Establecimiento y validación de curvas de calibración NIRS para café oro de Honduras Herbert Ariel Meléndez Márquez Honduras Diciembre, 2006 i ZAMORANO CARRERA DE AGROINDUSTRIA Establecimiento y validación de curvas de calibración NIRS para café oro de Honduras Proyecto de graduación presentado como requisito parcial para optar al título de Ingeniero en Agroindustria en el grado académico de licenciatura. presentado por: Herbert Ariel Meléndez Márquez Honduras Diciembre, 2006 ii El autor concede a Zamorano permiso para reproducir y distribuir copias de este trabajo para fines educativos. Para otras personas físicas o jurídicas se reservan los derechos de autor. ____________________________ Herbert Ariel Meléndez Márquez Honduras Diciembre, 2006 iii Establecimiento y validación de curvas de calibración NIRS para café oro en Honduras Presentado por: Herbert Ariel Meléndez Márquez Aprobado: _______________________ ____________________ Francisco Javier Bueso, Ph.D. Raúl Espinal, Ph.D. Asesor Principal Director Carrera Agroindustria _______________________ ____________________ Rodolfo Cojulún, Ing. M. Sc. George Pilz, Ph.D. Asesor Decano académico. _____________________ Kenneth Hoadley, D.B.A. Rector iv DEDICATORIA A mis padres, Ariel Meléndez y Migdalia Márquez por su ejemplo y apoyo incondicional en todo momento. A mis hermanas Ma. Gabriela y Nancy por su cariño y consejos brindados a lo largo de mi vida. A mi abuela Nelly Búcaro por estar presente en todos mis logros. v AGRADECIMIENTOS A Dios todopoderoso por iluminarme y darme la oportunidad de alcanzar todo lo que me he propuesto en mi vida. A mi familia por su paciencia y apoyo en la realización de mis estudios. Al Dr. Francisco Javier Bueso por compartir sus conocimientos. A mi compañero Miguel Jordán por su amistad y paciencia durante mis cuatro años en Zamorano. A mis compañeros Andrés, Pablo, Carlos y Rodrigo por hacer más placentera los dos años de estudio de la carrera. A los Ing. Víctor Taleón y Luis Sandoval por sus consejos técnicos y morales en la realización de este proyecto. A Mabel, Christian y Washington por su amistad y ayuda en mi último año. A todos los que contribuyeron directa o indirectamente en la elaboración de este proyecto. vi AGRADECIMIENTO A PATROCINADORES A la Fundación Nippon Ryoichi Sasakawa/ Norman Borlaug. vii RESUMEN Meléndez, H. 2006. Establecimiento y validación de curvas de calibración NIRS para café oro de Honduras. Proyecto Especial de Programa de Ingeniería Agroindustrial. Zamorano, Honduras. 35 p. Parte del control de calidad de los productos agroalimentarios está basado en su caracterización bioquímica. En el caso del café la composición química está fuertemente relacionada con las regiones productoras y las condiciones ecológicas. La espectroscopía de reflectancia en el infrarrojo cercano es utilizada actualmente para medir compuestos bioquímicos en productos alimenticios y materias primas. El objetivo del estudio fue calibrar y validar curvas de medición para materia seca y ceniza en café oro. Se analizaron 125 muestras de café oro proporcionadas por el Instituto Hondureño del Café (IHCAFE) de las áreas productoras de café en Honduras, por métodos convencionales de laboratorio y NIRS para el desarrollo de las curvas de calibración. Se utilizó el método de regresión de cuadrados mínimos parciales (PLS) con el cual se obtuvo un coeficiente de determinación en calibración (R2 cal) y error estándar de la validación cruzada (SECV), para materia seca de 0.938 (SECV: 0.28%) y para cenizas, 0.825 (SECV: 0.13%). Para la validación se utilizaron 25 muestras ajenas a la calibración en las cuales se compararon sus valores de referencia con los de predicción. Mediante el uso de una prueba t de muestras apareadas, no se encontró diferencia significativa (P<0.05) entre los valores de métodos de referencia y los valores de predicción NIRS. Los resultados demostraron que las curvas de predicción para materia seca y ceniza son confiables. El estudio sienta las bases para posteriores análisis de calibración de NIRS en la medición de otros compuestos bioquímicos en café oro capaces de caracterizar el café de Honduras. Palabras clave: Cenizas, denominación de origen, espectroscopía de reflectancia del infrarrojo cercano, materia seca, método de cuadrados mínimos parciales. __________________________ Francisco J. Bueso, Ph.D. viii CONTENIDO Portadilla…….……………..……………..……………………..………….. i Autoría……………………………………………………………………… ii Pagina de firmas………………………………………….………….……... iii Dedicatoria…………………………………………………………………. iv Agradecimientos…………………………………………………….……… v Agradecimiento a patrocinadores………………………………….……….. vi Resumen………………………………………………………….………… vii Contenido…………………………………………………………………... viii Índice de cuadros…………………………………………………………… x Índice de figuras……………………………………………………………. xii Índice de anexos……………………………………………………………. xiii 1 INTRODUCCIÓN……………………………….……………………….. 1 2 REVISIÓN DE LITERATURA……………….………………………….. 2 2.1 CAFÉ………………………………………….……………………………. 2 2.1.1 Denominaciones de origen en café.……………………………….………… 2 2.1.2 Composición química del café…………………………………….………… 3 2.2 ESPECTROSCOPÍA DEL INFRARROJO CERCANO………...…………. 3 2.2.1 Teoría de absorción de energía en el infrarrojo cercano…………………..... 4 2.2.2 Desarrollo de una curva de calibración NIRS………………………………. 4 2.3 USO DE NIRS PARA LA CARACTERIZACIÓN DE CAFÉ ORO..……... 5 3 MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………. 7 3.1 LOCALIZACIÓN………...……...………………………………………..... 7 3.2 MATERIALES…...………………………...………………………………. 7 3.2.1 Materiales análisis de referencia……………………………………………. 7 3.2.2 Equipo análisis de referencia……………………………………………….. 7 3.2.3 Materiales análisis NIRS……………………………………………………. 7 3.2.4 Equipo análisis NIRS………………………….……………………………. 7 3.2.5 Materia prima……………………………….………………………………. 8 3.3 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA……..….…....……………………….. 8 3.4 ANÁLISIS…….…………… ….……….…………………………………. 8 3.4.1 Análisis físicos…………………………….………………………………… 8 3.4.2 Análisis químicos…………………………………………………………… 9 3.5 RECOLECCIÓN DE ESPECTROS DE NIRS……………..............……..... 9 3.6 CALIBRACIÓN…………………….............................................................. 9 ix 3.7 CÁLCULO DE LA ECUACIÓN NIRS……..…......………………..…......... 10 3.8 VALIDACIÓN DE LAS CURVAS DE CALIBRACIÓN NIRS……............ 11 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………………………. 12 4.1 ANÁLISIS FÍSICOS…………………………………………………………. 12 4.1.1 Color…………………………………………………………………….……. 12 4.1.2 Granulometría….……………………………………………………….…….. 12 4.2 COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LAS MUESTRAS…..….……………...….. 13 4.3 CALIBRACIÓN DE LA CURVA………..…..……………………………… 14 4.4 ANÁLISIS DE REGRESIÓN Y TRATAMIENTOS MATEMÁTICOS…..... 15 4.5 VALIDACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN…………...…………. 19 5 CONCLUSIONES…………………………………………………………... 21 6 RECOMENDACIONES…………………………………………….......…. 22 7 BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………......... 23 8 ANEXOS…………………………………………………………………...... 25 x ÍNDICE DE CUADROS Cuadro 1 Composición bioquímica de café verde tipo Arábica y Robusta……………. 3 2 Estadísticas de café arabica y café robusta usadas para la calibración de curvas NIRS………………………………………………………………… 5 3 Composición química típica para café oro………………..………………… 6 4 Análisis físicos a los que fueron sometidas las muestras…………………… 8 5 Métodos de referencia utilizados para componentes de café oro..................... 9 6 Tratamientos matemáticos utilizados con MPLS, PC y PLS……………….. 10 7 Estadística descriptiva del color de las muestras evaluadas………………… 12 8 Estadística descriptiva de la granulometría de 10 muestras evaluadas……… 13 9 Estadística descriptiva de la composición química de las muestras de café oro usadas para la calibración por los métodos de referencia………………. 13 10 Estadística descriptiva de valores de predicción NIRS para las muestras de café oro usadas para la calibración…………..………………………..…. 14 11 Tratamientos matemáticos sometidos bajo el método de regresión de cuadrados mínimos parciales (PLS)………………………………………… 15 12 Tratamientos matemáticos sometidos bajo el método de regresión de cuadrados mínimos parciales modificados (MPLS)……..………………….. 16 13 Tratamientos matemáticos sometidos bajo el método de regresión por componentes principales (PCR)……………………………………………. 16 14 Tratamientos matemáticos sometidos bajo el método de regresión de cuadrados mínimos parciales (PLS) sin datos fuera de tipo…………………. 17 xi 15 Tratamientos matemáticos sometidos bajo el método de regresión de cuadrados mínimos parciales modificados (MPLS) sin datos fuera de tipo……………….…………………………………………………………. 18 16 Tratamientos matemáticos sometidos bajo el método por componentes principales (PCR) sin datos fuera de tipo……...………………………...….. 18 17 Estadística descriptiva de las muestras usadas para calibración bajo el tratamiento matemático 1,4,4,1 del método de regresión de cuadrados mínimos parciales………………………………………………. 19 18 Estadística descriptiva de las muestras usadas para la validación de la curva...................................................................................................... 20 19 Prueba t apareada de los valores obtenidos por los métodos de referencia y los predichos por NIRS de las muestras de café oro…………………….. 20 xii ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1 Espectros NIRS de las 125 muestras de café oro utilizadas para la calibración. …………………………………….……………………………. 14 xiii INDICE DE ANEXOS Anexo 1. Muestras utilizadas para la calibración de la curva NIRS con los datos de referencia de laboratorio (DRL) para materia seca y ceniza….................... 26 2. Muestras utilizadas para la validación de la curva NIRS con los datos de referencia de laboratorio (DRL) para materia seca y cenizas……………. 32 3 Diagrama de dispersión para los valores obtenidos de materia seca en café oro.………………………………………………………........................ 33 4 Diagrama de dispersión para los valores obtenidos de cenizas en café oro. ………………………………………………………………….………. 34 5 Muestras consideradas fuera de tipo en la calibración ceniza (Valor t > ±2.5 y Valor H>10.0)……………………………………………. 35 6 Comparación de los datos de validación medidos por los métodos de referencia y por NIRS para materia seca y cenizas…………………..…....... 37 1. INTRODUCCIÓN La composición química de materias primas y en productos alimenticios, muchas veces determina su calidad. La técnica NIRS o Espectroscopía de Infrarrojo Cercano es un método de análisis rápido, no destructivo ni contaminante, que permite la medición cualitativa y cuantitativa de un constituyente químico. La técnica NIR mide la cantidad de luz absorbida por un producto en el rango del infrarrojo cercano (800nm – 2,500nm). El café es la segunda materia prima en importancia en el mercado internacional, por lo que una alta calidad es demandada para este producto. Para asegurar la calidad del café tanto para los consumidores como para los productores existe la necesidad de establecer métodos analíticos, rápidos, objetivos y sensitivos. La tecnología NIRS es una técnica que cumple con esas necesidades para evaluar la calidad en el café. En el año 2004 el Centro de Cooperación Internacional en Investigación Agronómica para el Desarrollo (CIRAD, por sus siglas en francés), desarrolló un método rápido para comprobar la autenticidad y la calidad de varios productos, basadas en la espectroscopía de infrarroja cercano (NIRS). El análisis utiliza muestras de origen y de composición conocidos. El CIRAD cuenta con una base de datos de más de 4,000 espectros con la que es capaz de determinar el contenido de los seis mayores compuestos bioquímicos en café oro (materia seca, cafeína, trigonelina, grasa, sacarosa y ácido clorogénico) sin la utilización de análisis químicos tradicionales. Una segunda base de datos sirve para identificar los porcentajes del arabica y robusta en el café tostado y molido en mezcla. Los estudios de la corriente en el café sugieren que sea posible utilizar la herramienta para establecer claramente el origen geográfico de materias en el futuro cercano. Honduras cuenta con regiones donde se produce café de excelente calidad, especialmente en la zona fronteriza con El Salvador, en los departamentos de Ocotepeque, Lempira, Intibucá y La Paz, de donde el aromático de Marcala tiene reconocimiento a nivel internacional. Cada café varía en su composición bioquímica dependiendo de la región debido a sus condiciones agro-climáticas y edáficas. Haciendo una relación entre región y composición bioquímica se puede determinar la procedencia y por ende la calidad del café. El objetivo principal del siguiente estudio fue sentar las bases para la calibración de curvas de predicción NIRS para café oro de Honduras. En este caso se realizó la calibración y la validación de las curvas para la medición de materia seca y ceniza. Se utilizaron muestras de café oro, proporcionadas por el Instituto Hondureño del Café (IHCAFE), de las áreas productoras de café en Honduras. 2 2. REVISIÓN DE LITERATURA 2.1 CAFÉ El café es la bebida más popular en el mundo después del agua con un consumo anual de caso 400 billones de tazas. Por lo menos 66 especies del género Coffea L. han sido identificados hasta ahora. Dos variedades son las económica y comercialmente importantes: C. arabica L. (café arabica) y C. canephora var. robusta (café robusta) (Feria-Morales 2002). Según Feria-Morales (2002), comercialmente hablando, aproximadamente 70% del café comercializado es arabica y el 30% robusta. El café es comprado ya sea en el país de origen, en mercados especializados en países importadores o en los mercados de Nueva York y Londres. En Honduras el café es el principal rubro de exportación después del banano y una de las actividades agrícolas de mayor importancia, tanto así que se lleva a cabo en 15 de los 18 departamentos del país. Debido a su geografía montañosa, Honduras es un lugar ideal para la producción de café de alta calidad, de sabor suave y rico aroma (CIAT 1997). Según el IHCAFE (2001), el café en el ámbito económico, hasta el año 2000 ocupaba el primer lugar en la generación de divisas con un aporte de 26%. Esto se debió al impacto severo de la crisis de bajos precios del café en el mercado internacional. Luego de la crisis el café pasó a ocupar el segundo lugar con una participación del 12%. 2.1.1 Denominaciones de origen en café De acuerdo a Avelino (2005), una de las soluciones planteadas a la crisis cafetalera en el Taller Regional: “La crisis cafetalera y su impacto en Centroamérica” fue la de crear diferenciaciones de café desarrollando y promoviendo denominaciones de origen e indicaciones geográficas. Cabe mencionar que utilizando una denominación de origen protegida (DOP) o una indicación de geográfica protegida (IGP) permiten dar al producto una diferenciación en el mercado. Esta diferenciación se traduce en mejor precio de venta e incremento en ingresos. Las IGP y DOP son términos aplicables a productos que guardan una relación entre calidad y lugar de producción o fabricación. De igual manera que el vino, el café es una bebida de sabores y compuestos complejos. Sus características organolépticas y bioquímicas están relacionadas con el lugar de producción (Avelino y colaboradores 2002). 3 2.1.2 Composición química del café La composición bioquímica del café verde o grano oro (arabica y robusta) es mostrada en el Cuadro 1. Cuadro 1. Composición bioquímica de café verde tipo arabica y robusta. Composición arabica % MS* robusta % MS* Kahweol 0.7 – 1.1 NA Cafeína 0.6 – 1.5 2.2 – 2.7 Ácido clorogénico 6.2 – 7.9 7.4 – 11.2 Sacarosa y azúcares reductores 5.3 – 9.3 3.7 – 7.1 Aminoácidos libres 0.4 – 2.4 0.8 – 0.9 Strecke-activo 0.1 – 0.5 0.2 – 0.3 Araban 9.0 – 13.0 6.0 – 8.0 Reserva de Manano 25.0 – 30.0 19.0 – 22.0 Reserva de Galactano 4.0 – 6.0 10.0 – 14.0 Otros polisacáridos 8.0 – 10.0 8.0 – 10.0 Triglicéridos 10.0 – 14.0 8.0 – 10.0 Proteínas 12 12 Trigonelina 1 1 Otros lípidos 2 2 Otros ácidos 2 2 Cenizas 4 4 Total* 90.0 – 114.0 86.0 – 107.0 * Porcentaje en base seca para ciertos tipos de café. Fuente: Wintgens, 2004 2.2 ESPECTROSCOPÍA DEL INFRARROJO CERCANO Según Davies y Grant (1987), el infrarrojo cercano se le denomina a la longitud de onda dentro del espectro electromagnético que abarca entre los 750 a 2,500 nm. La espectroscopía de infrarrojo cercano es la técnica por la cual las radiaciones de longitud de onda NIR se proyectan hacia la muestra haciendo que la composición orgánica de la muestra responda a esa energía NIR de manera específica. La diferencia entre energía incidente y reflejada a cada longitud de onda es captada por un detector apropiado que da el resultado en forma de espectro. Recopilando las medidas de los espectros, las muestras pueden ser matemáticamente analizadas y determinados sus componentes basándose en la correlación con las medidas reales, obtenidas mediante las técnicas tradicionales de laboratorio (Oatway y Helm 1999). 4 El principio del NIRS es la iluminación de la muestra con luz de frecuencia específica y conocida en la región de infrarrojo cercano. Cada tipo de enlace de las moléculas refleja una longitud de onda, lo cual permite conocer la composición química de la muestra por medio del número y tipo de enlaces que la componen (Kempen 1996) De acuerdo a Wehling (1998), la reflectancia puede ser calculada por la siguiente fórmula: R = I / Io Donde: R = Reflectancia. I = Intensidad de la radiación reflejada de la muestra a longitud de onda dada. Io = Intensidad de radiación reflejada de la referencia a al misma longitud de onda 2.2.1 Teoría de absorción de energía en el infrarrojo cercano Los enlaces orgánicos específicos como por ejemplo C-H, N-H y O-H absorben la energía NIR a lo largo de las bandas de longitudes de onda específicas. Estos enlaces pertenecen a los principales compuestos en alimentos como es el caso de carbohidratos, grasas y proteínas. La concentración de un tipo de enlace es proporcional, en una forma aproximadamente lineal, a la altura del pico de una longitud de onda determinada (Cozzolino 2001). La absorción de la banda o absorción molecular en la región NIR es provocada por la vibración de los átomos de las moléculas (Shenk y Westerhaus 1993). Según Shenk y Westerhaus (1993), para analizar componentes en alimentos por espectroscopía infrarroja los instrumentos comerciales usan la técnica de reflectancia difusa. Cuando la radiación interactúa con las partículas de la muestra, los componentes bioquímicos absorben cierta cantidad de la radiación. La radiación de reflectancia difusa ofrece información de los constituyentes bioquímicos de la muestra (Wehling 1998). 2.2.2 Desarrollo de una curva de calibración NIRS Al desarrollar una calibración, se relaciona la información espectral con la información de referencia (composición química), definiendo entre otras cosas, el tratamiento matemático de los datos, el segmento del espectro a incluir y el método de regresión a emplear. 5 2.3 Uso de NIRS para la caracterización de Café oro. De acuerdo con Davrieux (2004), La composición bioquímica del café oro puede ser usada para caracterizar calidad. Ciertos constituyentes bioquímicos como trigonelina, sacarosa y ácido clorogénico son precursores de sabor. Otros constituyentes como la cafeína dan el sabor amargo al café tostado y la grasa ayuda a fijar los sabores complejos durante el tostado. Además si se conoce el contenido de agua es posible caracterizar el café oro para su preparación y condiciones de almacenaje. La técnica NIRS ha sido empleada para determinar los seis mayores componentes bioquímicos; estos compuestos son materia seca, cafeína, trigonelina, grasa, sacarosa y ácido clorogénico. Para la determinación de estos compuestos fue necesaria la calibración de una curva. El Cuadro 2 muestra los estadígrafos de muestras de café Arábica y café Robusta utilizadas en la calibración de una curva NIRS. Cuadro 2. Estadísticas de café arabica y café robusta usadas para la calibración de curvas NIRS. Arabica Constituyente N M Desv. Est. R² Materia seca 456 89.69 1.67 0.99 Cafeína 361 1.25 0.16 0.88 Trigonelina 323 0.99 0.09 0.82 Grasa 177 14.31 1.71 0.93 Sacarosa 331 7.39 0.94 0.79 Ácido clorogénico 267 7.64 0.80 0.81 Robusta Constituyente N M Desv. Est. R² Materia seca 259 92.43 2.37 0.99 Cafeína 330 2.56 0.43 0.96 Trigonelina 200 0.79 0.09 0.62 Grasa 43 10.32 1.18 0.78 Sacarosa 108 4.87 0.89 0.85 Ácido clorogénico 169 11.69 1.12 0.85 N. número de muestras para calibrar; M: media; Des. Est: desviación estándar; R²: coeficiente de determinación múltiple. El método de regresión utilizado fue el de cuadrados mínimos parciales (PLS). Fuente: CIRAD, 2004 Para representar la variabilidad substancial entre las especies Coffea se recopilaron mas de 4,000 espectros (3,520 de arabica y 571 de robusta) de diferentes orígenes geográficos, adquiridos por reflectancia difusa (Davrieux 2004). Según Vaast (2004), la composición bioquímica que se puede medir con NIRS está fuertemente relacionada con las regiones productoras y las condiciones ecológicas del cultivo como la altura. La trigonelina y los ácidos clorogénicos aumentan a medida que la altitud disminuye. Por el contrario la concentración de sacarosa en el café oro aumenta a 6 medida que la altura aumenta. La cafeína no guarda ninguna relación con la altitud. El Cuadro 3 muestra la composición química típica para cenizas y materia seca en café oro. Cuadro 3. Composición química típica para café oro. Constituyente %, BH* Materia Seca 88 – 92 Ceniza 3.78 - 3.96 * Porcentaje en base húmeda. Fuente: Viani e Illy 2005. 7 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 LOCALIZACIÓN El estudio se llevó a cabo en el Laboratorio de Análisis de Alimentos (LAA) de la Escuela Agrícola Panamerica, Zamorano, Valle del Yeguare, departamento de Francisco Morazán, Honduras. 3.2 MATERIALES 3.2.1 Materiales análisis de referencia • Bolsas Ziploc. 3.2.2 Equipo análisis de referencia • Balanza Metler AE 200. • Molino de martillo tipo Thomas-wiley modelo 4 con criba de 1 mm. • Horno al vacío Napco® Modelo 5831. • Incinerador Sybron/Termolyne • Desecador Boekel. 3.2.3 Materiales análisis NIRS • Paquete de Software de calibración WINISI II®. V 1.5 • Módulo detector de reflectancia. • Módulo de transporte de celdas. • Paquete Software estadístico SAS®. V 9.1. 3.2.4 Equipo análisis NIRS • FOSS NIR SY-3650 II, Modelo 5000. Analizador versátil de alimentos y bebidas. 8 • Monocromador Sistema II. 3.2.5 Materia prima Se utilizaron un total de 125 muestras de café oro de diferente calidad recolectadas de las principales regiones productoras de café en Honduras, a través del Instituto Hondureño del Café (IHCAFE). En el Anexo 1 se indican las muestras de café, utilizadas para la calibración y validación, con sus respectivas ponderaciones en cuanto a calidad. 3.3 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Luego de recibidas las muestras de café oro en el Laboratorio de Análisis de Alimentos, Zamorano, (LAAZ) se procedió a la molienda con un molino de martillo tipo Thomas- Wiley modelo 4 con una criba de 1 mm de diámetro. La cantidad molida fue de 80 g de muestra. Cada muestra fue molida durante 25 minutos. Luego de cada molienda el molino fue estrictamente limpiado. Las muestras molidas fueron almacenadas en bolsas plásticas (Ziploc). 3.4 ANÁLISIS 3.4.1 Análisis físicos Se realizaron análisis físicos únicamente con la finalidad de poder caracterizar el producto. La información obtenida no es necesaria para la calibración del NIRS. Los análisis físicos realizados fueron color, antes de la molienda, y granulometría, posterior a la molienda (Cuadro 4). Es probablemente la mayor causa de contaminación entre pruebas, especialmente en operaciones de rutina cuando se procesa un gran número de muestras. Así mismo, el tamaño medio de partícula, la distribución del tamaño de partículas, y por lo tanto la señal difusa de reflectancia pueden ser afectadas marcadamente por el estado del molino utilizado en la muestra. (Cozzolino 2002). Cuadro 4. Análisis físicos a los que fueron sometidas las muestras. Característica Equipo Color Colorflex Hunter L*a*b* Granulometría Juego de tamices y agitador Tyler Los datos de color obtenidos por el Colorflex utilizan la escala L* a* b*; en donde L* se refiere a la luminosidad 0-100, (siendo 0 negro y 100 blanco). a* representa el eje correspondiente a rojo-verde y b* está dado por el eje azul-amarillo. 9 Fue necesaria la medición de la granulometría para estandarizar el tamaño de partícula que se usó para calibrar la curva. El tamaño medio de partícula y la distribución del tamaño de las mismas debe mantenerse para futuros análisis ya que su variación es causa imprecisión e inexactitud en la lectura de NIRS. Los tamices utilizados fueron el No. 30, 40, 60 y 80. 3.4.2 Análisis químicos Para la calibración de la curva fue necesario someter las muestras de café oro a análisis químicos de referencia. Cada muestra fue analizada para determinar materia seca y cenizas. Estas mediciones son denominadas datos de referencia de laboratorio (DRL). Para medir los DRL se utilizaron procedimientos oficiales de la Asociación Oficial de Químicos Analíticos (AOAC 2005). El Cuadro 5 muestra los métodos oficiales usados. Cuadro 5. Métodos de referencia utilizados para componentes de café oro. Componente Método de referencia Materia seca Secado horno al vacío 584 mm Hg 70ºC Cenizas Incineración 580ºC por 6 horas (AOAC 942.05) 3.5 RECOLECCIÓN DE ESPECTROS DE NIRS La recolección de los espectros se llevó a cabo con el equipo FOSSNIR SY-3650 II, Modelo 5000 (NIRSystems). Para el acarreo de la muestra de café oro molido se utilizó una celda rectangular (5 X 7 cm) con vidrio de cuarzo. Al momento de la captura de los espectros la temperatura promedio fue 21ºC ± 0.5. Las muestras se analizaron en el rango comprendido de 1,100 a los 2,500 nm en el espectro del infrarrojo cercano. La reflectancia de la muestra se midió en intervalos de 2 nm. El espectro obtenido fue el promedio de 25 barridos y el resultado fue representado en coeficientes de absorbancia expresados como log 1/R. La información obtenida fue almacenada en la computadora a través del software WINISI II®. V 1.5. 3.6 CALIBRACIÓN En la calibración de la curva fue necesaria la utilización de 125 muestras de café oro molidas (Anexo 1). A través del software WINISI II®. V 1.5 los datos almacenados fueron sometidos a tres métodos de regresión o análisis estadísticos y catorce tratamientos matemáticos (Cuadro 6). Los tres métodos de regresión utilizados fueron cuadrados mínimos parciales modificados (MPLS), componentes principales (PC) y cuadrados mínimos parciales (PLS). 10 Cuadro 6. Tratamientos matemáticos utilizados con MPLS, PC y PLS. Tratamientos matemáticos 2,5,5,1 1,8,4,1 3,12,8,1 2,10,10,1 1,6,6,1 2,8,8,1 1,4,4,1 2,4,1,1 2,7,7,1 1,5,5,1 3,4,2,1 3,10,10,1 1,5,4,1 2,9,9,1 En el caso de los tratamientos matemáticos el primer número indica el orden de la derivación o substracción (la derivada del logaritmo 1/R), el segundo número es la amplitud o distancia entre los segmentos a sustraer, y el tercer y cuarto número es la longitud del segmento a ser suavizado (Alomar y Fuchslocher 1998). Para seleccionar el método de regresión y tratamiento matemático final se analizó cada uno de los R² o coeficientes de determinación de calibración obtenidos. Se escogió el modelo con el R² más alto. El coeficiente de determinación o R² es la relación que guardan en una regresión lineal los datos de referencia de laboratorio con los de predicción NIRS. 3.7 CÁCULO DE LA ECUACIÓN NIRS Al desarrollar una calibración, se relaciona la información espectral con la información de referencia del laboratorio, definiendo entre otras cosas, el tratamiento matemático de los datos, el segmento del espectro a incluir y el método de regresión a emplear (Alomar y Fuchslocher 1998). En el desarrollo de una ecuación es necesario identificar las muestras fuera de serie o outliers las cuales no se acoplan a la regresión. Para identificar estas muestras fuera de serie se usa el valor residual entre los DRL y los valores predichos por NIRS. Los valores que guardan mayor residualidad son los denominados fuera de serie. Según (Shenk y Westerhaus 1993), cuando aparecen datos fuera de tipo, es recomendable repetir el análisis de referencia y si repetido éste permanece como muestra discriminada, eliminarse de la calibración. Si el nuevo modelo no mejora el ajuste para las muestras fuera de serie, éstas deberían separarse para intentar conformar con ellas una calibración diferente. La eliminación de los datos fuera de serie produce un mejor coeficiente de determinación en la calibración de los datos. 11 3.8 VALIDACIÓN DE LAS CURVAS DE CALIBRACIÓN NIRS Para la validación se empleó el programa WINISI II®. V 1.5 el cual sometió los datos obtenidos en la calibración a una validación cruzada. Según Torres (2005), en la validación cruzada se toma aleatoriamente una muestra cada 4 muestras y se desarrolla un modelo de regresión sin éstas. Luego se predice una calibración nueva sin los valores de las muestras excluidas y tomadas al azar. Por otra parte, para la validación externa de la curva se incluyeron 25 muestras de café oro (Anexo 2), las cuales no fueron utilizadas en la calibración de la curva. En esta validación se comparan los valores de referencia de laboratorio (DRL) con los valores predichos por NIRS. Luego los valores son comparados por el software estadístico SAS®. V 9.1 mediante una prueba t de muestras apareadas. 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1 ANÁLISIS FÍSICOS 4.1.1 Color En el Cuadro 7 se muestran los valores obtenidos por el colorímetro Colorflex Hunter. Cuadro 7. Estadística descriptiva del color de las muestras evaluadas. Medidas Estadísticas Escala CIE ¹ L* a* b* Media 40.22 1.05 10.07 Mínimo 34.99 0.27 7.54 Máximo 46.34 2.02 12.70 Desv. Estándar ±1.91 ±0.33 ±0.85 Coeficiente de Variación (%) 4.76 31.56 8.47 ¹CIE = Comission Internationale d' Eclairage De acuerdo al análisis estadístico descriptivo hecho a las muestras de café oro existe una variabilidad considerable en la escala a* (coeficiente de variación = 31.56%). La variabilidad existente puede ser causa de diferencias en cuanto al pulido del café, ya que en algunas muestras era visible restos de integumento del grano en oro. Además cabe recalcar que los valores a* son bastante bajos por lo que se obtiene un coeficiente de variación alto. Por otro lado la escala de luminosidad L* mostró una desviación estándar por arriba de 1 (1.91) Al mismo tiempo su coeficiente de variación es bajo debido a que los valores L* son en promedio de 40.22. 4.1.2 Granulometría Para la estandarización de las muestras luego de la molienda fue necesario medir el tamaño de partícula de 10 muestras con un juego de tamices. La granulometría de las muestras es mostrada en el Cuadro 8. 13 Cuadro 8. Estadística descriptiva de la granulometría de 10 muestras evaluadas. # Tamiz Media % Muestra % Mínimo % Máximo Desviación Estándar % CV +30* 29.64 23.95 33.21 ±3.70 12.49 +40 47.61 38.54 57.53 ±7.27 15.268 +60 14.08 12.95 16.86 ±1.61 11.47 +80 4.99 3.88 6.05 ±0.89 17.93 -80° 3.25 2.67 4.04 ±0.54 16.64 * El signo “+”indica la cantidad de harina que quedó sobre el tamiz ° El signo “-“ indica la cantidad de harina que pasó el último tamiz (80) La distribución de las partículas de café oro molido fue retenida en su mayoría en el tamiz No. 40, seguido por el tamiz No. 30. Cerca del 15% de la muestra fue retenida en el tamiz No. 60, por último se utilizó el tamiz No. 80 el cual retuvo casi el 5% en promedio de café molido. Los coeficientes de variación demuestran que la variabilidad en el tamaño de partícula fue alta entre las muestras molidas de café; por lo que es un factor a considerar en el análisis NIRS. Para esto se sugiere la utilización de otro tipo de molino, el cual estandarice mejor el procedimiento. 4.2 COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LAS MUESTRAS Los valores obtenidos para la composición de materia seca y cenizas en café oro son mostrados en el Cuadro 9. Los valores obtenidos corresponden a los porcentajes normalmente hallados en el café oro (Cuadro 3). Los datos obtenidos presentaron baja variabilidad lo cual es reflejada en su desviación estándar y sus bajos coeficientes de variación. Los rangos de variabilidad establecen los límites para que el NIRS pueda predecir con exactitud. Cuadro 9. Estadística descriptiva de la composición química de las muestras de café oro usadas para la calibración por los métodos de referencia. Constituyente Número de muestras Media % Muestra Desviación Estándar % CV Mínimo % Máximo % Materia Seca 125 91.81 ±1.07 1.17 88.75 93.83 Ceniza 125 3.58 ±0.22 6.15 3.10 4.28 14 4.3 CALIBRACIÓN DE LA CURVA La Figura 1 da a conocer los espectros obtenidos por las 125 muestras de café oro utilizadas para la calibración de la curva. Los espectros demuestran una tendencia similar para todas las muestras. Esto indica que las diferencias en cuanto a los constituyentes bioquímicos del café oro fueron mínimas. El rango de absorción de los espectros es de los 1,100 nm a los 2,498. Figura 1. Espectros NIRS de las 125 muestras de café oro utilizadas para la calibración. Los valores de predicción de NIRS para las 125 muestras de calibración son mostradas en el Cuadro 10. Cuadro 10. Estadística descriptiva de valores de predicción NIRS para las muestras de café oro usadas para la calibración. Constituyente Número de muestras Media % Muestra Desviación Estándar % CV Mínimo % Máximo % Materia seca 125 91.81 ±1.05 1.14 88.20 93.76 Ceniza 125 3.57 ±0.18 5.04 3.04 4.08 El NIRS fue más preciso en cuanto a la obtención de valores tanto para materia seca como para ceniza. La precisión se ve reflejada en los coeficientes de variación. Los datos de referencia de laboratorio para materia seca y cenizas tuvieron un CV de 1.17% y 6.15% respectivamente, mientras que los datos NIRS tuvieron un CV de 1.14% para materia seca y 5.04% para cenizas. 15 4.4 ANÁLISIS DE REGRESIÓN Y TRATAMIENTOS MATEMÁTICOS Los Cuadros 11, 12 y 13 muestran los análisis de regresión cuadrados mínimos parciales (PLS), cuadrados mínimos parciales modificados (MPLS) y regresión por componentes principales (PCR) respectivamente. Cada análisis de regresión es mostrado con catorce tratamientos matemáticos y sus respectivos R². Cuadro 11. Tratamientos matemáticos sometidos bajo el método de regresión de cuadrados mínimos parciales (PLS) PLS R² cal TRT Materia Seca Cenizas 2,5,5,1 0.9308 0.6588 2,10,10,1 0.9340 0.6230 1,4,4,1 0.9399 0.6932 1,5,5,1 0.9382 0.7366 1,5,4,1 0.9382 0.6528 1,8,4,1 0.9389 0.6979 1,6,6,1 0.9392 0.7096 2,4,1,1 0.9338 0.6834 3,4,2,1 0.9204 0.3783 3,12,8,1 0.9293 0.5819 2,8,8,1 0.9324 0.6020 2,7,7,1 0.9323 0.6163 3,10,10,1 0.9313 0.5907 2,9,9,1 0.9315 0.5895 16 Cuadro 12. Tratamientos matemáticos sometidos bajo el método de regresión de cuadrados mínimos parciales modificados (MPLS). MPLS R² cal TRT Materia Seca Cenizas 2,5,5,1 0.9431 0.6526 2,10,10,1 0.9386 0.6491 1,4,4,1 0.9394 0.6408 1,5,5,1 0.9384 0.6897 1,5,4,1 0.9388 0.6312 1,8,4,1 0.9374 0.6192 1,6,6,1 0.9378 0.6648 2,4,1,1 0.9505 0.6752 3,4,2,1 0.9357 0.4143 3,12,8,1 0.9347 0.5973 2,8,8,1 0.9390 0.6756 2,7,7,1 0.9396 0.6507 3,10,10,1 0.9344 0.6763 2,9,9,1 0.9389 0.6052 Cuadro 13. Tratamientos matemáticos sometidos bajo el método de regresión por componentes principales (PCR). PCR R² cal TRT Materia Seca Cenizas 2,5,5,1 0.9260 0.4792 2,10,10,1 0.9325 0.4792 1,4,4,1 0.9307 0.4981 1,5,5,1 0.9308 0.4862 1,5,4,1 0.9307 0.5023 1,8,4,1 0.9307 0.4863 1,6,6,1 0.9309 0.4798 2,4,1,1 0.9201 0.3001 3,4,2,1 0.8777 0.3173 3,12,8,1 0.9293 0.4900 2,8,8,1 0.9317 0.4628 2,7,7,1 0.9273 0.4601 3,10,10,1 0.9307 0.4743 2,9,9,1 0.9269 0.4920 Los R² obtenidos para cenizas fueron bajos en comparación a los obtenidos para materia seca. De acuerdo con Cozzolino (2002), el poder de predicción de NIRS decrece con el aumento de la complejidad del parámetro analizado, como es el caso de las cenizas. 17 Además se debe destacar que las sustancias inorgánicas y los minerales no poseen absorción en la región del infrarrojo. Sin embargo, los minerales y otros elementos inorgánicos se pueden asociar a la estructura orgánica bajo la forma de óxidos, quelatos u otros complejos, e indirectamente ser estimados por el NIRS. Para cenizas las calibraciones obtenidas son consideradas con un valor de predicción medio. Sin embargo hay excepciones como en el estudio hecho por Torres (2005), en la predicción de cenizas para piensos de camarón usando NIRS, con la cual obtuvo R² superiores a los 0.90. Para la selección del método de regresión y el tratamiento matemático fue necesaria la eliminación de datos fuera de serie (outlier). Estos outliers permitieron un mejor ajuste al modelo lineal o coeficiente de determinación en la calibración. Para la calibración de la curva se estableció estrictamente un valor t de 2.5 desviaciones estándar. Es decir que en una regresión cuando la residualidad de un valor DRL con los valores NIRS excede las 2.5 desviaciones estándar éste es considerado un outlier y el programa automáticamente lo elimina de la calibración. En cuanto al valor H se utilizó un valor de 10.0. Según Cozzolino (2002), el valor es calculado mediante técnicas de análisis multivariado a través de componentes principales, y que corresponde a lo que en estadísticas se conoce como la distancia de Mahalanobis. Con el valor H se pudo identificar si una muestra es parte o no del grupo espectral basándose en su distancia al valor espectral promedio. Los Cuadros 14, 15 y 16 muestran los nuevos análisis de regresión cuadrados mínimos parciales (PLS), cuadrados mínimos parciales modificados (MPLS) y regresión por componentes principales (PCR) respectivamente, sin los valores fuera de tipo que el software identificó. Cada análisis de regresión es mostrado con catorce tratamientos matemáticos y sus nuevos R². Cuadro 14. Tratamientos matemáticos sometidos bajo el método de regresión de cuadrados mínimos parciales (PLS) sin datos fuera de tipo. PLS R² cal TRT Materia Seca Cenizas 2,5,5,1 0.9308 0.6598 2,10,10,1 0.9340 0.5850 1,4,4,1 0.9399 0.8254 1,5,5,1 0.9382 0.8154 1,5,4,1 0.9382 0.8186 1,8,4,1 0.9286 0.7702 1,6,6,1 0.9288 0.7784 2,4,1,1 0.9415 0.6834 3,4,2,1 0.9278 0.4122 3,12,8,1 0.9249 0.5924 2,8,8,1 0.9286 0.6052 2,7,7,1 0.9270 0.6207 3,10,10,1 0.9266 0.6105 2,9,9,1 0.9280 0.5957 18 Cuadro 15. Tratamientos matemáticos sometidos bajo el método de regresión de cuadrados mínimos parciales modificados (MPLS) sin datos fuera de tipo. MPLS R² cal TRT Materia Seca Cenizas 2,5,5,1 0.9458 0.6746 2,10,10,1 0.9310 0.6887 1,4,4,1 0.9338 0.7373 1,5,5,1 0.9350 0.7221 1,5,4,1 0.9336 0.6353 1,8,4,1 0.9339 0.6905 1,6,6,1 0.9343 0.6996 2,4,1,1 0.9539 0.6874 3,4,2,1 0.9357 0.4638 3,12,8,1 0.9306 0.5934 2,8,8,1 0.9390 0.6951 2,7,7,1 0.9419 0.6763 3,10,10,1 0.9344 O.6401 2,9,9,1 0.9389 0.7103 Cuadro 16. Tratamientos matemáticos sometidos bajo el método por componentes principales (PCR) sin datos fuera de tipo. PCR R² cal TRT Materia Seca Cenizas 2,5,5,1 0.9216 0.4510 2,10,10,1 0.9270 0.4974 1,4,4,1 0.9354 0.4981 1,5,5,1 0.9355 0.4943 1,5,4,1 0.9354 0.4987 1,8,4,1 0.9354 0.4827 1,6,6,1 0.9355 0.4884 2,4,1,1 0.9242 0.4798 3,4,2,1 0.8777 0.3655 3,12,8,1 0.9246 0.5028 2,8,8,1 0.9271 0.4838 2,7,7,1 0.9230 0.4640 3,10,10,1 0.9255 0.4872 2,9,9,1 0.9323 0.4723 En el Anexo 5 se aprecian las muestras de café oro consideradas como fuera de tipo que fueron eliminadas en la calibración de la curva de cenizas. Con esto se trató de incrementar el R² de la calibración. 19 El modelo de regresión escogido finalmente fue el de cuadrados mínimos parciales (PLS) debido a que presentó R² altos tanto para materia seca como para ceniza, en comparación a los otros modelos de regresión. El tratamiento matemático fue el 1,4,4,1 porque presentó el R² más alto para las cenizas. En los Anexos 3 y 4 se muestran los diagramas de dispersión de los DRL y los valores de predicción NIRS de materia seca y cenizas respectivamente. Los Anexos 3 y 4 se muestran los diagramas de dispersión de los DRL y los valores de predicción NIRS de materia seca y cenizas respectivamente. En el Cuadro 17 aparece la estadística descriptiva de las muestras finales usadas para el desarrollo de la ecuación. Cuadro 17. Estadística descriptiva de las muestras usadas para calibración bajo el tratamiento matemático 1,4,4,1 del método de regresión de cuadrados mínimos parciales. Constituyente Número de muestras Media % Muestra R² SEC SECV Materia seca 125 91.81 0.934 0.27 0.28 Ceniza 118 3.57 0.825 0.09 0.13 SEC: error estándar de calibración; SECV: error estándar de validación cruzada. El R² del tratamiento matemático 1,4,4,1 de PLS para cenizas subió considerablemente (0.825) al eliminarse los datos fuera de tipo. En el caso de la materia seca el R² se mantuvo ya que no se identificaron datos fuera de tipo en la calibración. Es importante recalcar que el R² en este estudio para materia seca no alcanzó los valores comparables a los de la literatura en otros estudios similares (0.99). Una razón fue que la humedad fue medida por secado al vacío y no por el método de referencia de Karl Fischer. De acuerdo a Cozzolino (2002), el método de liofilización y titulación o Karl Fischer da mejores resultados al relacionarse con la predicción NIRS. 4.5 VALIDACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN En la validación externa de la curva de calibración se utilizaron 25 muestras de café oro (Anexo 2) las cuales no fueron incluidas en la calibración de la misma. El Cuadro 18 muestra los resultados de materia seca y ceniza que fueron usados para la validación. 20 Cuadro 18. Estadística descriptiva de las muestras usadas para la validación de la curva. Constituyente Número de muestras Media % Muestra Desviación Estándar Coeficiente de variación Mínimo % Máximo % Materia Seca 25 91.84 ±0.90 0.98 89.92 93.65 Ceniza 25 3.71 ±0.24 6.47 3.27 4.38 La materia seca y la ceniza medidas por los métodos de referencia obtenidas en las muestras de validación no presentaron mucha variabilidad entre sí. Esto se ve reflejado en los bajos coeficientes de variación obtenidos. En el Cuadro 19 se presentan los resultados de la prueba t de observaciones apareadas. La probabilidad en materia seca y cenizas es mayor de 0.05 lo cual indica que no se encontraron diferencias significativas entre los valores obtenidos por los métodos convencionales y los datos de predicción de NIRS. Con esto se comprueba que la curva de predicción NIRS para materia seca y cenizas, luego de la eliminación de los datos fuera de tipo, es válida. Cabe destacar que aunque el R² para cenizas no fue alto en la calibración, de acuerdo con los valores de validación, la curva es aceptada. En el Anexo 5 se muestran los datos de referencia del laboratorio comparados con los datos predichos por el NIRS. Es necesario evaluar para estudios posteriores si la residualidad es un factor que afecte considerablemente los resultados obtenidos en cada constituyente. Cuadro 19. Prueba t apareada de los valores obtenidos por los métodos de referencia y los predichos por NIRS de las muestras de café oro. Constituyente Número de muestras Media % Muestra Desviación Estándar Valor t Probabilidad Materia Seca 25 0.147 ±0.820 0.63 >0.531 Ceniza 25 -0.068 ±0.214 -1.12 >0.267 5. CONCLUSIONES Se desarrollaron curvas de predicción para materia seca y cenizas a través de NIRS sin diferencias significativas entre los datos de referencia de laboratorio y los de predicción por NIRS. El mejor método de regresión para la calibración fue el de cuadrados mínimos parciales (PLS) mientras que el mejor método matemático fue el 1,4,4,1. 6. RECOMENDACIONES Calibrar el NIRS en la medición de cafeína, trigonelina, grasa, azúcar y acido clorogénico para tener un mapa de regiones productoras en Honduras comparadas con las composiciones bioquímicas del café oro. Modificar el modelo de regresión y tratamientos matemáticos cuando la curva sea calibrada para nuevos constituyentes. Discriminar el café por su composición bioquímica y estudiar la relación entre cada constituyente con el origen geográfico y su proveniencia regional. Emplear el método de Karl Fischer en la medición del contenido de humedad para tener mayor exactitud en los valores de referencia de laboratorio. Utilizar un molino diferente para estandarizar mejor la granulometría de la muestra y bajar los coeficientes de variación. Abarcar un marco de muestra más amplio el cual sea representativo del café producido en Honduras. 7. BIBLIOGRAFÍA Alomar D, Fuchslocher R. 1997. Fundamento de la espectroscopía de reflectancia en el infrarrojo cercano (NIRS) como metodo de análisis de forrajes. Agro sur, 1998, Vol. 26, No. 1, pp. 88-104. ISSN 0304-8802. AOAC (Association of Official Analytical Chemistry). 2005. Oficial Methods of Analysis of the AOAC International. 18th ed. Maryland. USA. Avelino J. 2005. Iniciar un proceso de reconocimiento de Indicaciones Geográficas Protegidas y Denominaciones de Origen Protegidas en café en Centroamérica. IICA- PROMECAFE / CIRAD. Francia. 9p. Avelino J, Perriot J.J, Guyot B, Pineda C, Guyot B, Decazy F, y Cilas C. 2002. Vers une indetification de cafés-terroir au Honduras. Plant. Rech. Dév., nºspécial café (in press). [CIAT] International center of tropical agriculture. 1997. San Nicolás debe centralizar beneficiado con tecnología limpia. 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Muestras utilizadas para la calibración de la curva NIRS con los datos de referencia de laboratorio (DRL) para materia seca y cenizas. Muestra R- Municipio Departamento Region Altura msnm Variedad Nota final % MS* Cenizas 211 Taulabe Comayagua Montecillos 854 Ihcafe-90 77.55 92.99 4.05 212 Concepción del Norte Santa Bárbara Copán 1020 Lempira 77.10 93.53 3.92 213 Petoa Santa Bárbara Copán 1130 Caturra 79.55 93.58 3.72 214 San Luis Santa Bárbara Copán 1020 Villa Sarchi 78.10 93.45 3.66 216 Ilama Santa Bárbara Montecillos 1145 Bourbon 83.55 92.99 3.90 221 Catacamas Olancho Agalta Tropical 1060 Caturra 83.67 93.02 3.53 222 Catacamas Olancho Agalta Tropical Pacas 84.63 92.80 3.43 223 Dulce Culmi Olancho Agalta Tropical Lempira 77.00 92.32 4.28 225 Dulce Culmi Olancho Agalta Tropical 560 Caturra 80.08 92.38 4.06 226 Dulce Culmi Olancho Agalta Tropical 908 Ih -90 80.42 91.93 3.92 227 Dulce Culmi Olancho Agalta Tropical 814 Caturra 78.20 92.78 3.70 228 Juticalpa Olancho Agalta Tropical 435 Pacas 76.00 93.03 3.74 229 Santa Maria del Real Olancho Agalta Tropical 1153 Lempira 88.10 93.10 3.63 230 Santa Bárbara Santa Bárbara Montecillos 990 Ih - 90 85.90 92.28 3.75 231 Campamento Olancho Agalta Tropical 1141 Lempira 83.50 92.94 3.30 232 Guanaco Olancho Agalta Tropical 1112 Caturra 82.10 93.03 3.86 234 Guanaco Olancho Agalta Tropical 955 Caturra 77.80 93.42 3.82 235 Guanaco Olancho Agalta Tropical 1076 Caturra 82.10 92.58 3.80 237 San Esteban Olancho Agalta Tropical 518 Caturra 78.75 91.73 3.71 * Porcentaje de materia seca. 24 27 Continuación Anexo 1 * Porcentaje de materia seca. Muestra R- Municipio Departamento Region Altura msnm Variedad Nota final % MS* Cenizas 239 San Fca.de la Paz Olancho Agalta Tropical 1310 Tipica 85.71 90.99 3.52 240 San Fca. De la Paz Olancho Agalta Tropical 1173 Caturra 85.00 90.98 3.33 243 San Juan Intibuca Opalaca 1350 IHCAFE 88.58 92.04 3.77 245 Copan Ruinas Copán Copán 824 Catuai 78.75 91.94 3.56 248 Nueva Arcadia Copán Copán 1013 TypicaBourbon 81.08 92.86 4.11 249 San Marcos Ocotepeque Copán 1326 Pacas 89.04 92.19 3.54 250 San Pedro Copán Copán 1100 Caturra 81.63 92.84 4.07 252 Copan Ruinas Copán Copán 642 Caturra/Catimo 82.25 92.52 3.59 253 Copan Ruinas Copán Copán 849 Caturra 82.38 91.94 4.09 254 Copan Ruinas Copán Copán 1037 IHCAFE 80.33 91.24 3.38 255 Corquen Copán Copán 980 Lempira 81.33 90.84 3.78 256 San Pedro Copán Copán 1590 Catuai 83.58 90.63 3.67 257 Santa Rita Copán Copán 1075 Catuai 80.02 92.76 3.47 258 Gracias Lempira Copán 1290 Caturra 85.58 92.00 3.37 259 Cucuyagua Copán 1400 Caturra 81.17 91.78 3.43 260 Corquen Copán Copán 1250 Caturra 81.67 92.50 3.41 261 Las Flores Lempira Copán 1185 Catuai 81.17 91.38 3.33 262 San Pedro Copán Copán 1375 Catuarra 85.50 92.57 3.37 263 La Iguala Lempira Opalaca 1445 Bourbon 81.92 92.75 3.76 265 San Pedro Copán Copán 1364 Caturra 85.83 91.80 3.11 266 La Unión Copán Copán 1258 Typica 79.67 91.10 3.99 267 Nueva Arcadia Copán Copán 1008 78.83 91.58 3.24 268 San Marcos de Colón Choluteca Agalta Tropical 1454 Catuarra 85.50 91.88 3.61 25 28 Continuación Anexo 1 Muestra R- Municipio Departamento Region Altura msnm Variedad Nota final % MS* Cenizas 269 San Marcos de Colón Choluteca Agalta Tropical 1540 Caturra 80.21 92.63 3.55 270 San Marcos de Colón Choluteca Agalta Tropical 1290 Caturra 83.25 90.19 3.28 271 San Marcos de Colón Choluteca Agalta Tropical 1052 Caturra 80.17 92.09 3.47 273 San Marcos de Colón Choluteca Agalta Tropical 1420 Caturra 79.50 92.72 3.63 274 Alauca El Paraíso Agalta Tropical 1169 88.13 92.41 3.65 276 Danlí El Paraíso Agalta Tropical 1220 Pacas 85.58 90.96 3.24 277 Danlí El Paraíso Agalta Tropical 1215 Bourbon 81.67 90.79 3.78 278 Danlí El Paraíso Agalta Tropical 1550 Catuai 92.25 91.31 3.31 279 Danlí El Paraíso Agalta Tropical 1153 Pacas 85.00 91.56 3.53 282 Danlí El Paraíso Agalta Tropical 607 Pacas 76.83 92.99 3.71 283 Danlí El Paraíso Agalta Tropical 1400 Pacas 86.88 91.71 3.63 284 Danlí El Paraíso Agalta Tropical 1109 Catuai 83.83 91.30 3.39 285 Danlí El Paraíso Agalta Tropical 858 Pacas 79.92 91.86 3.64 286 Danlí El Paraíso Agalta Tropical 1152 Pacas 85.92 91.15 3.41 287 Danlí El Paraíso Agalta Tropical 693 Catuai 79.79 91.48 3.92 288 El Paraíso El Paraíso Agalta Tropical 1106 83.38 90.85 3.62 291 El Paraíso El Paraíso Agalta Tropical 1244 85.38 90.40 3.43 292 El Paraíso El Paraíso Agalta Tropical 990 85.04 92.86 3.39 293 El Paraíso El Paraíso Agalta Tropical 949 77.75 89.99 3.78 294 El Paraíso El Paraíso Agalta Tropical 1194 82.96 91.15 3.57 295 El Paraíso El Paraíso Agalta Tropical 1197 81.46 89.68 3.49 297 El Paraíso El Paraíso Agalta Tropical 1002 82.50 93.05 3.60 298 El Paraíso El Paraíso Agalta Tropical 1150 81.70 88.75 3.39 * Porcentaje de materia seca. 26 29 Continuación Anexo 1 Muestra R- Municipio Departamento Region Altura msnm Variedad Nota final % MS* Cenizas 299 Guinope El Paraíso Agalta Tropical 1311 Catuai 85.70 90.71 3.40 300 Teupasenti El Paraíso Agalta Tropical 1250 Catuai 77.40 91.47 3.44 301 Teupasenti El Paraíso Agalta Tropical 1123 Catuai 80.90 89.93 3.44 303 Trojes El Paraíso Agalta Tropical 1050 Pacas 81.80 92.50 3.50 306 Trojes El Paraíso Agalta Tropical 738 Pacas 77.80 93.46 3.75 309 Talanga Fco. Morazán Agalta Tropical 1270 Catuai 80.90 93.16 3.68 310 Distrito Central Fco. Morazán Azul Meambar 1556 Catuai 86.80 90.72 3.31 311 Lepaterique Fco. Morazán Azul Meambar 1410 Catuai 85.40 92.95 3.50 312 Vallecillo Fco. Morazán Azul Meambar 1030 Caturra 78.70 89.09 3.27 313 Vallecillo Fco. Morazán Azul Meambar 1107 Caturra 80.70 90.65 3.29 315 Las Vegas Santa Bárbara Montecillos 1546 Bourbon 93.35 90.92 3.29 317 El Negrito Yoro Azul Meambar 600 IHCAFE - 90 82.00 90.43 3.23 318 El Negrito Yoro Azul Meambar 508 IHCAFE - 90 77.70 91.01 3.49 319 El Negrito Yoro Azul Meambar 548 IHCAFE - 90 77.45 93.36 3.47 320 Morazán Yoro Azul Meambar 547 Catuai 80.15 93.17 3.66 321 Victoria Yoro Azul Meambar 1166 IHCAFE - 90 86.00 90.54 3.53 322 Victoria Yoro Azul Meambar 960 IHCAFE - 90 83.30 91.13 3.58 323 Victoria Yoro Azul Meambar 1056 IHCAFE - 90 83.25 91.42 3.77 324 Victoria Yoro Azul Meambar 1254 Lempira 90.25 93.83 3.36 325 Yoro Yoro Azul Meambar 880 Villa sarchi 80.80 92.15 3.47 326 San Pedro Sula Cortes Copán 910 Caturra 80.80 93.05 3.76 327 Quimistan Santa Bárbara Copán 536 Catimor 79.80 90.10 3.62 328 Azacualpa Santa Bárbara Copán 434 Catuai 85.90 91.04 3.76 * Porcentaje de materia seca. 27 30 Continuación Anexo 1 Muestra R- Municipio Departamento Region Altura msnm Variedad Nota final % MS* Cenizas 329 Macuelizo Santa Bárbara Marlon Sevilla/Cortes 1070 Bourbon 86.60 91.66 3.27 330 Nueva Frontera Santa Bárbara Copán 949 Caturra 83.10 92.09 3.45 332 Macuelizo Santa Bárbara Copán 525 Caturra 78.50 91.89 3.76 333 Macuelizo Santa Bárbara Copán 811 Catimor 77.90 90.86 3.24 334 Victoria Yoro Azul Meambar 1300 Catuai 85.30 93.21 3.73 336 San Fernando Ocotepeque Copán 1115 Catuai 82.70 93.31 3.61 562 Danli El Paraíso Agalta Tropical 1280 Pacas 85.50 92.45 3.51 567 Teupasenti El Paraíso Agalta Tropical 1330 Catuai 85.58 91.81 3.49 572 Teupasenti El Paraíso Agalta Tropical 1156 IHCAFE-90 82.67 92.23 3.71 575 Teupasenti El Paraíso Agalta Tropical 1233 Lempira 85.04 92.52 3.59 577 Las Lajas Comayagua Azul Meambar 1066 Lempira 85.25 92.61 3.71 579 Las Lajas Comayagua Azul Meambar 1320 Catuai 82.58 91.98 3.63 591 Gracias Lempira Copán 1320 Pacas 83.00 92.47 3.13 597 Lepaera Lempira Opalaca 1385 Mescla 85.00 90.32 3.21 600 El Triunfo Choluteca Agalta Tropical Lempira 80.00 90.65 3.53 602 Yoro Yoro Azul Meambar 1419 Typica 82.50 90.43 3.42 605 Bonito Oriental Colon Agalta Tropical 1000 Caturra 79.25 91.63 3.66 606 Bonito Oriental Colon Agalta Tropical 1025 Pacas 79.33 92.51 3.54 608 Yorito Yoro Azul Meambar 1364 Typica 85.00 92.11 3.46 610 El Corpus Choluteca Agalta Tropical Catuai 78.00 92.84 3.76 612 Yorito Yoro Azul Meambar 1000 Lempira 81.63 89.84 3.54 614 Sulaco Yoro Azul Meambar 1361 Typica 83.92 91.19 3.44 616 Yoro Yoro Azul Meambar 1200 Catuai 80.75 92.38 3.49 * Porcentaje de materia seca. 28 31 Continuación Anexo 1 Muestra R- Municipio Departamento Region Altura msnm Variedad Nota final % MS* Cenizas 619 Bonito Oriental Colon Agalta Tropical 1000 Caturra 88.00 90.64 3.53 620 Bonito Oriental Colon Agalta Tropical 1107 Pacas 79.04 91.76 3.62 621 Tocoa Colon Agalta Tropical 930 Caturra 85.63 89.99 3.58 622 Yorito Yoro Azul Meambar 899 Caturra 83.38 91.05 3.79 623 Yoro Yoro Azul Meambar 1288 IHCAFE-90 85.00 90.75 3.44 624 San Pedro Sula Cortes Copan 1119 Caturra 81.54 91.10 3.77 627 Victoria Yoro Azul Meambar 1365 Villa sarchi 85.39 90.10 3.35 628 El Negrito Yoro Azul Meambar 1018 IHCAFE-90 79.17 90.88 3.73 630 Yoro Yoro Azul Meambar 1210 IHCAFE-90 50.00 91.32 3.80 701 Santiago Puringla La Paz Montecillos 1336 Catuai 87.17 91.02 3.10 702 Trojes El Paraíso Agalta Tropical 1204 Pacas 81.92 93.32 3.75 706 San Fca. de la Paz Olancho Agalta Tropical 980 Caturra 85.92 91.26 3.45 708 Danlí El Paraíso Agalta Tropical 1164 81.17 91.81 3.52 709 El Paraíso El Paraíso Agalta Tropical 988 82.67 92.60 3.64 * Porcentaje de materia seca. 29 32 Anexo 2. Muestras utilizadas para la validación de la curva NIRS con los datos de referencia de laboratorio (DRL) para materia seca y cenizas. Muestra R- Municipio Departamento Region Altura msnm Variedad Nota final % MS Ceniza 215 San Luis Santa Bárbara Copán 1222 Ih 90 84.95 92.84 3.79 218 San Fca. de Ojuera Santa Bárbara Opalaca 806 Lempira 82.29 92.02 4.02 220 Guaimaca Fco. Morazán Asalta Tropical 1130 Catuai 81.92 91.89 3.83 224 Culmi Olancho Asalta Tropical 514 Pacas 77.96 93.65 4.38 233 Gualaco Olancho Asalta Tropical 1087 Typica 81.95 92.91 4.06 238 San Fca. de la Paz Olancho Asalta Tropical 1350 Typica 86.13 91.66 3.62 244 San Fca. del Valle Ocotepeque Copan 1294 Pacas 79.50 91.07 3.66 247 Copan Ruinas Copan Copan 868 Catuai 81.75 92.17 4.00 264 Belén Lempira Opalaca 1420 Catuai 85.00 91.99 3.30 275 Danlí El Paraíso Agalta Tropical 843 Catuai 80.13 93.19 3.76 280 Danlí El Paraíso Agalta Tropical 1345 Catuai 77.17 91.48 3.72 281 Danlí El Paraíso Agalta Tropical 1120 IHCAFE - 90 83.63 92.04 3.93 296 El Paraíso El Paraíso Agalta Tropical 981 84.17 91.81 3.67 304 Trojes El Paraíso Agalta Tropical 1091 Pacas 83.50 91.31 3.76 308 Trojes El Paraíso Agalta Tropical 852 IHCAFE - 90 78.60 90.07 3.27 314 Vallecillo Fco. Morazán Azul Meambar 1121 Caturra 84.35 91.69 3.50 331 La Masica Atlántida Azul Meambar 1008 IHCAFE - 90 74.70 91.93 3.58 335 San Fernando Ocotepeque Copan 1198 Catuai 85.10 91.63 3.61 573 Teupasenti El Paraíso Agalta Tropical 1375 Cataui 83.96 90.93 3.69 604 Victoria Yoro Azul Meambar 1036 Mescla 88.50 92.29 3.50 615 Yoro Yoro Azul Meambar 1031 Typica 50.00 92.72 3.86 241 Proteccion Santa Bárbara Copan 988 Caturra Ih 90 79.33 90.58 3.42 305 Trojes El Paraíso Agalta Tropical 994 Pacas 85.70 91.72 3.64 316 La Ceiba Atlántida Azul Meambar 926 IHCAFE - 90 81.45 89.92 3.61 307 Trojes El Paraíso Agalta Tropical 1136 Pacas 80.80 92.54 3.64 30 33 Anexo 3. Diagrama de dispersión para los valores obtenidos de materia seca en café oro. 34 Anexo 4. Diagrama de dispersión para los valores obtenidos de cenizas en café oro. 35 Anexo 5. Muestras consideradas como fuera de tipo en la calibración ceniza (Valor t > ±2.5 y Valor H>10.0). Cuadrados mínimos parciales (PLS) TRT Valores fuera de tipo R² 2,5,5,1 R254, R258, R277 0.6598 2,10,10,1 R298, R223 0.5850 1,4,4,1 R298, R223, R211, R266, R254, R326, R258 0.8254 1,5,5,1 R298, R223, R211, R266, R254, R286, R326 0.8154 1,5,4,1 R298, R223, R211, R266, R254, R258, R326 0.8186 1,8,4,1 R298, R223, R211, R266, R254, R326 0.7702 1,6,6,1 R298, R223, R211, R266, R254, R326 0.7784 2,4,1,1 …. 0.6834 3,4,2,1 R266 0.4122 3,12,8,1 R298, R223 0.5924 2,8,8,1 R298, R223 0.6052 2,7,7,1 R298, R223 0.6207 3,10,10,1 R298, R223, R266 0.6105 2,9,9,1 R298, R223 0.5957 Cuadrados mínimos parciales modificados (MPLS) TRT Valores fuera de tipo R² 2,5,5,1 R298 0.6746 2,10,10,1 R211, R266 0.6887 1,4,4,1 R298, R223, R266, R211 0.7373 1,5,5,1 R298, R223, R266, R211 0.7221 1,5,4,1 R298, R223 0.6353 1,8,4,1 R298, R223, R266, R211 0.6905 1,6,6,1 R298, R223, R266, R211 0.6996 2,4,1,1 R277 0.6874 3,4,2,1 R333, R266 0.4638 3,12,8,1 R223, R266 0.5934 2,8,8,1 R266 0.6951 2,7,7,1 R266 0.6763 3,10,10,1 R268, R266 0.6401 2,9,9,1 R298, R266, R277, R243 0.7103 36 Componentes principales (PCR) TRT Valores fuera de tipo R² 2,5,5,1 R266, R298, R250, R265, R223 0.4510 2,10,10,1 R266, R223, R298 0.4974 1,4,4,1 R223 0.4981 1,5,5,1 R223 0.4943 1,5,4,1 R223, 266 0.4987 1,8,4,1 R223, 266 0.4827 1,6,6,1 R223 0.4884 2,4,1,1 R266, R265, R592, 5223 0.4798 3,4,2,1 R265, R266 0.3655 3,12,8,1 R266, R223, R298 0.5028 2,8,8,1 R226, R223 0.4838 2,7,7,1 R266, R223, R298, R250, R701 0.4640 3,10,10,1 R266, R223, R298 0.4872 2,9,9,1 R266, R223, R298 0.4723 37 Anexo 6. Comparación de los datos de validación medidos por los métodos de referencia y por NIRS para materia seca y cenizas. % Materia seca Referencia NIRS Residual 92.84 92.53 0.31 92.02 92.12 -0.10 91.89 92.33 -0.44 93.65 93.13 0.52 92.91 92.77 0.14 91.66 91.91 -0.26 91.07 92.13 -1.06 92.17 92.21 -0.03 91.99 92.06 -0.07 93.19 92.74 0.44 91.48 91.69 -0.22 92.04 92.09 -0.05 91.81 91.82 -0.01 91.31 91.49 -0.18 90.07 90.75 -0.69 91.69 90.98 0.70 91.93 92.41 -0.48 91.63 91.84 -0.21 90.93 91.22 -0.29 92.29 91.89 0.40 92.72 93.26 -0.54 90.58 90.64 -0.06 91.72 92.73 -1.01 89.92 90.53 -0.61 92.54 92.41 0.13 % Cenizas Referencia NIRS Residual 3.79 3.7065 0.08 4.0234 3.7540 0.27 3.8256 3.6940 0.13 4.3786 3.9146 0.46 4.0596 3.8215 0.24 3.6207 3.5280 0.09 3.6640 3.6785 -0.01 3.9961 3.3515 0.64 3.3026 3.5135 -0.21 3.7557 3.8610 -0.11 3.7231 3.5265 0.20 3.9279 3.6985 0.23 3.6733 3.8455 -0.17 3.7617 3.7425 0.02 3.2722 3.4155 -0.14 3.5022 3.3715 0.13 3.5752 3.6250 -0.05 3.6055 3.5620 0.04 3.6937 3.6460 0.05 3.5022 3.5860 -0.08 3.8630 3.9860 -0.12 3.4227 3.3765 0.05 3.6381 3.7380 -0.10 3.6072 3.4125 0.19 3.6364 3.7655 -0.13 Portada Portadilla Dedicatoria Agradecimientos Resumen Contenido Índice de cuadros Índice de figuras Indice de anexos Introducción Revisión de literatura Materiales y métodos Resultados y discusión Conclusiones Recomendaciones Bibliografia Anexos