Efecto del pH en la actividad antimicrobiana del aceite esencial de mostaza blanca contra microorganismos de interés en alimentos Zoila Del Rosario Chévez Tepas Escuela Agrícola Panamericana, Zamorano Honduras Noviembre, 2018 i ZAMORANO CARRERA DE AGROINDUSTRIA ALIMENTARIA Efecto del pH en la actividad antimicrobiana del aceite esencial de mostaza blanca contra microorganismos de interés en alimentos Proyecto especial de graduación presentado como requisito parcial para optar al título de Ingeniera en Agroindustria Alimentaria en el Grado Académico de Licenciatura Presentado por Zoila Del Rosario Chévez Tepas Zamorano, Honduras Noviembre, 2018 iii Efecto del pH en la actividad antimicrobiana del aceite esencial de mostaza blanca contra microorganismos de interés en alimentos Zoila del Rosario Chévez Tepas Resumen. Las nuevas tendencias en la industria de los alimentos exigen reducir o eliminar el uso de aditivos sintéticos; una alternativa potencial es el uso de aceites esenciales de origen vegetal. El aceite esencial de mostaza blanca (WMEO) tiene como principal ingrediente activo el 4-hidroxi-bencil-isocianato (4-HBITC); y en limitadas investigaciones ha demostrado ser eficiente contra bacterias y levaduras. Para este estudio se determinó la relación que hay entre el pH y el efecto de la actividad antimicrobiana del aceite esencial de mostaza blanca contra los microorganismos Salmonella enterica Typhimurium, Candida krusei, Saccharomyces cerevisiae en concentraciones de 0, 0.10 y 0.20% WMEO. Se usaron para Salmonella pH de 5, 6 y 7 y mediciones en el tiempo de 0, 8, 12, 24 y 48 horas. Para levaduras se usaron las mismas concentraciones de WMEO a pH de 4, 5 y 6 y las mediciones en el tiempo de 0, 24, 48 y 72 horas. Se encontró que la actividad antimicrobiana del aceite es más estable a pH 4 y 5, y funciona mejor con las levaduras. Hubo un sinergismo entre pH ácidos y concentración de WMEO. Para las levaduras no hubo diferencia estadística entre los tratamientos con pH 4 y 5, mientras que para Salmonella el efecto bactericida se demostró con tratamientos a pH 5. Se concluye que WMEO es más efectivo en pH 5 en los microorganismos estudiados, el pH por sí solo no demostró efectos antimicrobianos, para pH neutros se necesitan concentraciones más altas de WMEO. Palabras clave: Candida krusei, Saccharomyces cerevisiae Salmonella Typhimurium Abstract. New trends in the food industry are demanding the reduction or elimination of synthetic additives; a potential alternative is the use of essential oils from vegetable origin. The white mustard essential oil (WMEO) has as main active ingredient 4-hydroxy-benzyl- isocyanate (4-HBITC). Limited research has shown to be efficient against bacteria and yeasts. The main objective in this study was to determine the relationship between pH and the effect of antimicrobial activity of WMEO against foodborne microorganisms. The cultures used were Salmonella enterica Typhimurium, Candida krusei, Saccharomyces cerevisiae. Concentrations of 0, 0.10 and 0.20 % of WMEO were used for Salmonella at pH 5, 6 and 7. Measurements in time were 0, 8, 12, 24 and 48 hours, while for yeasts the same concentrations of WMEO were used, with pH of 4, 5, and 6. The measurements in time were 0, 24, 48 and 72 hours. The oil demonstrated to be more stable at pH within ranges 4 and 5. There was a synergy between low pH and WMEO concentration; for yeasts, there was no statistical difference between the treatments with pH 4 and 5, while for Salmonella the bactericidal effect was demonstrated in the treatments at pH 5. In conclusion, WMEO was more effective in treatment with pH in the microorganism studied. The pH itself did not show any antimicrobial effect, for neutral pH highest concentration of WMEO are needed. Key words: Candida krusei, Saccharomyces cerevisiae, Salmonella Typhimurium iv CONTENIDO Portadilla ................................................................................................................ i Página de firmas ..................................................................................................... ii Resumen ................................................................................................................. iii Contenido ............................................................................................................... iv Índice de Cuadros y Anexos ................................................................................... v 1. INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 1 2. MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................................... 3 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................ 6 4. CONCLUSIONES .............................................................................................. 12 5. RECOMENDACIONES .................................................................................... 13 6. LITERATURA CITADA................................................................................... 14 7. ANEXOS ............................................................................................................. 17 v ÍNDICE DE CUADROS Y ANEXOS Cuadros Página 1. Tratamientos en Salmonella enterica Typhimurium con aceite esencial de . . . . mostaza blanca (WMEO) .................................................................................... 4 2. Tratamientos usados para Candida krusei y Saccharomyces cerevisiae con . . . . . . aceite esencial de mostaza blanca (WMEO) ....................................................... 5 3. Recuentos de Salmonella enterica Typhimurium (Log UFC/ml) según … … exposición a diferentes concentraciones de aceite esencial de mostaza blanca .. (WMEO) y pH. .................................................................................................... 7 4. Recuento de Candida krusei (Log UFC/ml) según exposición a diferentes concentraciones de aceite esencial de mostaza blanca (WMEO) y pH. .............. 9 5. Recuentos de Saccharomyces cerevisiae (Log UFC/ml) según exposición . . . . . . . a diferentes concentraciones de aceite esencial de mostaza blanca (WMEO) y pH. .................................................................................................... 10 Anexos Página 1. Resumen del análisis estadístico en experimentos con Salmonella . . . . . . Typhimurium. ...................................................................................................... 17 2. Resumen del análisis estadístico en experimentos con Candida krusei. ............. 18 3. Resumen del análisis estadístico en experimentos con Saccharomyces. . . . …. cerevisiae. ............................................................................................................ 18 4. Comportamiento de Salmonella enterica Typhimurium según exposición .. . .. . . . al aceite esencial de mostaza blanca (0.00, 0.10 y 0.20%) y pH (5, 6 y 7). ........ 19 5. Comportamiento de Candida krusei según exposición al aceite esencial de. . . . . . mostaza blanca (0.00, 0.10 y 0.20%) y pH (4, 5 y 6). ......................................... 20 6. Comportamiento de Saccharomyces cerevisiae según exposición al aceite . . . . . . esencial de mostaza blanca (0.00, 0.10 y 0.20%) y pH (4, 5 y 6). ...................... 21 7 1. INTRODUCCIÓN En la actualidad las personas se encuentran más interesadas por los alimentos que ingieren debido a que cuentan con mucha información. De acuerdo a la compañía de marketing MINTEL (MINTEL 2018) una de las tendencias para el presente año es la reducción del uso de aditivos sintéticos en los alimentos. El uso de aceites esenciales (EO) se considera una potencial alternativa para satisfacer la necesidad de los consumidores y de la misma forma brindar productos inocuos y de calidad. Por otra parte, los aceites esenciales son productos derivados de plantas, se caracterizan por ser hidrofóbicos y usualmente aromáticos (Capinera 2008). Poseen metabolitos secundarios generalmente volátiles que les otorgan propiedades antimicrobianas y antioxidantes por lo cual, la industria de los alimentos se ha interesado en el uso de estos. Además, son ingredientes biodegradables y tienen bajos niveles de toxicidad (Hyldgaard et al. 2012; Pino 2015). Usar aceites esenciales en la industria alimentaria representa un reto debido a que los aislados de estos compuestos no son lo suficientemente potentes y pueden producir cambios organolépticos en los alimentos. Por lo tanto, es necesario tener conocimientos previos como la concentración mínima inhibitoria (MIC), propiedades del microorganismo objetivo, modo de acción de aceite y el efecto de los componentes de la matriz alimenticia en las propiedades del aceite (Hyldgaard et al. 2012). El aceite esencial de mostaza blanca o conocido en inglés como: white mustard essential oil (WMEO). De acuerdo con el codex alimentarius es un producto extraído de la mostaza (Sinapis alba), principalmente de la semilla. Usado en limitadas investigaciones. En comparación con otros aceites, WMEO tiene una volatilidad baja e inestable en ambientes acuosos. El ingrediente activo es el 4-hidroxi-bencil-isocianato (4-HBITC) (Ekanayake et al. 2016). Se degrada con horas de exposición a la humedad eso lo convierte en un agente efectivo antibacteriano y antimicótico especialmente para productos sólidos (David 2014). Por otra parte, WMEO ha demostrado ser efectivo contra microorganismos incluyendo bacterias como Samonella y E. coli además de algunas levaduras (Monu et al. 2014). Salmonella es una bacteria Gram negativa que no forma esporas, se caracteriza por ser móvil, con forma redondeada y pertenece a la familia Enterobacteriaceace y a la tribu Salmonellae. Crece en temperaturas entre 5 y 47 °C y se desarrolla en un rango de pH entre 4.5 y 9.0, debajo de un pH 4 puede ser inactivada (Pascual 2005). De acuerdo al CDC (2016) (Centers for Disease Control and Prevention), Samonella causa aproximadamente 1.2 millones de enfermedades y 450 muertes cada año en Estados Unidos. Las levaduras son tipos de hongos unicelulares; hay diversas especies y algunas tienen roles importantes en los procesos de fermentación, en enfermedades de humanos y animales y el 2 deterioro de los alimentos (Fell et al. 2016). Candida krusei es una levadura que puede crecer en presencia de preservantes como el ácido sórbico y el ácido benzoico, crece a pH ácidos y en un rango de temperaturas entre 8 y 47 °C, esta levadura está relacionada a procesos fermentativos (Pitt y Hocking 2009). También se considera un microorganismo patógeno porque causa enfermedades en la piel afectando principalmente a pacientes inmunocomprometidos (Hayford y Jakobsen 1999; Pollyanna et al. 2018). Por su parte, Saccharomyces cerevisiae es una levadura unicelular. Relacionada a la industria del vino, pan y cerveza por su capacidad fermentativa (Bom et al. 2001). Puede ser considerada un microorganismo deteriorador de alimentos, en vinos puede comenzar una segunda fermentación causando sabores indeseables (Rodriguez et al. 2013). Se han realizado limitadas investigaciones con WMEO evaluando la interacción con otros aceites esenciales (Abrego et al. 2017). Con matrices alimenticias se han hecho investigaciones usando salsas (David et. al 2013) y pollo (Porter 2017). Sin embargo, no se han hecho investigaciones evaluando el pH, este puede variar dependiendo de la matriz alimentaria y se considera como una barrera para el desarrollo de los microorganismos. En este estudio se usarán diferentes rangos de pH junto con diferentes concentraciones de WMEO y se evaluará la actividad antimicrobiana, para lo cual se han establecido los siguientes objetivos:  Evaluar la actividad antimicrobiana del aceite esencial de mostaza blanca usando diferentes rangos de pH contra microorganismos de interés en alimentos.  Determinar la relación entre las variables pH, tiempo y concentraciones de WMEO contra el crecimiento de cada microorganismo. 3 2. MATERIALES Y MÉTODOS Ubicación. El proyecto fue realizado en la Universidad de Auburn situada en el estado de Alabama, Estados Unidos. Cultivos utilizados. Los cultivos utilizados para la investigación fueron Salmonella enterica Typhimurium obtenida del Departamento de Agricultura de Estados Unidos (USDA) Athens, Georgia. También se usó el cultivo de Saccharomyces cerevisiae Meyen ex. E.C. Hansen (ATCC®9763™). Candida krusei fue obtenido de la Universidad de Tennessee, Estados Unidos. Etapa 1. Efecto del pH en la actividad antimicrobiana del aceite esencial de mostaza blanca contra Salmonella enterica Typhimurium. Preparación de cultivo. El cultivo de Salmonella se encontraba congelado por lo que primero se descongeló y fue inoculado en caldo de soya tripticasa (por sus siglas en ingles TSB) a 37 °C por 24 horas. Posteriormente se transfirieron 10 μL a TSB y se incubó a 37 °C por 24 horas. Se llevó el inoculo a 107 UFC/mL, donde adicionalmente se realizó una siembra por superficie en agar de soya tripticasa (por sus siglas en inglés TSA) para comprobar la pureza y concentración del inóculo, se incubó a 37 °C por 24 horas. Preparación de tratamientos con aceite esencial de mostaza blanca. Se usó una solución congelada de aceite esencia de mostaza blanca (WMEO) al 98% de pureza, se descongeló para crear dos concentraciones diferentes. La primera concentración se preparó añadiendo 0.376 mL de la solución descongelada de WMEO a 1.24 mL de dimetildisulfoxido (DMSO), resultando un tratamiento con un porcentaje de 0.20% de WMEO. Para la segunda concentración se tomaron 0.75 mL de la primera concentración y a esta se le añadieron 0.75 mL de TSB dando como resultado un porcentaje del 0.10%. Se añadieron 0.2 mL de los tratamientos de WMEO a tres tubos de TSB con pH ajustado con HCl 0.1 N a 5, 6 y 7, y 20 μL del cultivo de Salmonella. Los controles no tenían ningún porcentaje de WMEO solamente 0.2 mL de DMSO. Los tubos de ensayo con los tratamientos fueron incubados a 25 °C durante dos días. Se realizaron muestreos de cada suspensión con tratamiento a 0, 8, 12, 24 y 48 horas. En cada muestreo se realizaron diluciones decimales con 9 mL de agua peptonada al 0.01% para realizar los conteos en 4 platos Petri con TSA que fueron incubados a 37 °C por 24 horas. Los tratamientos usados se encuentran descritos en el cuadro 1. Cuadro 1. Tratamientos en Salmonella enterica Typhimurium con aceite esencial de mostaza blanca (WMEO). pH Concentración WMEO 0% 0.10% 0.20% pH 5 T 1 * T 2 T 3 pH 6 T 4 * T 5 T 6 pH 7 T 7 * T 8 T 9 *Tratamientos control Para cada tratamiento se tomaron datos de crecimiento a 0, 8, 12, 24 y 48 horas. Diseño experimental. Se usó un diseño experimental de Bloques Completos al Azar (BCA) con un arreglo factorial de 3x3x5, es decir, tres niveles de pH (5,6 y 7), tres concentraciones de WMEO (0, 0.10, 0.20%) y cinco mediciones en el tiempo (0, 8, 12, 24 y 48 horas). Se realizó una separación de medias Duncan y una separación de medias de cuadrados mínimos (LSMeans) para determinar las respectivas interacciones mediante el programa “Statistical Analysis System” SAS versión 9.4. Etapa 2. Efecto del pH en la actividad antimicrobiana del aceite esencial de mostaza blanca contra Saccharomyces cerevisiae y Candida krusei Preparación de cultivo. Los cultivos de Saccharomyces cerevisiae y Candida krusei se encontraban congelados por lo que primero se descongelaron y fueron inoculados en extracto de levadura-peptonada-dextrosa (por sus siglas en inglés YPD), a 32 °C por dos días. Posteriormente, se transfirieron 10 μL a YPD y se incubaron a 32 °C por 2 días. Se llevaron los inóculos a 107 UFC/mL, donde adicionalmente se realizó una siembra por superficie para comprobar la pureza y concentración de cada uno de los inóculos, se incubaron a 32° por dos días. Preparación de tratamientos con aceite esencial de mostaza blanca. Se realizó el mismo proceso descrito para Salmonella, hubo variaciones en cuanto al caldo y el agar usado, es decir YPD. Los pH evaluados fueron 4, 5 y 6. La temperatura de incubación fue de 32 °C por 48 horas para los platos Petri y 25 °C para los tubos con tratamientos. En el cuadro 2 se detallan los tratamientos usados. Diseño experimental. Se usó un diseño experimental de Bloques Completos al Azar (BCA) con arreglo factorial de 3x3x4 que indica tres concentraciones diferentes de WMEO (0, 0.10 y 0.20%); tres pH diferentes (4. 5 y 6) y cuatro mediciones en el tiempo (0, 24, 48 y 72 horas). Se realizó una separación de medias Duncan y una separación de medias de 5 cuadrados mínimos (LSMeans) para determinar las respectivas interacciones mediante el programa “Statistical Analysis System” SAS versión 9.4. Cuadro 2. Tratamientos usados para Candida krusei y Saccharomyces cerevisiae con aceite esencial de mostaza blanca (WMEO). pH Concentración WMEO 0% 0.10% 0.20% pH 4 T 1 * T 2 T 3 pH 5 T 4 * T 5 T 6 pH 6 T 7 * T 8 T 9 *Tratamientos control Para cada tratamiento se tomaron datos de crecimiento a 0, 24, 48 y 72 horas. 6 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Etapa 1. Efecto del pH en la actividad antimicrobiana del aceite esencial de mostaza blanca contra Salmonella enterica Typhimurium. En general todas las variables medidas tuvieron un valor P<0.0001 es decir hubo diferencias estadísticamente significativas. Todos los tratamientos mostraron reducciones logarítmicas a partir de las 8 horas (Cuadro 3). Los tratamientos con pH 5 tuvieron una mayor reducción. Además, se demostró un efecto sinérgico entre bajos pH y concentraciones de WMEO. El pH, por sí solo no mostró ser una barrera eficiente debido a que los pH usados se encuentran en los rangos óptimos (pH 6-9) para Salmonella Typhimurium (Thayer et al. 1987). Los tratamientos presentaron reducciones a partir de las 8 horas. Los tratamientos con WMEO y pH 5 demostraron ser los más estables a lo largo del tiempo. Fueron los que se encontraron por debajo del límite de detección mínimo (1 Log UFC/mL), lo cual indica que podrían ser usados en matrices alimenticias con pH bajos para obtener resultados efectivos. Sin embargo, es necesario tener en cuenta el tipo de estructura del alimento a ser usado ya que, en previas investigaciones se determinó que el uso de aceites esenciales en gelatinas inoculadas con Salmonella Typhimurium redujo el efecto antimicrobiano debido a la estructura (Burt 2004) Una variable a tomar en cuenta es el tiempo para que ocurra la reacción de hidrolisis del compuesto activo del aceite que se caracteriza por ser pH dependiente y generalmente ocurre un proceso de hidrolisis más lento en pH ácidos que en pH alcalinos (David et al. 2013; Ekanayake et al. 2016). Se pudo comprobar que WMEO tuvo una mejor interacción con el pH 5 y por eso los tratamientos con esos pH fueron los más estables en el tiempo. Los tratamientos con pH neutro al encontrarse en el rango de crecimiento óptimo para Salmonella solo presentaron reducciones logarítmicas hasta las 12 horas de exposición a WMEO, después de las 24 horas no tuvieron diferencia estadística significativa con los tratamientos control. Se ha determinado en previas investigaciones que las bacterias Gram negativas son más susceptibles a la actividad de WMEO que las bacterias Gram positivas (Monu et al. 2014). Salmonella es una bacteria Gram negativa y el uso de WMEO no fue tan eficiente debido a los pH usados que se encontraban en los rangos óptimos para el crecimiento de la bacteria por lo cual se infiere que hubo condiciones óptimas para el crecimiento de dicha bacteria que fuera afectado por los tratamientos usados a excepción de los tratamientos con pH 5. 7 Cuadro 3. Recuentos de Salmonella enterica Typhimurium (Log UFC/ml) según exposición a diferentes concentraciones de aceite esencial de mostaza blanca (WMEO) y pH. Los valores representados en el cuadro corresponden al promedio ± desviación estándar de tres repeticiones en duplicado. ABC Medias con letras mayúsculas diferentes en cada columna denotan diferencias entre tratamientos (P<0.05) wxyz Medias con letras minúsculas diferentes en cada fila denotan diferentes entre tiempos de exposición en cada tratamiento (P<0.05) β Valores reportados por debajo del límite de detección (1 Log UFC/mL) Tratamiento Tiempo de exposición Concentración WMEO pH 0 h 8 h 12 h 24 h 48 h 0% 5 4.25 ± 0.25Ay 5.24 ± 0.97Ax 5.80 ± 1.59ABx 7.97 ± 0.41Bw 8.67 ± 0.29Aw 0% 6 4.42 ± 0.30Az 5.70 ± 1.16Ay 6.69 ± 0.41Ax 8.59 ± 0.20Bw 8.70 ± 0.34Aw 0% 7 4.34 ± 0.33Az 5.18 ± 0.33Ay 6.41 ± 0.24Ax 8.94 ± 0.29Aw 9.06 ± 0.62Aw 0.10% 5 4.26 ± 0.29Aw 0.70 ± 0.00Exβ 1.36 ± 1.04Ex 0.70 ± 0.00Exβ 0.70 ± 0.00Dxβ 0.10% 6 4.26 ± 0.29Ax 4.09 ± 0.39Cx 4.12 ± 0.68Cx 4.22 ± 0.89Cx 8.11 ± 0.63Aw 0.10% 7 4.15 ± 0.18Ay 4.91 ± 0.12ABx 5.57 ± 0.30Bx 8.37 ± 0.43Bw 8.46 ± 0.53Aw 0.20% 5 4.24 ± 0.21Aw 0.70 ± 0.00Eyβ 0.70 ± 0.00Eyβ 0.70 ± 0.00Eyβ 1.51 ± 0.99Cx 0.20% 6 4.21 ± 0.26Ax 1.66 ± 1.50Dy 2.31 ± 1.11Dy 1.80 ± 1.21Dy 5.01 ± 1.05Bw 0.20% 7 4.33 ± 0.18Ay 4.09 ± 0.61Cy 4.83 ± 0.29Cx 8.28 ± 0.54Bw 8.56 ± 0.95Aw R2 0.95 CV 13.39 8 En estudios previos realizados se determinó que a un pH 9 el compuesto se degrada instantáneamente reduciendo la vida de anaquel del aceite (Ekanayake et al. 2012). En otro estudio (Porter 2017) se usaron diferentes concentraciones de WMEO contra Salmonella Typhimurium pero solo con pH 7 y después de 24 horas, con una concentración de 0.21% WMEO y a 22 °C en TSB se obtuvo 8.08 Log UFC/ml similar con el resultado obtenido después de 24 horas a pH 7 y con 0.20% WMEO donde se encontró 8.28 ± 0.54 Log UFC/ml. En el mismo estudio se usaron diferentes serovares de Salmonella y se determinó que si es efectivo el uso de WMEO contra Salmonella. Para obtener mejores resultados se podrían usar diferentes combinaciones de aceites esenciales y de esta forma reducir cambios organolépticos en los alimentos. Los aceites esenciales pueden ser usados mediante varias técnicas y ser efectivos. En un estudio se usó un coctel con varios EO (Kang y Song 2018) y se demostró una reducción logarítmica de Salmonella Typhimurium aplicado en un proceso de lavado de vegetales recién cosechados, se podría usar WMEO para reducir la carga microbiana en procesos de desinfección de vegetales como una posible alternativa para alimentos que se destinarán a procesado mínimo Etapa 2. Efecto del pH en la actividad antimicrobiana del aceite esencia de mostaza blanca contra Candida krusei. Todas las variables medidas tuvieron un valor P <0.0001 es decir hubo diferencias estadísticamente significativas. Todos los tratamientos mostraron reducciones logarítmicas a partir de las 24 horas (Cuadro 4). Los tratamientos con pH 4 y 5 fueron estadísticamente iguales y tuvieron una mayor reducción en comparación con los tratamientos con pH 6. Además, se demostró un efecto sinérgico entre concentraciones de WMEO y valores de pH 4 y 5. Candida krusei al ser una levadura tiende a desarrollarse mejor en ambientes extremos tales como pH ácidos, por dicha razón y basado en estudios anteriores (Abrego et al 2017) se decidió usar rangos de pH más bajos comparados con Salmonella enterica Typhimurium. Las levaduras demoran más tiempo en reproducirse en comparación con las bacterias, por dicha razón para los experimentos con levaduras se realizaron conteos cada 48 horas y de esta forma se determinó si hubo diferencias estadísticas entre las variables evaluadas. Ninguno de los tratamientos usados para Candida krusei mostró valores de células sobrevivientes por debajo del nivel de detección (1 Log UFC/ml). Sin embargo, los tratamientos con pH 4 y 5 fueron los más efectivos para este microorganismo. Asimismo, dichos tratamientos fueron los más estables a través del tiempo. Candida krusei se ha reportado en la literatura como una levadura que es resistente a preservantes como el ácido acético en concentraciones mayores a 1.5% (Casey y Dobson 2003) y generalmente se considera un microorganismo que sobrevive a los ambientes extremos. Sin embargo, en este estudio los resultados fueron diferentes ya que la levadura demostró un efecto fungistático a pH ≤5. 9 Cuadro 4. Recuento de Candida krusei (Log UFC/ml) según exposición a diferentes concentraciones de aceite esencial de mostaza blanca (WMEO) y pH. Los valores representados en el cuadro corresponden al promedio ± desviación estándar de tres repeticiones en duplicado. ABC Medias con letras mayúsculas diferentes en cada columna denotan diferencias entre tratamientos (P<0.05). wxyz Medias con letras minúsculas diferentes en cada fila denotan diferentes entre tiempos de exposición en cada tratamiento (P<0.05). Los recuentos de Candida krusei demostraron que todos los tratamientos con WMEO tuvieron un efecto de reducción logarítmica (Log UFC/ml). Hubo una mejor interacción con pH ácidos, por lo cual, podría ser usado en alimentos con pH ácidos como frutas o en procesos de fermentación de chocolate o café, ya que Candida krusei puede ser deteriorador de dichos productos. Sin embargo, al usar el aceite esencial de mostaza blanca junto con el bajo pH del proceso fermentativo del chocolate podría ser una alternativa para reducir los daños o incluso evitar que dicha levadura reduzca la vida útil del producto (Mazigh 1994). El aceite esencial de mostaza blanca se caracteriza por ser un aceite más estable en temperaturas de congelamiento y en alimentos sólidos que en medios acuosos (David et al. 2013). Al tener dicha estabilidad en temperaturas de congelamiento podría usarse potencialmente en concentrados de frutas congelados donde se ha encontrado incidencias de Candida krusei y Saccharomyces cerevisiae. Del mismo modo, se ha encontrado que Candida krusei es un importante deteriorador en frutas con bajo pH e incluso que se puede encontrar en alimentos que tengan ácidos (Vaughn y Berhow 2005). Se podría usar en productos con pH bajos para alargar la vida anaquel y evitar que se produzca CO2 en los alimentos (Casey and Dobson 2003). Se realizó un estudio previo donde se demostró que al usar 0.20% de WMEO se obtuvo una reducción del 100% de la levadura (Abrego et al. 2017). Tratamiento Tiempo de exposición Concentración WMEO pH 0 h 24 h 48 h 72 h 0% 4 4.51 ± 0.23Az 6.06 ± 0.52Ay 7.29 ± 0.25Ax 7.62 ± 0.35Ax 0% 5 4.45 ± 2.30Az 6.34 ± 0.46Ay 7.15 ± 0.31Ax 7.60 ± 0.30Ax 0% 6 4.53 ± 0.36Az 6.58 ± 0.14Ay 7.28 ± 0.62Axy 7.71 ± 0.11Ax 0.10% 4 4.61 ± 0.12Ax 1.03 ± 0.52Dz 1.70 ± 1.10Dyz 2.03 ± 1.03Dy 0.10% 5 4.54 ± 2.14Ax 1.03 ± 0.52Dz 2.66 ± 0.06Cy 2.03 ± 1.03Dy 0.10% 6 4.55 ± 0.21Az 4.15 ± 2.01Bz 5.81 ± 1.22By 6.72 ± 0.64Bx 0.20% 4 4.61 ± 0.15Ax 1.03 ± 0.52Dz 1.70 ± 1.10Dyz 2.03 ± 1.03Dy 0.20% 5 4.49 ± 2.14Ax 1.03 ± 0.52Dz 2.03 ± 1.03CDy 2.03 ± 1.03Dy 0.20% 6 4.61 ± 0.28Ay 2.68 ± 2.47Cz 5.10 ± 1.38Bxy 5.84 ± 1.46Cx R2 0.93 CV 16.06 10 Los tratamientos con pH 4 y 5 no presentaron diferencias estadísticas significativas en cuanto a crecimiento Log UFC/ml y las concentraciones tampoco indicaron diferencias estadísticas, por lo cual, WMEO se podría usar en alimentos con pH dentro del rango mencionado previamente y usando la concentración más baja lo cual genera una reducción de costos y al mismo tiempo disminuye posibles cambios organolépticos. Efecto del pH en la actividad antimicrobiana del aceite esencia de mostaza blanca contra Saccharomyces cerevisiae. Saccharomyces cerevisiae demostró ser una levadura más susceptible que Candida krusei. los tratamientos más efectivos nuevamente fueron los de pH 4 y 5, alcanzando valores por debajo del límite de detección (1 Log UFC/mL) después de 72 horas aplicado el tratamiento (Cuadro 5). Cuadro 5. Recuentos de Saccharomyces cerevisiae (Log UFC/ml) según exposición a diferentes concentraciones de aceite esencial de mostaza blanca (WMEO) y pH. Tratamiento Tiempo de exposición Concentración WMEO pH 0 h 24 h 48 h 72 h 0% 4 4.17 ± 0.34Ax 6.95 ± 0.09Aw 7.54 ± 0.47Aw 7.36 ± 0.45Aw 0% 5 4.28 ± 0.33Ay 6.98 ± 0.44Aw 7.62 ± 0.48Aw 6.68 ± 1.27Awx 0% 6 4.29 ± 0.31Ax 6.61 ± 0.42Aw 7.28 ± 0.27Aw 7.21 ± 0.27ABw 0.10% 4 4.22 ± 0.27Aw 1.03 ± 0.52Bx 1.03 ± 0.52Dx 0.70 ± 0.00Dxβ 0.10% 5 4.23 ± 0.27Aw 1.03 ± 0.52Bx 1.03 ± 0.52Dx 0.70 ± 0.00Dxβ 0.10% 6 4.60 ± 0.75Ax 3.30 ± 0.65ABy 5.55 ± 0.69Bw 6.03 ± 0.52Bw 0.20% 4 4.14 ± 0.24Aw 1.20 ± 0.84Bx 1.03 ± 0.52Dx 0.70 ± 0.00Dxβ 0.20% 5 4.02 ± 0.27Aw 1.37 ± 1.21Bx 1.03 ± 0.52Dx 0.70 ± 0.00Dxβ 0.20% 6 4.09 ± 0.23Aw 1.03 ± 0.52BCz 2.08 ± 0.69Cy 3.03 ± 2.55Cx R2 0.95 CV 17.43 Los valores representados en el cuadro corresponden al promedio ± desviación estándar de tres repeticiones en duplicado. ABC Medias con letras mayúsculas diferentes en cada columna denotan diferencias entre tratamientos (P<0.05). wxyz Medias con letras minúsculas diferentes en cada fila denotan diferentes entre tiempos de exposición en cada tratamiento (P<0.05). Saccharomyces cerevisiae comúnmente es asociada con la industria del pan o bebidas alcohólicas. Por otra parte, no se encuentra solamente como una levadura benéfica es considerada como un microorganismo deteriorador en alimentos debido a que puede reducir la vida anaquel de estos. Saccharomyces cerevisiae es una levadura que tiene la capacidad de fermentar azúcares y produce CO2 durante este proceso (Stratford 2006) y pueden dañar vinos y otras bebidas como Champagne; estas bebidas se caracterizan por tener pH ácidos 11 por lo cual muchos organismos deterioradores pueden desarrollarse produciendo sabores indeseados. Los vinos al tener un pH ácido podrían usar pequeñas fracciones de WMEO, porque como se ha mencionado WMEO es estable en rangos de pH ácidos y se consideraría un potencial aditivo en vinos y productos fermentados donde pueda haber remanentes de levaduras deterioradoras. Además, podría usarse en frutas u otros productos con pH ácidos. El aceite esencial de mostaza blanca se ha caracterizado por tener una limitada investigación científica en alimentos. Se ha determinado que Saccharomyces cerevisiae se asocia con causar daños en productos lácteos, salsas, y bebidas alcohólicas. Según estudios previos, el consumidor identifica la presencia de levaduras cuando la población entre 105-107 cel/g (Fleet 1992). Con los resultados obtenidos se pudo determinar que al usar WMEO como un aditivo natural se podría reducir la incidencia de levaduras en este tipo de productos, especialmente en salsas donde el sabor de mostaza es más común que en otro tipo de alimentos. La mostaza blanca, al igual que otras especies pertenecen a la familia de las Bracicaceas que se caracterizan por tener varios compuestos fenólicos que como se mencionó previamente funcionan como sistema de defensa en las plantas, sin embargo, es mejor que estos se aíslen y de esta forma puedan ser usados con diferentes técnicas como; nano emulsiones para lavado de productos frescos, Salmonella Typhimurium ha sido evaluada con diferentes aceites esenciales y se ha determinado que mientras más alta las concentraciones, más efectivo es el antimicrobiano (Kang y Song 2018). En el caso de las levaduras, pocas investigaciones se han realizado para esta área, sin embargo, por los resultados obtenidos el uso de WMEO puede servir como una posible alternativa para reducir incidencias de levaduras en alimentos. 12 4. CONCLUSIONES  Se evaluó la actividad antimicrobiana del aceite esencial de mostaza blanca, siendo más efectivo a pH 5 en todos los microorganismos y sin diferencia estadística entre concentraciones, pudiéndose aplicar concentraciones de 0.10% en los alimentos para reducir costos y no afectar características sensoriales.  Se demostró un efecto sinérgico entre pH ácidos y WMEO, además, los tratamientos con pH ácidos fueron más estables a través del tiempo. El pH, por sí solo no demostró un efecto antimicrobiano y a mayores concentraciones más efectivo WMEO en pH neutros. 13 5. RECOMENDACIONES  Realizar investigaciones usando matrices alimenticias y evaluar la interacción entre componentes como agua, grasa, proteínas y carbohidratos.  Evaluar los aspectos sensoriales de la interacción del aceite esencial de mostaza blanca en alimentos.  Determinar la concentración mínima inhibitoria para otros microorganismos deterioradores en alimentos como Pseudomona spp.  Investigar el tiempo máximo de estabilidad de WMEO dependiendo del alimento. 14 6. LITERATURA CITADA Abrego A, Márquez M, Monu E. 2017. Investigación de la actividad anti fúngica del aceite esencial de mostaza blanca, carvacrol y su interacción contra Candida krusei [Tesis]. Escuela Agrícola Panamericana, Zamorano-Honduras. 24 p. Bom IJ, Klis FM, Nobel H de, Brul S. 2001. 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Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 46 1891.343892 41.116172 98.76 <.0001 Error 223 92.840372 0.416325 Corrected Total 269 1984.184265 R-Square Coeff Var Root MSE ufc Mean 0.953210 13.38798 0.645232 4.819489 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F BLK 2 0.7993219 0.3996610 0.96 0.3845 A 2 483.7264459 241.8632230 580.95 <.0001 ph 2 461.6794962 230.8397481 554.47 <.0001 hora 4 302.8042143 75.7010536 181.83 <.0001 a*ph*hora 36 642.3344139 17.8426226 42.86 <.0001 18 Anexo 2.Resumen del análisis estadístico en experimentos con Candida krusei. Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 37 1071.969480 28.972148 60.40 <.0001 Error 178 85.376276 0.479642 Corrected Total 215 1157.345756 R-Square Coeff Var Root MSE ufc Mean 0.926231 16.06679 0.692562 4.310517 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F BLK 2 46.6909774 23.3454887 48.67 <.0001 a 2 486.6279360 243.3139680 507.28 <.0001 ph 2 143.8603017 71.9301509 149.97 <.0001 hora 3 73.3796038 24.4598679 51.00 <.0001 a*ph*hora 28 321.4106613 11.4789522 23.93 <.0001 Anexo 3.Resumen del análisis estadístico en experimentos con Saccharomyces cerevisiae. Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 37 1325.830936 35.833269 84.05 <.0001 Error 178 75.884980 0.426320 Corrected Total 215 1401.715916 R-Square Coeff Var Root MSE ufc Mean 0.945863 17.43295 0.652932 3.745389 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F BLK 2 8.3593982 4.1796991 9.80 <.0001 a 2 789.4657349 394.7328674 925.91 <.0001 ph 2 77.2791341 38.6395670 90.64 <.0001 hora 3 24.7771546 8.2590515 19.37 <.0001 a*ph*hora 28 425.9495142 15.2124826 35.68 <.0001 19 Límite de detección (LDM) indica valores reportados por debajo de 1 Log UFC/ mL. Anexo 4. Comportamiento de Salmonella enterica Typhimurium según exposición al aceite esencial de mostaza blanca (0.00, 0.10 y 0.20%) y pH (5, 6 y 7). 20 Límite de detección (LDM) indica valores reportados por debajo de 1 Log UFC/ mL. Anexo 5.Comportamiento de Candida krusei según exposición al aceite esencial de mostaza blanca (0.00, 0.10 y 0.20%) y pH (4, 5 y 6). 21 Límite de detección (LDM) indica valores reportados por debajo de 1 Log UFC/ mL Anexo 6.Comportamiento de Saccharomyces cerevisiae según exposición al aceite esencial de mostaza blanca (0.00, 0.10 y 0.20%) y pH (4, 5 y 6). Portada Portadilla Página de firmas Resumen Tabla de contenido Índice de cuadros y anexos Introducción Materiales y métodos Resultados y discusión Conclusiones Recomendaciones Literatura citada Anexos