrero 2016). Se presentó una disminución del pH en los tratamientos lavados, en especial en el tratamiento de café lavado sin inoculación en las primeras 48 h, esta variación se debió probablemente a que el mucílago fue removido casi en su totalidad, lo cual llevó a producir ácidos mayor potencia, como el ácido láctico (Puerta 2012). Además, se obtuvo una disminución del 11.5% de pH en café natural, y del 20% en café lavado, durante el periodo de fermentación; ya que el pH del mucílago de café fermentado aumenta debido a la fermentación del ácido láctico, a la eliminación del dióxido de carbono, a la producción de otros ácidos más débiles, a sales y sustancias básicas que se disuelven por otras degradaciones y a mayor cantidad de azúcares disueltos en la mezcla, el pH puede aumentar (Puerta 2012; Orozco 2019). Cabe destacar que al finalizar la fermentación no hubo diferencia significativa entre los tratamientos (P > 0.05), a excepción del lavado sin inóculo que presentó menor pH, debido a que en los demás tratamientos las levaduras posiblemente produjeron ácidos de menor potencia resultando en un pH mayor (Velmourougane 2013). Al final de la fermentación hubo diferencia significativa entre los tratamientos lavados, sin embargo, en los tratamientos de café natural no se presentaron diferencias. La diferencia en el comportamiento respecto al proceso se evidenció en el tipo de sustrato ya que en el café natural hubo presencia de pulpa, la cual está compuesta de azúcares, pectinas, fibra y otros compuestos químicos que se relacionan con el resultado final de estas degradaciones (Días 2011). Las variaciones de pH o acidificación del medio están relacionadas a la actividad microbiana y a la actividad enzimática (Puerta 2015). Debido a adición de levaduras a los tratamientos inoculados se pudo haber inhibido o modulado el crecimiento de otros microorganismos en el medio fermentativo por su competencia por nutrientes, es por esto por lo que se presentó una diferencia en el metabolismo de azúcares y los tipos de ácidos producidos a partir de los microorganismos presentes al relacionar la fermentación de los tratamientos que fueron inoculados y los que no fueron asistidos (Lallemand 2017). Sólidos solubles. Se encontró una diferencia significativa (P < 0.05) en la concentración de sólidos solubles, al inicio de la fermentación y entre los procesos naturales y lavados (Cuadro 3). Esto puede ser explicado debido a que, en el fruto de café, los sólidos solubles están concentrados en el mucílago y la pulpa, que contienen principalmente: sacarosa, glucosa, fructosa, ácido málico, láctico, acético, succínico, oxálico, fórmico, fosfórico, galacturónico, etanol y otros alcoholes, ésteres, polisacáridos, proteínas y cenizas (Puerta 2012). El proceso, inóculo y el tiempo, al igual que su interacción por pares tuvo un efecto significativo (P < 0.05) en el comportamiento de los sólidos solubles, sin embargo, al correlacionar los tres no se presentó diferencia estadística (P > 0.05). Los tratamientos que fueron inoculados presentaron una tendencia decreciente, durante el proceso de fermentación, lo cual concuerda con lo propuesto por Puerta (2012), quien estableció que los sólidos solubles en sistemas de fermentación de café sin agua e inoculados, a través del tiempo, muestran un decrecimiento exponencial a través del tiempo y los cambios son más lentos al disminuir la temperatura externa. Además, la levadura fue activada mediante la rehidratación, y su actividad inició desde la inoculación, por lo que su consumo del sustrato fue más acelerado reflejado en una reducción en sólidos solubles, en comparación con los tratamientos que no fueron inoculados. 10 Cuadro 2. Comportamiento del pH durante el periodo de fermentación. 1Proceso fermentativo. 2Explica si fue asistido o no con inóculo. 3Promedio y desviación estándar de tres repeticiones. 4Coeficiente de variación expresado en porcentaje. a-cValores seguidos de una letra diferente en cada columna, representan diferencia estadística entre tratamientos (P < 0.05). w-zValores seguidos de una letra diferente en cada fila, representan diferencia estadística (P < 0.05). Cuadro 3. Comportamiento de sólidos solubles durante el periodo de fermentación. 1Proceso fermentativo. 2Explica si fue asistido o no con inóculo. 3Promedio y desviación estándar de tres repeticiones. 4Coeficiente de variación expresado en porcentaje. a-cValores seguidos de una letra diferente en cada columna, representan diferencia estadística entre tratamientos (P < 0.05). w-zValores seguidos de una letra diferente en cada fila, representan diferencia estadística (P < 0.05). 1Proceso 2Inóculo 3Tiempo (días) 0 1 2 3 4 5 6 Lavado Con 5.23 ± 0.02aw 4.84 ± 0.19ax 4.53 ± 0.21aby 4.43 ± 0.12by 4.44 ± 0.15by 4.34 ± 0.14by 4.29 ± 0.16ay Sin 5.23 ± 0.02aw 4.73 ± 0.28ax 4.26 ± 0.15cy 4.12 ± 0.12cyz 4.13 ± 0.11cyz 4.05 ± 0.17cz 4.09 ± 0.15byz Natural Con 5.01 ± 0.06bw 4.45 ± 0.04byz 4.67 ± 0.16ax 4.68 ± 0.16ax 4.66 ± 0.12axy 4.57 ± 0.18axyz 4.48 ± 0.16ayz Sin 5.01 ± 0.06bw 4.66 ± 0.27ax 4.47 ± 0.06bxy 4.46 ± 0.06bxy 4.48 ± 0.02abxy 4.39 ± 0.08by 4.39 ± 0.07ay 4CV (%) 3.95 1Proceso 2Inóculo 3Tiempo (días) 0 1 2 3 4 5 6 Lavado Con 8.67 ± 0.57bw 8.33 ± 1.53cwx 8.00 ± 1.00bwxy 7.67 ± 1.15cwxy 7.00 ± 0.00bxy 6.67 ± 0.57by 6.67 ± 0.57cy Sin 8.67 ± 0.57by 13.3 ± 1.53bw 14.7 ± 0.57aw 11.7 ± 2.08bx 11.7 ± 1.53ax 9.67 ± 0.57ay 8.67 ± 0.57by Natural Con 10.3 ± 0.57aw 8.33 ± 1.53cx 7.00 ± 0.00bx 8.00 ± 0.00cx 8.00 ± 1.00bx 7.00 ± 0.00bx 7.33 ± 0.57bcx Sin 10.3 ± 0.57ay 15.0 ± 0.00aw 14.7 ± 0.57aw 14.0 ± 0.00awx 13.0 ± 1.00ax 10.3 ± 0.57ay 11.3 ± 0.57ay 4CV (%) 8.94 11 En los tratamientos que no llevaron inóculo, se observó que hubo variaciones y se presentó una mayor concentración de sólidos (P > 0.05) a partir de las 24 horas de fermentación. La medición de sólidos solubles es muy general pues incluye los carbohidratos, ácidos orgánicos, proteínas, grasas y minerales del fruto y en la ruptura de pectinas se libera una diversa cantidad de estos sólidos (Puerta y Ríos 2011) que luego fueron medidos por este método. Debido a que en la fermentación se produce por la degradación de compuestos químicos además de los azúcares, esto puede conllevar a la generación de diferentes tipos de ácidos, de mayor o menor potencia que se ve reflejado en las variaciones de pH; como lo explicado por Puerta y Echeverri (2015), quienes encontraron que durante la fermentación del café ocurren diferentes procesos bioquímicos, en los cuales las enzimas producidas por las levaduras y bacterias, presentes en el mismo mucílago fermentan y degradan sus azúcares, lípidos, proteínas y ácidos, y los convierten en alcoholes, ácidos, ésteres y cetonas. Hongos y levaduras. Los microorganismos responsables de la fermentación son especies nativas que se originan de la contaminación natural del proceso, incluyendo levaduras, bacterias y hongos filamentosos (Iamanaka et al. 2014; Melo et al. 2015). En este estudio, las levaduras y hongos se encontraron presentes desde el inicio hasta el final de la fermentación (Cuadro 4). Según Huch y Franz (2015), la microbiota presente en el café depende de aspectos como: variedad de la planta, contenido de humedad del grano, método de procesamiento, competencia de sustrato, capacidad enzimática de las especies colonizadoras y su actividad antimicrobiana. Arcos (2017), encontró especialmente la levadura Saccharomyces cerevisiae y los hongos Aspergillus luchuensis y Penicillium sp durante el proceso fermentativo. La población de hongos y levaduras no presentaron diferencias (P < 0.05) entre tratamientos, sin embargo, este comportamiento en los resultados, pudo ser causado por la alta variación en el experimento, ocasionado probablemente por error humano en laboratorio y la naturaleza del estudio, ya que al ser un experimento de campo, el control de las condiciones para el desarrollo de los microorganismos en la fermentación es más difícil, por lo que factores exógenos como la temperatura y humedad relativa, pudieron influir en estas variaciones en el recuento de los microorganismos. No existen reportes de que los hongos intervengan en la degradación del mucílago de las frutas de café (Schwan et al. 2015). Los hongos frecuentes en el café y sus partes son del género Aspergillus, Penicillium, Fusarium y Trichoderma (Puerta et al. 2015). Sin embargo, en un estudio se encontró que la pulpa del café es un medio apto para el desarrollo de microorganismos como hongos y bacterias, debido a su alto contenido de humedad, encontrando especies como: Aspergillus niger, Aspergillus ocrhaceus, actinomycetos, Penicillium sp, Cladosporium sp y levaduras (Payán 2011, Garrido et al. 2018). Cuando el proceso de fermentación no retira completamente el mucílago, se dificulta el proceso de secado y se crea un ambiente propicio para el desarrollo de hongos, los cuales pueden producir compuestos químicos como las micotoxinas y ácidos (propiónicos y butíricos), que confieren sabores no deseados, como el sabor a cebolla por ejemplo (Schwan et al. 2015). En cuanto a la presencia de hongos durante la fermentación, Vásquez (2004), comentó que si el mucílago no se remueve se produce una capa oscura en el grano que permite el crecimiento de hongos en el mismo (el mucílago tiene un alto contenido de azúcar lo cual estimula el crecimiento de hongos); estos defectos disminuyen la calidad del café y su posibilidad de exportación. 12 Cuadro 4. Recuento de hongos y levaduras al inicio y al final de la fermentación. 1Proceso Inóculo Hongos (Log/mL) Levaduras (Log/mL) Lavado 2Inicio 2.83 ± 1.51 a 1.76 ± 1.51 a 3Con 1.76 ± 1.51 a 2.66 ± 1.33 a 3Sin 2.43 ± 1.22 a 3.80 ± 0.14 a Natural Inicio 3.30 ± 0.42 a 1.77 ± 1.42 a Con 1.66 ± 1.83 a 1.79 ± 1.30 a Sin 0.70 ± 0.00 a 2.80 ± 1.38 a 4CV (%) 49 65 1Proceso fermentativo. 2Recuento inicial. 3Recuento final. 4Coeficiente de variación expresado en porcentaje. a Valores seguidos de una misma letra en cada columna, son estadísticamente iguales. (P > 0.05). Las levaduras son organismos eucariotas, consideradas hongos unicelulares con gran diversidad de tamaños, formas y colores, de mayor tamaño que las bacterias, alcanzando un diámetro máximo entre 4 y 5 μm; la mayoría de las levaduras toleran un rango de pH entre 3 y 10, pero les resulta favorable un medio ligeramente ácido con un pH entre 4.5 a 6.5 (Suárez et al. 2016). Las levaduras son las encargadas de metabolizar y acelerar el proceso de fermentación, por lo que es fundamental mantener condiciones de temperatura mayores (condiciones mesófilas) para reducir el tiempo de fermentación del café (Orozco 2019), por lo anterior es posible deducir que, debido a las temperaturas bajas de fermentación, se redujo la actividad de las levaduras lo que permitió alargar el tiempo de fermentación hasta 144 horas. La población de levaduras no presentó diferencias (P > 0.05), lo que concuerda con lo encontrado por Cruz y Pivaral (2018), en fermentación en un sistema cerrado, donde no se presentaron variaciones en el conteo de levaduras; sin embargo, en sistema abierto sí encontraron diferencias. Estos resultados discrepan de lo encontrado por Samaniego (2019), debido probablemente a que empleó maceración carbónica que propició un ambiente anaeróbico, al inhibir el crecimiento de otros microorganismos aeróbicos, favoreció el crecimiento de las levaduras. Velmourougane (2013) también reportó un aumento en la población de levaduras en la fermentación de café. Fenoles totales y cafeína. Los compuestos fenólicos son ésteres que abarcan una amplia familia de compuestos que incluye flavonoides, ácidos fenólicos y taninos, de los cuales, los taninos equivalen a un porcentaje cercano al 95% del total de los fenoles presentes en las partes del fruto del café (Cuesta y Correa 2018). Además, uno de los grupos de compuestos fenólicos más importantes son los conjugados de ácido quínico, conocidos como ácidos clorogénicos (CGA), los granos de café poseen importantes cantidades de ácidos clorogénicos, los cuales tienen una marcada influencia en la calidad del café y, además, contribuyen a su aroma y sabor (Chaves y Esquivel 2019). La composición fenólica de las especies de coffea arábica es del 8%, y en el caso del café variedad Caturra se ha reportado 13 que tiene un contenido promedio de 6.97% de ácido clorogénico (Puerta 2011). La naturaleza de los fenoles varía desde moléculas simples como los ácidos fenólicos, hasta compuestos altamente polimerizados como los taninos (Figueroa et al. 2015). Se encontró que independientemente del proceso, la inoculación no tuvo influencia (P > 0.05) en la cantidad de fenoles totales (Cuadro 5), sin embargo, en algunos estudios como el realizado por Figueroa y colaboradores (2015) y Herrero (2017), se determinó que la composición fenólica se modificó durante la fermentación por la actividad de las levaduras, las cuales son capaces de metabolizar algunos de los compuestos fenólicos presentes. En café natural, se encontró un mayor (P < 0.05) contenido fenólico en los tratamientos que fueron fermentados y se presentó un incremento del 61.5% en relación al que no fue fermentado. Debido probablemente a que en un mayor tiempo de fermentación los microorganismos actúan sobre la pulpa de café, lo que permite la extracción de un mayor número de compuestos fenólicos, porque el etanol producido actúa como un solvente para su obtención (Figueroa et al. 2015). La concentración de fenoles varía de acuerdo con la estructura, la mayor concentración se encuentra en la pulpa, en la piel y en el mucílago, respectivamente (Cuesta y Correa 2018); esto explica que en el proceso de lavado se mantuvo estable el contenido de fenoles presentes. En un estudio en cafés comerciales realizado en Panamá, Fonseca y colaboradores (2018) encontraron que el contenido de fenoles totales era mayor para el café puro variedad arábica, como el Geisha que obtuvo 36 a 46 mg/g. Esto coincide con lo encontrado en el presente estudio en café Caturra, el cual presentó una concentración menor a la de Geisha (18-29 mg/g). De acuerdo con esto, se podría inferir que los fenoles tienen influencia en el perfil de taza final. Cuadro 5. Determinación del contenido de fenoles totales y cafeína. 1Proceso 2Inóculo Fenoles totales mg/100 g Cafeína mg/100 g 3Control 1827 ± 447 c 1109 ± 166 a Lavado Con 2035 ± 488 bc 1050 ± 67 a Sin 2089 ± 529 bc 1068 ± 85 a Control 1805 ± 849 c 1075 ± 62 a Natural Con 2646 ± 1105 ab 1169 ± 16 a Sin 2933 ± 1062 a 1135 ± 51 a 4CV (%) 20.08 8.22 1Proceso fermentativo. 2Describe si el proceso fermentativo se asistió o no.3Indica que no llevó proceso de fermentación. 4Coeficiente de variación expresado en porcentaje. a-cValores seguidos de una letra diferente en cada columna, representan diferencia estadística entre los seis tratamientos (P < 0.05). Según Naranjo y colaboradores (2011), los granos de café contienen antioxidantes como ácidos fenólicos (cafeíco y clorogénico), polifenoles, cafeína y otros alcaloides; el contenido de estos componentes varía entre especies, lugar de origen y le proveen al café la calidad de alimento 14 funcional y nutracéutico. La cafeína es uno de los componentes más importantes, ya que contribuye en el amargor y en el efecto estimulante de la bebida; si es consumida moderadamente puede tener beneficios, como el aumento de disponibilidad de energía, concentración y disminución de la fatiga (Cheng et al. 2016). Independientemente de la inoculación y la fermentación no hubo diferencia significativa entre los tratamientos (P > 0.05), ya que no se ve afectada por los procesos y depende de la variedad del café y las condiciones de producción (Naranjo et al. 2011). El contenido de cafeína de los tratamientos estuvo entre 1.05-1.1 g/100 g (Cuadro 5), que corresponde al rango encontrado por Farah (2012) para café Arábica que está entre 0.9-1.3 g/100 g con un contenido menor de cafeína en comparación con el Robusta que tiene una concentración entre 1.5-2.5 g/100 g, sin embargo, el arábica es más popular por su bajo contenido de cafeína, teniendo mayor aceptación por los consumidores. Análisis sensorial. La catación también llamada evaluación sensorial de la calidad del café o prueba de taza, es el método usado para medir la intensidad de características sensoriales como acidez, dulzor, sabor, aroma y calidad total del café (SCAA 2015). Un café especial se caracteriza por el equilibrio de los atributos de acidez, cuerpo y amargura que están directamente relacionados con el proceso de beneficio, el tostado y la forma de preparación del café (Barrera et al. 2019). Según Cabrera y Burbano (2018) las características sensoriales del café dependen de la composición química del grano (contenidos de cafeína, trigonelina, lípidos, ácidos clorogénicos, oligosacáridos y polisacáridos); que, a su vez, depende de la especie, la variedad, el estado de desarrollo del fruto y el ambiente o condiciones de producción. El perfil sensorial del café depende de la calidad desarrollada en los procesos agronómicos y en el beneficio, al igual que en el tostado donde se generan cambios físicos y químicos que promueven el desarrollo de componentes volátiles, como el aroma, el cual es un atributo característico del café (Santos et al. 2016). Se puede considerar que la formación del aroma característico, sabor y color resulta primero de la disminución drástica de los componentes del café verde, como la sacarosa, aminoácidos libres, ácidos clorogénicos y trigonelina, así como de la descomposición de polisacáridos y proteínas (Wei y Tanokura 2015). Los tratamientos que obtuvieron los mayores puntajes fueron los fermentados (Figura 2); aunque estadísticamente fueron iguales, a nivel técnico o sensorial si hubo diferencia entre procesos (natural y lavado). Cabrera y Burbano (2018) describieron el café lavado como de cuerpo más ligero, taza más limpia, sabores más frutales, florales y acidez más intensa; el café natural tiene un cuerpo alto, baja acidez y sabor exquisito, sabores vinosos y con frutas intensas; el resultado en taza es dulce pues el grano seco junto con la pulpa y absorbe los azúcares de la fruta, lo que explica el mejor puntaje de taza de los tratamientos de café natural. Independientemente del proceso, se comprobó el efecto positivo de la fermentación; al observar una diferencia en puntaje de taza de 0.8 puntos para café lavado y 1.16 puntos, para natural, en la comparación de los tratamientos que fueron fermentados respecto al control. Al contrastar los puntajes obtenidos en los tratamientos de café natural, es posible observar la diferencia (P < 0.05) entre la puntuación del tratamiento control y los que fueron fermentados; sin embargo, respecto a la inoculación no hubo diferencia estadística. En el caso de los tratamientos lavados, se observó 15 diferencia (P < 0.05) entre la puntuación del tratamiento control y los que fueron fermentados; la inoculación mejoró el puntaje de taza; lo que concuerda con lo encontrado por Cruz y Pivaral (2018) con un sistema de fermentación cerrada e inoculación con levaduras que obtuvo un mayor puntaje (P < 0.05) debido al incremento en producción de compuestos volátiles detectados en análisis sensorial, produciendo sabores agradables en la catación. En el presente estudio los catadores catalogaron a todas las muestras como cafés especiales al darles un punta je de taza superior a los 80 puntos. Los descriptores encontrados por los catadores para la mayoría de los tratamientos, fueron cacao y nuez; para los tratamientos de café lavado, cítrico y madera; para los tratamientos de café natural, fruta, para el tratamiento natural sin inóculo, cereal y herbáceo, para el tratamiento natural con inóculo, uva negra. Los compuestos volátiles asociados a los descriptores encontrados por los catadores en este estudio según Puerta y Echeverri (2015) son: 2 acetilfurano, Dihidro-2metil (3)-2H furanosa, Acetato de 2-furanmetanol. Figura 2. Resultados de cataciones realizadas a los seis tratamientos. 1Escala de puntuación de 0 a 100. a-c Las letras diferentes, representan diferencia estadística entre tratamientos (P < 0.05). La categoría de café se puede dividir en dos subcategorías: café tradicional (especie Robusta) y café especial (especie Arábica); esta subcategoría tuvo su auge a partir del año 2000 con la crisis mundial de los precios del café tradicional (Madera y Torres 2016). La especie Coffea arabica constituye el 60% del café que se comercializa en el mercado internacional (Cuesta y Correa 2018). El café especial se enfoca en percepciones de alta calidad y originalidad, y se define, por algunos agentes de la industria como, buena preparación de un único origen y sabor distintivo (Ponte 2003). En otros términos, los cafés especiales son aquellos que conservan una consistencia en sus características físicas (forma, tamaño, humedad, apariencia y defectos), sensoriales (olfativas, 83 84 85 86 87 Lavado control Lavado con inóculo Lavado sin inóculo Natural control Natural con inóculo Natural sin inóculo P u n ta je d e c a ta c ió n 1 c ab bc c ab a 16 visuales y gustativas), prácticas culturales (recolección, lavado, secado) y en sus procesos finales (tostado, molienda y preparación); características que los distinguen del común de los cafés y por las cuales los clientes están dispuestos a pagar un mayor precio (Cardona 2012). Los tratamientos que obtuvieron los mayores puntajes fueron los fermentados; aunque estadísticamente fueron iguales. A nivel técnico o sensorial sí hubo diferencia entre procesos (natural y lavado), de igual forma, puede que dos muestras tengan el mismo puntaje, pero diferentes descriptores, lo que es determinante para el tipo de mercado al que estará dirigido. En el presente estudio, el descriptor diferenciador en el tratamiento con mayor puntaje de cata fue la uva negra para café natural con inóculo, por lo que se resalta la importancia de los procesos de fermentación en la mejora de los perfiles de taza y calidad del café. Esto último lleva a mercados exclusivos y beneficios económicos para el productor, que puede llegar hasta una diferencia de USD 1,000 por lb al comparar café especial con el café comercial (Velásquez y Trávez 2019). 17 4. CONCLUSIONES • Hubo una reducción pH y temperatura interna durante la fermentación controlada; de igual forma, se redujo la concentración de sólidos solubles en los tratamientos inoculados, de café natural y lavado. • Al momento de recuento de microorganismos no se observaron diferencias en la población de levaduras y hongos. • Se encontró mayor concentración de compuestos fenólicos en los tratamientos de café natural que fueron fermentados y el proceso fermentativo no influyó en el contenido de cafeína de los tratamientos. • La fermentación controlada influyó de manera positiva en la calidad final del café independientemente del proceso (natural y lavado) y la inoculación con Saccharomyces cerevisiae, mejoró la calidad de café lavado. 18 5. RECOMENDACIONES • Realizar un mayor control de la metodología empleada, a nivel de laboratorio para el recuento de microorganismos. • Hacer recuentos e identificación de los microorganismos (Bacterias, levaduras y hongos) que intervienen en la fermentación. • Implementar el estudio en diferentes masas de café con el fin de determinar si se obtienen resultados similares, a los obtenidos en este estudio. • Aplicar otras técnicas de fermentación controlada, como la maceración carbónica para evaluar su efecto en la calidad del café. • Efectuar el estudio con diferentes variedades de café, tipo y concentración de microorganismos iniciadores, tiempo y temperatura de fermentación. • Hacer mejoras a la metodología aplicada, mediante el control de las condiciones fermenta tivas como la temperatura y disponibilidad de oxígeno. • Evaluar la correlación entre la producción de CO2 y actividad microbiana. • Realizar estudios a la pulpa del café para determinar el efecto de la degradación de la pulpa en el proceso fermentativo y calidad del café. • Desarrollar el proceso fermentativo con temperatura controlada de 15, 17, 19 y 21 °C, realizando recuento de microorganismos en cada día de fermentación, y sacando muestras para catación cada día de fermentación. • Analizar más a detalle los metabolitos presentes en las masas fermentables para determinar que sólidos se están produciendo y o consumiendo. • Realizar un análisis estadístico de correlación entre pH, tiempo, temperatura y sabor. 19 6. 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Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F Proceso 1 0.05 0.05 0.12 0.7315 Inóculo 1 0.00 0.00 0.00 0.9453 Tiempo 6 342.82 57.14 142.76 <.0001 Proceso*Inóculo 1 0.49 0.49 1.22 0.2746 Proceso*Tiempo 6 2.32 0.39 0.97 0.4558 Inoculo*Tiempo 6 2.80 0.47 1.17 0.3375 Proceso*Inóculo*Tiempo 6 11.53 1.92 4.80 0.0005 Anexo 5. Nivel de significancia y correlación de factores en sólidos solubles. Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F Proceso 1 0.30 0.30 22.85 <.0001 Inóculo 1 0.50 0.50 38.62 <.0001 Tiempo 6 5.65 0.94 72.24 <.0001 Proceso*Inóculo 1 0.07 0.07 5.35 0.0245 Proceso*Tiempo 6 1.03 0.17 13.22 <.0001 Inoculo*Tiempo 6 0.29 0.05 3.75 0.0034 Proceso*Inóculo*Tiempo 6 0.04 0.01 0.54 0.7743 Anexo 6. Nivel de significancia en fenoles y cafeína. Source Fenoles Totales Pr > F Cafeína Pr > F Proceso 0.047 0.1783 Inoculo 0.054 0.9214 Proceso*Inoculo 0.267 0.2456 1Proceso 2Inóculo Descriptor Regusto 3Control Cítrico, nuez, cacao, madera Seco, amargo Lavado Con Nuez, cítrico, madera, cacao Seco, picante Sin Cítrico, nuez, herbáceo, cacao, madera, fruta Áspero, amargo Control Fruta, herbáceo, madera,nuez, cacao Picante, áspero Natural Con Fruta, cacao, nuez, uva negra. Seco, áspero Sin Fruta, nuez, cereal, cacao, umami Seco, áspero 27 Anexo 7. Nivel de significancia y correlación de factores en pH. Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F Proceso 1 19.05 19.05 24.48 <.0001 Inóculo 1 360.43 360.43 463.15 <.0001 Tiempo 6 92.62 15.44 19.84 <.0001 Proceso*Inóculo 1 5.76 5.76 7.40 0.0087 Proceso*Tiempo 6 10.62 1.77 2.27 0.0498 Inoculo*Tiempo 6 97.90 16.32 20.97 <.0001 Proceso*Inóculo*Tiempo 6 3.24 0.54 0.69 0.6558