Escuela Agrícola Panamericana, Zamorano Departamento de Ciencia y Producción Agropecuaria Ingeniería Agronómica Proyecto Especial de Graduación Efecto del semen sexado en la producción in vitro de embriones bovinos Estudiante Angie Aracelly Castellanos Fuentes Asesores John Jairo Hincapié, D.Sc. Rogel Castillo, M.Sc. Honduras, septiembre 2024 2 Autoridades SERGIO ANDRÉS RODRÍGUEZ ROYO Rector ANA M. MAIER ACOSTA Vicepresidenta y Decana Académica CELIA O. TREJO RAMOS Directora Departamento de Ciencia y Producción Agropecuaria ANA M. MAIER ACOSTA Secretaría General a.i. 3 Contenido Índice de Cuadros ................................................................................................................................... 5 Índice de Figuras ..................................................................................................................................... 6 Índice de Anexos ..................................................................................................................................... 7 Resumen ................................................................................................................................................. 8 Abstract ................................................................................................................................................... 9 Introducción .......................................................................................................................................... 10 Materiales y Métodos ........................................................................................................................... 13 Localización ........................................................................................................................................... 13 Obtención de los Complejos Cumulus Oocitos (CCO) ........................................................................... 13 Maduración in vitro (MIV) ..................................................................................................................... 14 Fertilización in vitro (FIV) ...................................................................................................................... 14 Acondicionamiento del Semen Convencional ...................................................................................... 15 Acondicionamiento del Semen Sexado................................................................................................. 15 Tratamientos ......................................................................................................................................... 18 Variables Analizadas ............................................................................................................................. 18 Diseño Experimental y Análisis Estadístico ........................................................................................... 18 Resultados y Discusión .......................................................................................................................... 19 Recolección de Oocitos ......................................................................................................................... 19 Porcentaje de Fertilización in vitro (FIV) ............................................................................................... 22 Porcentaje de Clivaje ............................................................................................................................ 23 Eficiencia General ................................................................................................................................. 24 Porcentaje de Embriones/Ovocitos Viables .......................................................................................... 24 Porcentaje de Embriones/Ovocitos Madurados ................................................................................... 24 Porcentaje de Embriones/Ovocitos Fertilizados ................................................................................... 25 4 Porcentaje de Embriones/Ovocitos Clivaje ........................................................................................... 25 Conclusiones ......................................................................................................................................... 30 Recomendaciones ................................................................................................................................. 31 Referencias ............................................................................................................................................ 32 Anexos ................................................................................................................................................... 35 5 Índice de Cuadros Cuadro 1 Clasificación de los Complejos Cumulus Oocitos (CCO) para procesos de producción in vitro (PIV) ....................................................................................................................................................... 14 Cuadro 2 Morfología de los embriones bovinos de acuerdo con el estado embrionario .................... 17 Cuadro 3 Clasificación de los embriones de acuerdo con la calidad .................................................... 17 Cuadro 4 Valores porcentuales de ovocitos fertilizados, en clivaje y embriones ................................. 23 Cuadro 5 Eficiencia del procedimiento de FIV, en relación con los embriones producidos con los ovocitos viables, madurados, fertilizados y clivaje. .............................................................................. 26 6 Índice de Figuras Figura 1 Ovario de vaca faenada ........................................................................................................... 20 Figura 2 Aspiración folicular de oocitos ................................................................................................ 21 Figura 3 Obtención de oocitos .............................................................................................................. 21 Figura 4 Oocitos madurados ................................................................................................................. 22 7 Índice de Anexos Anexo A Materiales utilizados .............................................................................................................. 35 Anexo B Dia -1 Lavado de ovarios ......................................................................................................... 36 Anexo C Día -1 Aspiración folicular mediante el uso de jeringas .......................................................... 37 Anexo D Semen convencional (no sexado) ........................................................................................... 38 Anexo E Día 0 proceso de co-cultivo en fertilización ............................................................................ 39 Anexo F Día 0 Percoll ............................................................................................................................ 40 Anexo G Día 1 semen convencional ...................................................................................................... 41 Anexo H Día 3 semen convencional ...................................................................................................... 42 Anexo I Día 7 blastos semen convencional ........................................................................................... 43 8 Resumen El semen sexado surgió principalmente en ganado lechero para incrementar la cantidad de hembras con alta capacidad reproductiva y buena genética. Tradicionalmente, se ha utilizado semen convencional, pero el semen sexado presenta una alternativa prometedora al permitir un mayor control sobre el sexo de las crías. Sin embargo, existe incertidumbre sobre su eficiencia y viabilidad comparado con el semen convencional. El objetivo de esta investigación fue evaluar el efecto del semen sexado vs. semen convencional en la producción in vitro de embriones bovinos. La investigación se realizó en el laboratorio de reproducción animal de la Escuela Agrícola Panamericana, Zamorano. Se aspiraron 28 ovarios de vacas faenadas en la planta de cárnicos de la Empresa Agropecuaria S.A. (EMPASA), dividiéndose en partes iguales para cada tratamiento. De 184 oocitos aspirados, 160 fueron viables y fertilizados. Se utilizó un diseño completamente aleatorizado (DCA) con dos tratamientos (PIV-convencional y PIV-sexado). Para el análisis de datos se usó la prueba Chi- Cuadrado (χ2). Los ovarios se transportaron, acondicionaron y suplementaron con antibióticos (estreptomicina 0.5 g/litro + penicilina G 100,000 UI/litro), se utilizaron los medios Minitube® de maduración, capacitación, fertilización y cultivo in vitro. El semen utilizado fue de un mismo toro Holstein, sexado para hembra. Se encontró diferencia (P ≤ 0.05) entre el semen convencional y sexado en el porcentaje de clivaje (81.97% vs. 58.14%), fertilización in vitro (87.14% vs. 61.43%) y porcentaje de embriones (78% vs. 56%), respectivamente, siendo el semen convencional más eficiente. En conclusión, bajo las condiciones de este estudio, el semen convencional mostró mayor eficiencia en la producción in vitro de embriones bovinos, sin embargo, los porcentajes de embriones obtenidos en ambos tratamientos se encuentran dentro los valores establecidos como muy buenos en la PIV (producción in vitro). Palabras clave: Apoptosis, blastocitos, células del cumulus, clivaje 9 Abstract Sexed semen emerged mainly in dairy cattle to increase the number of females with high reproductive capacity and good genetic traits. Traditionally, conventional semen has been used, but sexed semen presents a promising alternative by allowing greater control over the sex of the offspring. However, there is uncertainty about its efficiency and viability compared to conventional semen. The objective of this research was to evaluate the effect of sexed semen vs. conventional semen in the in vitro production of bovine embryos. The research was carried out in the animal reproduction laboratory of the Escuela Agrícola Panamericana, Zamorano. Twenty-eight ovaries were aspirated from cows slaughtered at the meat plant of Empresa Agropecuaria S.A. (EMPASA), dividing them equally for each treatment. Of 184 oocytes aspirated, 160 were viable and fertilized. A completely randomized design (CRD) with two treatments (PIV-conventional and PIV-sexed) was used. Chi-Square (χ2) test was applied for data analysis. Ovaries were transported, conditioned and supplemented with antibiotics (streptomycin 0.5 g/liter + penicillin G 100,000 IU/liter), Minitube® media were used for maturation, capacitation, fertilization and in vitro culture. The semen used was from the same Holstein bull, sexed for female. A difference (P ≤ 0.05) was found between conventional and sexed semen in the percentage of cleavage (81.97% vs. 58.14%), in vitro fertilization (87.14% vs. 61.43%) and percentage of embryos (78% vs. 56%), respectively, with conventional semen being more efficient. In conclusion, under the conditions of this study, conventional semen showed greater efficiency in the in vitro production of bovine embryos; however, the percentages of embryos obtained in both treatments are within the values established as very good in IVP (in vitro production). Keywords: Apoptosis, blastocysts, cumulus cells and cleavage 10 Introducción La agricultura sostenible se beneficia significativamente de la ganadería, ya que desempeña un papel fundamental al promover la seguridad alimentaria, mejorar la nutrición, combatir la pobreza y fomentar el crecimiento económico. Cuando se implementan las técnicas más avanzadas, el sector puede minimizar su huella ambiental y optimizar el aprovechamiento de los recursos (Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura [FAO], 2024). Uno de los progresos tecnológicos más destacados en el ámbito de la reproducción de bovinos ha sido la inseminación artificial. Esta técnica ha revolucionado la industria ganadera al permitir una reproducción más eficiente y selectiva. La inseminación artificial no solo mejora la genética de los hatos, sino que también reduce los costos asociados con la cría y acelera la propagación de características deseables, como el rendimiento de leche o la terneza de la carne. Además, contribuye a la conservación de razas ganaderas en riesgo de desaparición y disminuye el riesgo de transmisión de enfermedades. Es una herramienta crucial para garantizar la sostenibilidad y la capacidad competitiva de la industria ganadera en un entorno mundial en constante transformación (Rosete Fernández et al., 2021). A través de los siglos en la evolución de la ganadería, uno de los principales objetivos ha sido el control del género de la progenie. En 1992 se adoptó la citometría de flujo, un método que posibilita discernir entre los espermatozoides X y Y en función de su contenido de ADN. La precisión en la determinación del sexo alcanza aproximadamente un 90%, y la tasa de nacimientos de terneros sanos es comparable a la que se obtiene con la inseminación convencional (Oses et al., 2009). El procedimiento de determinar el sexo del semen comprende la separación de los espermatozoides que llevan el cromosoma X de los que transportan el cromosoma Y. Esta técnica se hace posible debido a una diferencia en la carga de ADN entre los espermatozoides con el cromosoma X y los que llevan el cromosoma Y en bovinos, donde los espermatozoides con cromosoma X presentan un 3.8% más de material genético que los que poseen el cromosoma Y (Echeverri Echeverry, 2015). 11 El propósito del semen sexado es incrementar la cantidad de hembras en la descendencia, permitiendo así el desarrollo de un rebaño con genética comprobada y de calidad superior, donde la inseminación se realiza con semen de alta calidad y se emplean las propias vacas del establecimiento para criar a la progenie (Jimenez Escobar, 2017). La transferencia de embriones es un procedimiento en el que el papel de la parte materna resulta significativo en términos de las tasas de respuesta genética. La utilización de esta tecnología posibilita acelerar el progreso genético al incorporar la contribución de ambos sexos. Además, los criadores comerciales, tanto en la industria ganadera de carne como de leche, pueden obtener ventajas sustanciales mediante la implementación de programas de transferencia de embriones adecuadamente diseñados, que se adapten a sus condiciones ambientales y objetivos específicos de selección (Seidel, 1981). El término "Fecundación in vitro" (FIV) se refiere a la fertilización que se lleva a cabo en un entorno de laboratorio, donde se controlan los procesos de maduración y la interacción entre los óvulos y los espermatozoides, con el propósito de generar embriones (Jacobson et al., 2022). En el contexto de la FIV en bovinos, este procedimiento abarca varias etapas, que incluyen la recuperación y clasificación de óvulos de especímenes obtenidos en mataderos o de hembras vivas, la maduración de los Complejos Cumulus-Ovocitos (COC), la fertilización y el cultivo del desarrollo de los cigotos. Los embriones resultantes pueden ser destinados a receptoras, congelados o utilizados para investigaciones. Es relevante mencionar que, en laboratorios de investigación, se emplean ovarios de hembras faenadas para obtener los óvulos, los cuales tienen un valor genético prácticamente nulo. Por supuesto, en programas de reproducción, los óvulos provienen de hembras con un alto valor genético (Fillipiak y Larocca, 2010). Estudios acerca de la aplicación de esta tecnología para la diferenciación de género en el semen indican que se puede lograr una tasa de concepción aproximadamente un 20% menor en comparación con el rendimiento obtenido utilizando semen convencional en novillas que no han sido 12 previamente inseminadas (Laguado, 2007). Esta disminución en la fertilidad del semen sexado ha sido principalmente atribuida a dos factores clave: 1) el estrés que se produce durante el proceso de sexaje y 2) la baja concentración de espermatozoides por unidad de semen. El procedimiento de separación de espermatozoides a través de la citometría de flujo puede provocar alteraciones a nivel celular que influyen en la integridad de la membrana plasmática, limitando así la viabilidad, la capacidad de conservación, la eficacia en la fecundación y acortando la vida útil de las células (Mora Muñoz, 2018). Debido a lo expuesto, esta investigación tuvo como objetivo evaluar el efecto del uso de semen sexado en la producción in vitro de embriones bovinos, y la calidad de los embriones en función de su estado embrionario. Además, se determinó el porcentaje de clivaje y apoptosis, junto con el porcentaje y la eficiencia de la fertilización in vitro. 13 Materiales y Métodos Localización La investigación se desarrolló entre octubre/2023 y julio/2024 en el laboratorio de biotecnología de la reproducción animal de Zamorano, localizado en el Valle del Río Yegüare distante 32 km de Tegucigalpa, Honduras, con unas condiciones climáticas de precipitación promedio anual, altura sobre el nivel del mar y temperatura promedio anual de 1100 mm, 800 msnm y 26 °C, respectivamente. Los ovarios fueron colectados de vacas faenadas en la planta de cárnicos de la Empresa Agropecuaria S.A. (EMPASA), ubicada a 5 km de las instalaciones del laboratorio. Los ovarios fueron transportados al laboratorio en solución salina (0.9% NaCl) a 32-35 °C suplementada con antibióticos (estreptomicina [SIGMA S6501] 0.5 g/litro + penicilina G [SIGMA P7794] 100,000 UI/litro), y en un tiempo no mayor de cuatro horas. Una vez en laboratorio se acondicionaron los ovarios (se retiraron los restos de tejidos peri-ováricos, grasa y sangre). Obtención de los Complejos Cumulus Oocitos (CCO) Se aspiraron solamente los folículos con un diámetro aproximado de 4 a 10 mm utilizando jeringas de dos piezas y agujas calibre 18 × 1½ pulgadas estériles; el líquido folicular se depositó en un tubo de 50 mL de policarbonato estéril con 5 mL de Medio de Colección de Oocitos (MCO) de Minitube 19990/0050® (10 mL de MCO + 60 mg de Suero Albúmina Bovino EFAF [SIGMA A8806] atemperada a 38 °C cuatro horas antes de realizar la maniobra). Una vez colectado el fluido folicular, el tubo fue colocado en el baño maría (38 °C) durante 15 minutos a fin de permitir que los oocitos se precipitaran; luego se eliminó el sobrenadante hasta dejar solamente de 5-7 mL de fluido el cual fue vertido en una placa grid para comenzar con la búsqueda bajo la lupa estereoscópica (8X) de los CCO. Se utilizaron los criterios de De Wit et al. (2000) para la clasificación de los CCO utilizando solo los CCO con calidad 1 y 2 (Cuadro 1) y fueron lavados cuatro veces en MCO y una vez en MMO. 14 Maduración in vitro (MIV) Se prepararon microgotas flotantes de 100 µl de Medio de Maduración de Oocitos (MMO), utilizando la proporción de 1 CCO/10 µl de MMO, y cubiertas con aceite mineral (SIGMA M8410) en cajas Petri de 60 × 10 mm, e incubadas a 38.5 °C, 5% de CO2, 20% de O2, 75% de N2 y saturación de humedad relativa (HR), durante 24 horas. Para la preparación del MMO suplementado, se utilizaron 9 mL del MMO stock de Minitube MMO 19990/0010® + 1 mL de suero de vaca en celo + 100 µl de FSH stock (Sioux Biochemical Inc. 715) + 50 µl de LH stock (Sioux Biochemical Inc. 725) + 135 µl EGF (5 ng/mL) + 10 µM /mL de IGF-1; las microgotas se prepararon tres horas antes y se dejaron equilibrando en la incubadora. Cuadro 1 Clasificación de los Complejos Cumulus Oocitos (CCO) para procesos de producción in vitro (PIV) Clasificación Categoría Células del cumulus Citoplasma 1 Excelente Capas múltiples y compactas de células (4 o más) Homogéneo y transparente 2 Bueno Capas múltiples de células (entre una y tres) Homogéneo con zonas periféricas oscuras 3 Regular Sin células (Denudados) Irregular con zonas oscuras 4 Malo Células expandidas Irregular con zonas oscuras Nota. Adaptado de Wit et al. (2000) Fertilización in vitro (FIV) Para el semen convencional se utilizó el medio de acondicionamiento y capacitación Minitube® 19990/0020 stock (10 mL + 60 mg Suero Albúmina Bovino fracción V [SIGMA A8806] + 500 µl piruvato de sodio [SIGMA P3662 solución stock] + 200 µl gentamicina [SIGMA G1397]). De este medio suplementado fueron utilizados 8 mL como solución de lavado de espermas y 2 mL para preparar el gradiente de Percoll 45-90%; la preparación de este medio suplementado se realizó tres horas antes de la maniobra y fue llevado a la incubadora a 38.5 °C, 20% de O2, 5% CO2, 75% N2 y humedad relativa a saturación (> 90%). Para la fertilización propiamente dicha, se utilizó el medio Minitube® 19990/0030 stock (10 mL + 60 mg Suero Albúmina Bovino EFAF [SIGMA A8806] + 100 µl piruvato de sodio [SIGMA P3662] + 15 200 µl heparina [SIGMA H3393]); de esta solución suplementada se colocaron 600 µl en cada pozo de la placa nunc de fertilización (no cubrir con aceite) y llevadas a la incubadora a 38.5 °C, 20% de O2, 5% CO2 y humedad relativa a saturación (> 90%) mínimo tres horas antes de realizar la maniobra. Cumplido el tiempo de MIV, los CCO fueron lavados por tres ocasiones con medio FIV suplementado y transferidos a las placas nunc de fertilización, se colocaron 40 CCO/pozo. Acondicionamiento del Semen Convencional Para preparar el gradiente de Percoll 45-90% que sirvió para el acondicionamiento del semen convencional, se utilizó un tubo de policarbonato de 15 mL colocando en el tubo que contiene el Percoll 45% por sotoposición el gradiente 90% (SIGMA P4937). El semen fue descongelado en agua a 35 °C durante 45 segundos y posteriormente depositado suavemente sobre el gradiente de Percoll 45-90% el cual posteriormente fue centrifugado a 1000 g/10 minutos, posteriormente el pellet se extrajo y se depositó en la solución de lavado y se llevó nuevamente a la centrífuga atemperada (38 °C) a 200 g/10 minutos, el pellet resultante fue aspirado en 200 µl de medio y colocado en 300 µl de medio FIV, de acá se tomó una muestra para evaluar la motilidad individual y la concentración en la cámara de Neubauer, ajustando la concentración a 2 × 106 espermas/mL. Se utilizó como concentración de espermas un promedio de 6000 espermas/CCO. Se utilizó semen congelado empacado tanto en forma convencional como sexado del mismo toro Holstein. El tiempo de FIV fue de 18 horas para ambos tratamientos. Acondicionamiento del Semen Sexado Se utilizó semen del mismo toro, pero sexado para hembra. Se utilizó el mismo medio de acondicionamiento y capacitación Minitube® 19990/0020 stock (10 mL + 60 mg Suero Albúmina Bovino fracción V [SIGMA A8806] + 500 µl piruvato de sodio [SIGMA P3662 solución stock] + 200 µl gentamicina [SIGMA G1397]). Este medio suplementado fue repartido en dos tubos cada uno con 3 mL. Se realizaron dos lavados: depositando el semen de una pajuela en un tubo y luego se centrifugaron a 200 g/10 minutos, luego se retiró el pellet y realizó una segunda centrifugación 16 igualmente a 200 g/10 minutos, luego se retiró el pellet y se depositó en 300 µl de medio FIV suplementado, para calcular la concentración se utilizó la cámara de Neubauer y se inseminó los pozos conservando la misma concentración de espermas/oocito mencionada anteriormente. Cultivo in vitro (CIV) Para esta etapa se utilizó el medio de Fluido Sintético de Oviducto (SOF por sus siglas en inglés), colocando 10 mL del medio de cultivo SOF Minitube 19990/0041® stock + 1 mL suero de vaca en celo + 400 µl aminoácidos esenciales (SIGMA B6676) + 100 µl aminoácidos no esenciales (SIGMA M7145) + 60 µl gentamicina (SIGMA G1397); se depositaron 400 µl del medio SOF suplementado/pozo de la placa nunc de CIV y se cubrieron con aceite mineral (SIGMA M8410). La preparación de las placas de CIV se realizó tres horas antes de la maniobra y fueron equilibradas en la incubadora a 38.5 °C, 5% de O2, 5% CO2, 90% N2 y humedad relativa a saturación (> 90%). Transcurridas las 18 horas de FIV, los presuntos cigotos fueron sometidos al proceso de denudación el cual consistió en remover las células del cumulus oophorus a través de la agitación en vortex durante 3 minutos en solución de 900 µl de SOF suplementado + 100 µl de Hialuronidasa, luego fueron lavados tres veces en SOF y transferidos a las placas de cultivo colocando 40 presuntos cigotos/pozo. Transcurridas 72 horas se realizó la suplementación de cada pozo con Suero Fetal Bovino (SFB) en proporción del 10% del volumen total de CIV, además a este mismo tiempo se evaluó el porcentaje de clivaje. Los cultivos fueron evaluados a las 168 horas (7 días) y 192 horas (ocho días) para determinar la producción de blastocistos, los cuales fueron clasificados con base en los criterios de la Sociedad Internacional de Tecnología de Embriones (IETS 2009) (Cuadro 2 y 3). 17 Cuadro 2 Morfología de los embriones bovinos de acuerdo con el estado embrionario Estado embrionario Morfología Blastocisto temprano (Bt) Día 6-7, 100-200 blastómeros. Inicio del transporte de fluido en las células trofo-ectodérmicas (inicia formación del blastocele). El MCI ocupa alrededor del 70-80% del espacio peri-vitelino. Se puede diferenciar el trofoblasto del MCI Blastocisto (B) Día 7-8, 100-200 células aproximadamente. Marcada diferenciación entre las células del trofoblasto, que constituyen una pared –que se adosa a la zona pelúcida- y el MCI (o disco embrionario de color oscuro). Blastocisto Expandido (Be) Días 7-8, más de 200 células. El diámetro aumenta considerablemente (1.2 a 1.5 veces) con el consecuente adelgazamiento de la ZP a 1/3 de su espesor original. La presión creciente del blastocisto provoca la ruptura de la ZP a través de la cual comenzará la protrusión hacia el día 8 Blastocisto protruido (Bp) Días 8-9, 200-800 células. Los embriones abandonan la ZP. Forma esférica con blastocele definido. Nota. Adaptado de International Embryo Technology Society (2009). Cuadro 3 Clasificación de los embriones de acuerdo con la calidad Calidad Descripción Excelentes (Clase 1) Un embrión ideal, esférico, simétrico y con células de tamaño, color y textura uniforme. Zona pelúcida intacta. Debe coincidir con su edad Buenos (Clase 2) Presentan pequeñas imperfecciones, como unas pocos blastómeros de forma irregular y posee una pequeña cantidad de detritus celulares. Zona pelúcida intacta Regulares (Clase 3) Problemas más definidos que incluyen blastómeros desprendidos e irregulares, vesículas y algunas células degeneradas, detritus celulares. Zona pelúcida intacta o ligero agrietamiento. Un 60% de los blastómeros es normal. Desarrollo retrasado. Color muy oscuro o claro. Malos (Clase 4) Embriones que presentan problemas severos, como numerosos blastómeros desprendidos, células degeneradas y/o fragmentadas, células de variables tamaños, numerosas vesículas, pero una aparente masa de embrión viable. Retraso de más de dos días en el desarrollo. Menos del 30% de blastómeros intactos. Ruptura de la ZP. Estos embriones generalmente no son de calidad para transferirlos. Degenerados (Clase 5) Degeneración grave. Serios problemas de apoptosis. Zona pelúcida intacta. Cúmulo celular suelto y degenerado, blastómeros pignóticos Nota. Adaptado de IETS (2009). 18 Tratamientos Se utilizaron 140 oocitos distribuidos en dos tratamientos (70 oocitos/tratamiento): Tratamiento 1: protocolo de producción in vitro utilizando semen convencional (PIV convencional) Tratamiento 2: protocolo de producción in vitro utilizando semen sexado para hembra (PIV sexado) Variables Analizadas Se analizaron las siguientes variables: Porcentaje de fertilización in vitro Porcentaje de clivaje (división celular) y apoptosis (muerte celular) Porcentaje de embriones obtenidos (blastocistos) Porcentajes de eficiencia general Diseño Experimental y Análisis Estadístico Se utilizó un diseño completamente aleatorizado (DCA) con dos tratamientos (PIV- convencional y PIV-sexado) y 70 oocitos/tratamiento. Para el análisis de los datos se aplicó la prueba de distribución de frecuencias Chi-Cuadrado (χ2) con la ayuda del programa estadístico Statistical Analysis Systems (SAS® 2014 versión 9.4), con un nivel de significancia exigido de P ≤ 0.05. 19 Resultados y Discusión Recolección de Oocitos La FIV implica la maduración artificial de oocitos (células germinativas no fecundadas) recolectados de vacas faenadas o mediante aspiración folicular guiada por ultrasonido en donadoras vivas. Estos oocitos son fecundados con espermatozoides previamente crio-conservados y capacitados según criterios de calidad. El proceso genera embriones en la etapa de cigotos, los cuales se incuban hasta convertirse en blastocistos. Esta técnica permite obtener un alto número de embriones en una fase específica de su desarrollo (Aragonés et al., 2022). Otros autores, también destacan la importancia de la clasificación de los oocitos, ya que, se debe considerar el cumulus oophorus, idealmente con cuatro o más capas compactas de células y un citoplasma homogéneo que presenta un color oscuro en su periferia. Además del número de capas de células alrededor del oocito y la uniformidad del citoplasma (Martínez, 2013). Los oocitos fueron aspirados mediante la técnica de aspiración folicular. En este estudio, la selección fue basada en una categoría de diámetro aproximadamente de 4 a 10 mm (Figura 1 y 2). Se procesaron 28 ovarios, y aspiraron un total de 184 oocitos, de los cuales solo el 160 (87.5%) fueron viables, y se obtuvo un número de 24 (12.5%) de oocitos degenerados. Estrella et al. (2017), realizaron una selección con base en un diámetro de 4 a 8 mm, obteniendo un 66% de oocitos viables, por lo que, según este estudio, es posible que exista una relación entre el diámetro con el porcentaje de viabilidad. Dado esto, se podría determinar que a un mayor rango de selección de diámetro (4-10 mm), se puede aumentar hasta en un 21.5% más de viabilidad (Cuadro 4). Los ovarios de hembras castradas y los obtenidos en plantas de faenado animal han sido la fuente de material más utilizada desde los inicios de los trabajos con esta técnica. Debido a la disponibilidad de una gran cantidad de ovarios, esto facilitó avances rápidos en su desarrollo (Ferré y Cattaneo, 2013). 20 Figura 1 Ovario de vaca faenada Se calculó el promedio de ovocitos aspirados, viables y degenerados con relación al número de ovarios procesados (28). El promedio de ovocitos aspirados por ovario indica que, en promedio, se aspiraron aproximadamente 6.57 ovocitos por cada ovario procesado (Figura 2 y 3). Es una medida de la cantidad de ovocitos obtenidos por cada unidad de ovario analizado. El promedio de ovocitos viables por ovario fue de 5.71, lo que representa el promedio de ovocitos que se consideraron viables y adecuados para procedimientos adicionales, como la fertilización in vitro. Este valor indica la eficacia del proceso de aspiración y selección de ovocitos viables. De la misma forma, el promedio de ovocitos degenerados por ovario fue de 0.86, lo que refleja la cantidad de ovocitos que no eran viables o que mostraron signos de degeneración durante el proceso de aspiración. Es crucial para evaluar la calidad del manejo de los ovocitos durante la recolección. De los 160 ovocitos viables, el 87.5% de ellos (140 ovocitos) maduraron satisfactoriamente para ser considerados aptos para fertilización, y repartidos en los dos tratamientos (Figura 4). 21 Figura 2 Aspiración folicular de oocitos Figura 3 Obtención de oocitos 22 Figura 4 Oocitos madurados Porcentaje de Fertilización in vitro (FIV) La aplicación de la técnica producción in vitro de embriones está creciendo por varias razones clave, incluyendo una mayor producción de embriones en menos tiempo mediante aspiraciones foliculares frecuentes, la posibilidad de obtener embriones de hembras en diversas condiciones fisiológicas, un mayor progreso genético al utilizar toros de alto mérito genético, la modificación de la relación de sexos mediante semen sexado (SS), la garantía de reposición de hembras y la facilitación de la erradicación de enfermedades en el establecimiento (Ferré y Cattaneo, 2013). Se encontró diferencia (P ≤ 0.05) en el porcentaje de ovocitos fertilizados, siendo el tratamiento PIV-convencional el que obtuvo el mayor porcentaje superando al PIV-sexado en 25.71% (Cuadro 4). Bonilla León et al. (2018) obtuvieron resultados de 74.5% para semen convencional y 69.6% para semen sexado, valores similares a los obtenidos en este estudio, ya que, el porcentaje de ovocitos fertilizados de semen convencional fue superior, sin embargo, el tratamiento sexado fue inferior por un 8.17%. 23 Porcentaje de Clivaje De la misma forma, se encontró diferencias (P ≤ 0.05) para los tratamientos semen convencional y semen sexado para la variable clivaje, superando el semen convencional al sexado en 23.83% (Cuadro 4), e igual situación en el porcentaje de apoptosis, el menor valor lo obtuvo el convencional (Cuadro 4). Crespo Calva y Guamán Gutiérrez (2015) obtuvieron 39.80% de apoptosis utilizando semen convencional, valor que se asemeja más a la apoptosis del semen sexado de este estudio, en comparación al bajo porcentaje que se obtuvo con el semen convencional. Por otro lado, estos mismos autores, obtuvieron un clivaje de 60.20% similar al resultado de este estudio con el semen sexado e inferior al porcentaje obtenido con el tratamiento convencional. Cuadro 4 Valores porcentuales de ovocitos fertilizados, en clivaje y embriones Tratamiento Ovocitos Fertilizados (%) Ovocitos Clivaje (%) Apoptosis (%) Embriones (%) Convencional 87.14 81.97 18.03 78 Sexado 61.43 58.14 41.86 56 CV 20.3794 18.7505 32.8235 17.3866 Probabilidad 0.0005 0.0076 0.0076 0.0485 Porcentaje de Embriones Hubo diferencia (P ≤ 0.05) entre los tratamientos (Cuadro 4), siendo el tratamiento con semen convencional el que superó al semen sexado en 22%, sin embargo, ambos valores obtenidos en esta investigación se encuentran dentro de los rangos establecidos por Lonergan et al. (2001) como muy buenos, ya que este autor reporta que lo esperado en el porcentaje de embriones en un laboratorio de PIV debe oscilar entre 25-40%, por lo tanto la decisión en el uso del semen convencional o sexado en la PIV recae directamente sobre el objetivo y la meta de la explotación pecuaria, si requieren exclusivamente de la producción de embriones de un determinado sexo o es indiferente el sexo y se desea producir embriones en cantidad. 24 En la última década se han alcanzado importantes avances en el establecimiento de un método eficaz para la producción en masa de embriones bovinos, incluidos los sexados. Este progreso no solo ha generado beneficios económicos directos, sino que también ha contribuido al desarrollo de otras biotecnologías como el clonado y la transgénesis animal, mediante mejoras en procesos fundamentales como la maduración de óvulos, la capacitación de espermatozoides, la fecundación y el desarrollo embrionario inicial (Ferré y Cattaneo, 2013). Eficiencia General Porcentaje de Embriones/Ovocitos Viables Se encontró una diferencia (P ≤ 0.05), en el porcentaje de embriones por ovocitos viables, siendo el tratamiento convencional el más eficiente en la producción de embriones por cada ovocito viable (Cuadro 5). Oses et al. (2009) mencionan que los porcentajes más bajos obtenidos con semen sexado son producto de altas contaminaciones, sin embargo, concluyeron que la tasa aceptable de blastocitos adquiridos en uno de sus grupos expresa que el semen sexado puede ser utilizado para la producción in vitro de embriones, sin embargo, sugiere que se realicen mejoras para minimizar el daño durante el proceso, y que su aplicación comercial sea exitosa. Considerando que los resultados son variables, Xu et al. (2009), y otros investigadores han realizado estudios orientados a mejorar las tasas de división y la calidad embrionaria. Los factores tomados en consideración son maduración de los ovocitos, proceso de sexado, concentración espermática, cultivo de los embriones y criopreservación de estos. Porcentaje de Embriones/Ovocitos Madurados La maduración ovocitaria, también conocida como "maduración meiótica", es el proceso durante el cual el ovocito reanuda la meiosis, que había sido interrumpida en el estado de dictioteno de la profase I, hasta alcanzar el estadio de metafase II. Durante este proceso, los ovocitos adquieren la capacidad de ser fertilizados normalmente y de desarrollarse adecuadamente hasta el estadio embrionario (Ferré y Cattaneo, 2013). 25 Se encontró una diferencia (P ≤ 0.05) en el porcentaje de embriones por ovocitos madurados entre el tratamiento convencional y sexado (Cuadro 5). El semen sexado mostró un rendimiento inferior en un 35.71% en comparación con el tratamiento convencional. En investigaciones previas de producción in vitro de embriones bovinos utilizando semen convencional de diferentes razas de toros, se reportaron porcentajes de maduración de ovocitos de 66.17%, 50.94%, y 59.50% (Báez Contreras et al., 2010). Estos hallazgos subrayan la marcada disparidad en la eficacia de la maduración ovocitaria entre los métodos de inseminación, destacando la importancia de investigaciones adicionales para comprender las causas subyacentes de estas diferencias. Porcentaje de Embriones/Ovocitos Fertilizados En el caso del semen sexado (SS), generalmente con una pajuela se pueden fecundar entre 100 y 120 ovocitos. La tasa de fertilización, medida como la tasa de clivaje a las 48 horas después de la inseminación, típicamente varía entre el 70% y el 85% de los ovocitos expuestos a los espermatozoides (Ferré y Cattaneo, 2013). Se encontró una diferencia (P ≤ 0.05) en el porcentaje de ovocitos fertilizados entre el semen convencional y el tratamiento sexado (Cuadro 5). El semen convencional mostró una eficiencia considerablemente mayor, superando casi el doble del porcentaje obtenido con el sexaje del semen (31.37%). Estos hallazgos subrayan la superioridad del semen convencional en términos de fertilización in vitro. Díez Monfarte et al. (2022) mencionan que la técnica de OPU-FIV es mucho más eficiente para mejorar las tasas de fertilidad del semen sexado, ya que permite reducir la cantidad de espermatozoides necesarios para la fecundación de los ovocitos, por lo que podría ser utilizada para obtener mejores resultados que sean superiores o iguales a los del semen convencional. Porcentaje de Embriones/Ovocitos Clivaje Nuevamente, se observa una diferencia (P ≤ 0.05) en el porcentaje de embriones por ovocitos en la etapa de clivaje entre tratamientos (Cuadro 5), sin embargo, los valores obtenidos con el semen 26 sexado se encuentran dentro de lo establecido y considerado por la literatura internacional como muy bueno (Lonergan et al., 2001). Los resultados de Lucyna et al. (2006) coinciden con los obtenidos en este estudio, con diferencias significativas en el clivaje. Esto indica que el tratamiento convencional es más eficiente en producción de embriones, sin embargo, el semen sexado tiene una tasa de aceptación muy buena. Machado et al. (2009) obtuvieron un porcentaje de clivaje de 65 - 85% y de desarrollo embrionario de 17 - 47%; en este estudio, si bien se obtuvo un menor porcentaje de clivaje, el desarrollo embrionario fue mayor en un 9% más que el rango máximo obtenido en su investigación. De la misma forma, Promthep et al. (2015) tuvieron un 88% de clivaje y un 34% de desarrollo, superando el porcentaje de clivaje, pero con un 22% menos en cuanto al desarrollo embrionario. Asimismo, en el estudio de Oses et al. (2009), la tasa porcentual de división embrionaria obtenida con semen sexado (80.6 ± 3.2) fue superior que con semen convencional (68.2 ± 4.5; P < 0.01); sin embargo, al analizar el porcentaje de blastocistos, los resultados fueron opuestos (10.6 ± 4.5 vs. 22.2 ± 3.3, respectivamente; P < 0.01). Aunque el semen sexado puede iniciar la división celular de manera eficiente, las manipulaciones y el estrés involucrado en el proceso de sexado pueden comprometer la calidad de los espermatozoides, afectando negativamente las etapas posteriores del desarrollo embrionario, como la formación de blastocistos. Cuadro 5 Eficiencia del procedimiento de FIV, en relación con los embriones producidos con los ovocitos viables, madurados, fertilizados y clivaje. Tratamiento Embriones/ ovocitos viables (%) Embriones/ ovocitos madurados (%) Embriones/ ovocitos fertilizados (%) Embriones/ ovocitos en clivaje (%) Convencional 48.75 55.71 63.93 78.00 Sexado 17.50 20.00 32.56 56.00 CV 18.3461 18.3741 12.1813 17.3866 Probabilidad <0.0001 <0.0001 0.0016 0.0485 Araujo et al. (2014) señalan que se observó una alta contaminación en los medios de cultivo de embriones fertilizados con semen sexado. Las tasas de desarrollo de blastocistos fueron 27 notablemente menores para los ovocitos fertilizados con semen sexado en comparación con el semen convencional. Razón por la que se debe considerar tener el mayor cuidado posible durante el proceso cualquier foco de contaminación para que haya la menor cantidad posible de embriones no viables. Por otro lado, Filipiak et al. (2017) determinaron que la capacitación de espermatozoides en la fertilización in vitro (FIV) es crucial para lograr altos índices de producción de embriones. Se han creado diversos medios de cultivo, entre los cuales la centrifugación en gradientes de densidad de Percoll destaca por su capacidad de distinguir entre espermatozoides vivos y muertos. Por otro lado, el medio BO (Brackett y Oliphant, 1975) capacita a los espermatozoides sin efectuar esta selección. Por lo que, en este estudio se concluye que el uso de Percoll es efectivo para seleccionar espermatozoides viables, lo que resulta en una mayor producción de embriones. La FIV puede ser una herramienta efectiva para producir embriones del sexo deseado en la producción bovina, lo que incrementa los reemplazos (Filipiak et al., 2017). La Comisión Sectorial de Investigación Científica (2015) afirma que el semen sexado tiene el potencial de mejorar los programas reproductivos, aunque con un costo elevado. Una limitación del semen sexado es su menor fertilidad en la inseminación artificial. Sin embargo, mencionan que la FIV podría aumentar las posibilidades de uso del semen sexado como modelo experimental y permitir la obtención de más embriones del sexo deseado. Además, junto con la técnica de punción folicular in vivo (OPU), aplicada a vacas selectas a nivel de producción, podría tener un impacto significativo. Tradicionalmente, la Transferencia Embrionaria (TE) se centraba en técnicas de superovulación y producción de embriones establecidas desde hace casi tres décadas. Sin embargo, en la última década, la tecnología in vitro ha ganado terreno significativo en muchos países. La Fecundación in vitro (FIV) se prefiere en casos como donantes prepúberes, uso de semen sexado en vacas mayores, producción intensiva de embriones, y cuando hay disponibilidad limitada de semen por costo o disponibilidad. En cambio, la TE in vivo es ideal para novillas o vacas jóvenes cíclicas que 28 siempre están vacías, con objetivos moderados de producción y cuando se desea congelar embriones para banco o comercialización, sin restricciones normativas para el uso de hormonas (Calier, 2021). Los resultados de este estudio indican de manera consistente que el tratamiento convencional de FIV es más eficiente en términos de producción de embriones en todas las etapas evaluadas (ovocitos viables, madurados, fertilizados y en clivaje) en comparación con el tratamiento sexado. El costo de implementar el semen sexado para fertilización in vitro es alta, además de tener una tasa de concepción más baja de aproximadamente 10% a un 20% menor en comparación con la del semen convencional (Benedictis Delphino, 2021), sin embargo, el tratamiento sexado es una gran alternativa, ya que, tiene un gran potencial de mejora con los avances tecnológicos para eficientizar e igualar la fertilidad del semen convencional. Romo García y Álvarez Gallardo (2019) mencionan que con la combinación de producción in vitro de embriones, el uso del semen sexado y transferencia de embriones de sexo femenino, se generan gestaciones con embriones del mismo sexo, reduciendo la probabilidad de Freemartinismo (la mayoría de las hembras que experimentan una gestación gemelar junto a un feto macho resultan ser estériles), y aumentando la proporción de gestaciones con gemelos del mismo sexo y bajo peso al nacer. Esto abre la posibilidad de lograr resultados que anteriormente no se podían alcanzar con semen convencional. Además, se destaca que los porcentajes de concepción logrados con el semen sexado de última generación, con una concentración de cuatro millones de espermatozoides por pajilla, se acercan a los obtenidos con el semen convencional (Thomas et al., 2017). Algunas de las principales recomendaciones para uso del semen convencional según compañía Sexing Technology son que el semen sexado debe utilizarse únicamente en vaquillas vírgenes o vacas con un historial excelente de concepción mediante IA, y la inseminación debe realizarse de 14 a 16 horas después de los primeros signos de estro en animales que muestren señales claras de un buen celo. Es aconsejable evitar el uso de semen sexado en vacas que hayan recibido más 29 de dos o tres servicios y en animales que se encuentren en situaciones estresantes que puedan afectar los porcentajes de concepción. Este tipo de semen debe aplicarse en programas de IA bien establecidos y preferentemente por técnicos con experiencia (Romo García, 2016). 30 Conclusiones Se determinó que el mayor porcentaje de fertilización in vitro (FIV) se obtuvo con el semen convencional en comparación con el semen sexado. Los mayores porcentajes de apoptosis se encontraron con el semen sexado, mientras que el tratamiento con semen convencional logró un mayor porcentaje de clivaje. La mejor eficiencia del proceso de fertilización in vitro (FIV) de embriones bovinos se obtuvo con el semen convencional. 31 Recomendaciones Utilizar semen convencional como primera opción cuando la determinación del sexo no es crítica. Evaluar el efecto del semen sexado y convencional con diferentes razas de toros. Evaluar el porcentaje de preñez del semen convencional y el semen sexado, y compararlos entre sí. Investigar si hay una relación estrechamente proporcional entre el tamaño de los oocitos y el porcentaje de viabilidad. 32 Referencias Aragonés, P., Bermúdez Fernández, I., Ortiz Cardenas, I., Sánchez Alpízar, J. y Madrigal Valverde, M. (2022). Aspectos relacionados con la fertilización in vitro (FIV) en bovinos, una revisión bibliográfica. Revista AgroInnovación En El Trópico Húmedo, 3(22). https://revistas.tec.ac.cr/index.php/agroinn/index Araujo, M. S., Volpato R. y Lopes M. D. (2014). Produção de embriões bovinos in vitro com sêmen sexado, Brasil. https://www.revistamvez- crmvsp.com.br/index.php/recmvz/article/view/17370/18214 Báez Contreras, F. J., Chávez Corona, A. C., Hernández Fonseca, H. J. y Villamediana Monreal, P. C. (2010). Evaluación de la capacidad de desarrollo in vitro de ovocitos bovinos provenientes de vacas con predominancia fenotípica Bos taurus y Bos indicus. Revista Científica, XX(3), 10. https://www.redalyc.org/pdf/959/95916116007.pdf Benedictis Delphino, M. G. (2021). ¿Qué es el semen sexado? Sus pros y contras en la inseminación artificial en animales de granja. https://www.universodelasaludanimal.com/ganaderia/que- es-el-semen-sexado-sus-pros-y-contras/ Bonilla León, L., Mejía Gallego, A., Gómez Domínguez, R., Torres Londoño, M. y Uribe García, F. (2018). Viabilidad y tasa de preñez de embriones producidos in vitro a partir de semen sexado comparado con semen convencional en Bos taurus y Bos indicus. Revista De Investigaciones Veterinarias Del Perú, 29(4), 1377–1385. https://doi.org/10.15381/rivep.v29i4.14297 Brackett, B. G. y Oliphant, G. (1975). Capacitation of rabbit spermatozoa in vitro. Biology of Reproduction, 12(2), 260–274. https://doi.org/10.1095/biolreprod12.2.260 Calier. (2021). ¿Es mejor usar Transferencia Embrionaria o Fecundación In Vitro en animales? https://www.calier.com/es/blog/es-mejor-usar-transferencia-embrionaria-o-fecundacion- vitro-en-animales Comisión Sectorial de Investigación Científica. (2015). Eficiencia del semen sexado en la fertilización in vitro respecto al no sexado con dos técnicas de capacitación espermática en bovinos. Universidad de la República de Uruguay. https://www.csic.edu.uy/content/eficiencia-del- semen-sexado-en-la-fertilizaci%C3%B3n-vitro-respecto-al-no-sexado-con-dos- t%C3%A9cnicas Crespo Calva, J. L. y Guamán Gutiérrez, E. G. (2015). Fertilización in vitro en bovinos en el Laboratorio de Reproducción Animal de Zamorano utilizando el protocolo de Genes Diffusion [Proyecto Especial de Graduación]. Zamorano. https://bdigital.zamorano.edu/server/api/core/bitstreams/7f33e203-b4f0-461f-85d8- 5fbf9872e24f/content Díez Monfarte, C., Muñoz Llamosas, M., Caamaño Gualdoni, J. N. y Gómez Piñeiro, E. (2022). Estado actual de los sistemas de producción de embriones en ganado bovino. Servicio Regional de Investigación y Desarrollo Agroalimentario. http://www.serida.org/publicacionesdetalle.php?id=5572 Echeverri Echeverry, J. D. (2015). Uso de semen sexado en bovinos [Tesis de pregrado]. Universidad Tecnológica de Pereira, Colombia. https://core.ac.uk/download/pdf/71399225.pdf 33 Estrella, C. A., Suconata, A. G. y Ayala, L. E. (2017). Evaluación de la calidad de ovocitos bovinos obtenidos de folículos con tres tamaños diferentes [Tesis de pregrado]. Universidad de Cuenca, Ecuador. https://dialnet.unirioja.es/descarga/articulo/8383544.pdf Ferré, L. y Cattaneo, L. (2013). Biotecnologías reproductivas: producción in vitro de embriones y semen sexado (¿La pareja perfecta?). https://www.produccion- animal.com.ar/informacion_tecnica/transplante_embrionario/38-biotecnologias.pdf Filipiak, Y., Larocca, C [C.] y Martínez, M. (2017). Comportamiento del Semen Bovino Sexado Congelado-Descongelado en Fertilización in vitro (FIV) Capacitado Mediante BO en dos Concentraciones versus Percoll. International Journal of Morphology, 35(4), 1337–1341. https://doi.org/10.4067/S0717-95022017000401337 Fillipiak, Y. y Larocca, C [Clara]. (2010). Manual de fertilización in vitro en bovinos. Universidad de la República. https://www.researchgate.net/profile/Yael- Filipiak/publication/230801504_Manual_de_Fertilizacion_In_Vitro_en_Bovinos/links/0fcfd5 048d3d8a23d1000000/Manual-de-Fertilizacion-In-Vitro-en-Bovinos.pdf International Embryo Technology Society. (2009). Reproduction, Fertility and Development. 1. https://www.iets.org/Meetings/Previous-Meetings/2009-IETS-Annual-Meeting Jacobson, J., Zieve, D. y Conaway, B. (2022). Fecundación in vitro (FIV). https://medlineplus.gov/spanish/ency/article/007279.htm Jimenez Escobar, C. (2017). Técnicas de congelación y sexado del semen bovino y su importancia en reproducción bovina. https://docplayer.es/23577707-Tecnicas-de-congelacion-y-sexado-del- semen-bovino-y-su-importancia-en-reproduccion-bovina.html#google_vignette Laguado, J. (2007). Aplicaciones de la citometría de flujo en microbiología, veterinaria y agricultura. Revista MVZ Córdoba, 12(2), 1077–1095. https://www.redalyc.org/pdf/693/69312215.pdf Lonergan, P., Rizos, D., Ward, F. y Boland, M. P. (2001). Factors influencing oocyte and embryo quality in cattle. Reproduction, Nutrition, Development, 41(5), 427–437. https://doi.org/10.1051/rnd:2001142 Lucyna, K.‑K., Bożenna, r., michał, b., Jolanta, O. y and Joanna Jurkiewicz. (2006). In vitro production of bovine embryos using flow-cytometrically sexed sperm Arch. Tierz., Dummerstorf, Polonia. https://aab.copernicus.org/articles/49/133/2006/aab-49-133-2006.pdf Machado, G. M., Carvalho, J. O., Filho, E. S., Caixeta, E. S., Franco, M. M., Rumpf, R. y Dode, M. A. N. (2009). Effect of Percoll volume, duration and force of centrifugation, on in vitro production and sex ratio of bovine embryos. Theriogenology, 71(8), 1289–1297. https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2009.01.002 Martínez, Y. (2013). Análisis de la morofología ovocitaria en bovina previa a fecundación in vitro [Tesis de posgrado]. Universidad de Oviedo, España. https://digibuo.uniovi.es/dspace/bitstream/handle/10651/17398/TFM%20Yaiza%20Martine z.pdf;jsessionid=9A2DD761A566A5FDA7467C89A151B782?sequence=1 Mora Muñoz, V. A. (2018). Uso del semen sexado en bovinos seminario de profindización [Tesis de pregrado]. Universidad Cooperativa de Colombia Villavicencio, Colombia. https://repository.ucc.edu.co/server/api/core/bitstreams/84c4a59a-03e8-488c-be2e- 8a4971e48cb1/content 34 Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura. (2024). La ganadería y el medio ambiente. https://www.fao.org/livestock-environment/es Oses, M. V., Teruel, M. T. y Cabodevila, J. A. (2009). Utilización de semen bovino sexado en inseminación artificial, transferencia embrionaria y fertilización in vitro. Revista Veterinaria, 20(2), 138. https://doi.org/10.30972/vet.2021867 Promthep, K., Satitmanwiwat, S., Kitiyanant, N., Tantiwattanakul, P., Jirajaroenrat, K., Sitthigripong, R. y Singhapol, C. (2015). Practical use of percoll density gradient centrifugation on sperm sex determination in commercial dairy farm in Thailand. Indian Journal of Animal Research. Publicación en línea avanzada. https://doi.org/10.18805/ijar.8427 Romo García, S. (2016). Recomendaciones prácticas para el uso de semen y embriones sexados. Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, UNAM. https://www.ganaderia.com/destacado/Recomendaciones-practicas-para-el-uso-de-semen- y-embriones-sexados Romo García, S. y Álvarez Gallardo, H. (2019). Tecnología para la producción de embriones in vitro con semen sexado de última generación a partir de vacas élite, para la producción de gestaciones y partos gemelares de sexo femenino: contribución a la multiplicación del hato lechero nacional. https://www.ganaderia.com/destacado/tecnologia-para-la-produccion-de- embriones-in-vitro-con-semen-sexado-de-ultima-generacion-a-partir-de-vacas-elite-para-la- produccion-de-gestaciones-y-partos-gemelares-de-sexo-femenino-contribucion-a-la- multiplicacion-del-hato-lechero-nacional Rosete Fernández, J. V., Álvarez Gallardo, H., Urbán Duarte, D., Fragoso Islas, A., Asprón Pelayo, M. A., Rios Utrera, A., Pérez Reynozo, S. y La Torre Sánchez, J. F. de (2021). Biotecnologías reproductivas en el ganado bovino: cinco décadas de investigación en México. Revista Mexicana De Ciencias Pecuarias, 12, 39–78. https://doi.org/10.22319/rmcp.v12s3.5918 Seidel, G. E. (1981). Superovulation and embryo transfer in cattle. Science (New York, N.Y.), 211(4480), 351–358. https://doi.org/10.1126/science.7194504 Thomas, J. M., Locke, J. W. C., Vishwanath, R., Hall, J. B., Ellersieck, M. R., Smith, M. F. y Patterson, D. J. (2017). Effective use of SexedULTRA™ sex-sorted semen for timed artificial insemination of beef heifers. Theriogenology, 98, 88–93. https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2017.03.018 Wit, A. A. de, Wurth, Y. A. y Kruip, T. A. (2000). Effect of ovarian phase and follicle quality on morphology and developmental capacity of the bovine cumulus-oocyte complex. Journal of Animal Science, 78(5), 1277–1283. https://doi.org/10.2527/2000.7851277x Xu, J., Chaubal, S. A. y Du, F. (2009). Optimizing IVF with sexed sperm in cattle. Theriogenology, 71(1), 39–47. https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2008.09.012 35 Anexos Anexo A Materiales utilizados 36 Anexo B Dia -1 Lavado de ovarios 37 Anexo C Día -1 Aspiración folicular mediante el uso de jeringas Obtención de oocitos 38 Anexo D Semen convencional (no sexado) Semen sexado 39 Anexo E Día 0 proceso de co-cultivo en fertilización 40 Anexo F Día 0 Percoll Oocitos rodeados por células del cumulus oophorus 41 Anexo G Día 1 semen convencional Día 1 semen sexado 42 Anexo H Día 3 semen convencional Día 3 semen sexado 43 Anexo I Día 7 blastos semen convencional Día 7 blastos semen sexado