Desarrollo, caracterización y validación de un bioplástico reforzado con orégano con acción antifúngica contra alternaria (Alternaria alternata) Alendy Cesar Escuela Agrícola Panamericana, Zamorano Honduras Noviembre, 2018 i ZAMORANO CARRERA DE AGROINDUSTRIA ALIMENTARIA Desarrollo, caracterización y validación de un bioplástico reforzado con orégano con acción antifúngica contra alternaria (Alternaria alternata) Proyecto especial de graduación presentado como requisito parcial para optar al título de Ingeniero en Agroindustria Alimentaria en el Grado Académico de Licenciatura Presentado por Alendy Cesar Zamorano, Honduras Noviembre, 2018 iii Desarrollo, caracterización y validación de un bioplástico reforzado con orégano con acción antifúngica contra alternaria (Alternaria alternata) Alendy Cesar Resumen. Los biopolímeros han generado mucho interés en la industria de los plásticos y en la sociedad debido a la reducción en el impacto ambiental. Los revestimientos a base de biopolímeros le confieren ciertos aspectos a los productos que los consumidores valoran. Durante la última década, los revestimientos han servido como vehículo para incorporar sustancias como: vitaminas, antioxidantes, sustancias antimicrobianas y antifúngicas. El objetivo de este estudio fue elaborar un bioplástico con orégano, utilizando el método de casting y evaluar su efecto en las propiedades físicas y como antifúngico. Se utilizó la metodología superficie de respuesta definiendo como variables independientes la concentración de orégano y proporción de almidones de maíz con respecto al de yuca. Las variables dependientes fueron: grosor, propiedades de barrera, propiedades ópticas y mecánicas. La adición de orégano en polvo presentó un efecto positivo en las propiedades óptica y antifúngicas. Se generaron seis regresiones matemáticas: cuatro de carácter tendencioso y dos de carácter predictivo. La combinación que optimizó las propiedades de los bioplásticos corresponde a 1.7% de orégano y una relación de 77.60 y 22.40% de almidón de maíz/yuca, respectivamente. Las películas con mayor concentración de orégano presentaron mayor diámetro de inhibición del hongo patógeno. Palabras clave: Biopelículas, carvacrol, compósito, glicerol. Abstract. Biopolymers have generated a lot of interest in the plastics industry and in the society due to the reduction in the environmental impact. Coatings based on biopolymer give certain aspects to the products that consumers value. During the last decade, coatings have served as vehicles to incorporate substances such as: vitamins, antioxidants, antimicrobials and antifungals. The objective of this study was to elaborate a bioplastic with oregano, using the casting method and to evaluate its effect on the physical properties and its antifungal effect. The response surface methodology was used, defining as independent variables the concentration of oregano and the proportion of corn starch with respect to cassava starch. The dependent variables or response evaluated were: thickness, barrier properties, optical properties and mechanical properties. The addition of oregano powder had a positive effect on the optical and antifungal properties. Six mathematical regressions were generated: four of tendentious character and two of predictive character. The combination that optimized the properties of the bioplastics were 1.7% of oregano and a ratio of 77.20 and 22.40% of corn starch / cassava, respectively. The films with the highest concentration of oregano had a greater diameter of inhibition of the pathogenic fungus. Key words: Bioplastics, carvacrol, composite, glycerol. iv CONTENIDO Portadilla ............................................................................................................ i Página de firmas .................................................................................................. ii Resumen .............................................................................................................. iii Contenido ........................................................................................................... iv Índice de Cuadros, Figuras y Anexos ................................................................ v 1. INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 1 2. MATRIALES Y MÉTODOS............................................................................. 3 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................ 10 4. CONCLUSIONES .............................................................................................. 28 5. RECOMENDACIONES .................................................................................... 29 6. LITERATURA CITADA ................................................................................... 30 7. ANEXOS ............................................................................................................. 34 v ÍNDICE DE CUADROS, FIGURAS Y ANEXOS Cuadros Página 1. Equipo utilizado para elaborar y analizar los bioplásticos. ................................. 3 2. Niveles codificados de las variables del experimento. ........................................ 5 3. Diseño experimental completo con valores codificados y decodificados. .......... 6 4. Efecto de la combinación de porcentaje de orégano, almidón de maíz y yuca en el grosor en mm de los bioplásticos. ................................................................... 10 5. Coeficiente de regresión y probabilidad (P) de un modelo de regresión polinomial aplicado para grosor de bioplástico. .................................................. 11 6. Efecto de la combinación de porcentaje de orégano, almidón de maíz y yuca en la opacidad a 500 nm de los bioplásticos. ........................................................... 11 7. Coeficiente de regresión y probabilidad (P) de un modelo de regresión polinomial aplicado para opacidad de bioplástico. .............................................. 12 8. Efecto de la combinación de porcentaje de orégano, almidón de maíz y yuca en la diferencia de color de los bioplásticos. ............................................................ 14 9. Coeficiente de regresión y probabilidad (P) de un modelo de regresión polinomial aplicado para diferencia de color de bioplástico. .............................. 15 10. Efecto de la combinación de porcentaje de orégano, almidón de maíz y yuca en la resistencia en Newton/mm (N/mm) de los bioplásticos. ................................. 16 11. Coeficiente de regresión y probabilidad (P) de un modelo de regresión polinomial aplicado para la resistencia a la perforación de bioplástico. ............. 17 12. Efecto de la combinación de porcentaje de orégano, almidón de maíz y yuca en la fuerza de tensión en Newton de los bioplásticos. ............................................ 18 13. Coeficiente de regresión y probabilidad (P) de un modelo de regresión polinomial aplicado para fuerza de tensión de bioplástico. ................................. 19 14. Módulo de elasticidad de bioplásticos con variables de combinación de porcentaje de orégano, almidón de maíz y yuca. ................................................. 21 15. Coeficiente de regresión y probabilidad (P) de un modelo de regresión polinomial aplicado para módulo de elasticidad de bioplástico. ......................... 21 16. Efecto de la combinación de porcentaje de orégano, almidón de maíz y yuca en la solubilidad en agua (%) de los bioplásticos. .................................................... 22 17. Coeficiente de regresión y probabilidad (P) de un modelo de regresión polinomial aplicado para solubilidad de bioplástico. .......................................... 23 18. Permeabilidad a vapor de agua en g.mm/h.m2.kPa de los bioplásticos con los variables de combinación de porcentaje de orégano, almidón de maíz y yuca. .. 24 19. Coeficiente de regresión y probabilidad (P) de un modelo de regresión polinomial aplicado para permeabilidad a vapor de agua de bioplástico. ........... 25 vi Cuadros Página 20. Efecto de la combinación de porcentaje de orégano, almidón de maíz y yuca en el diámetro de inhibición en centímetros contra Alternaria alternata. ............... 27 Figuras Página 1. Efecto de la combinación del % de orégano y relación AM:AY en la opacidad de los bioplásticos................................................................................................ 13 2. Efecto de la combinación del % de orégano y relación AM:AY en la diferencia de color de los bioplásticos. ................................................................................. 15 3. Efecto de la combinación del % de orégano y relación AM:AY en la resistencia a la perforación de los bioplásticos. .................................................................... 17 4. Efecto de la combinación del % de orégano y relación AM:AY en la fuerza de tensión de los bioplásticos. .................................................................................. 20 5. Efecto de la combinación del % de orégano y relación AM:AY en la solubilidad de los bioplásticos. ............................................................................................... 23 6. Efecto de la combinación del % de orégano y relación AM:AY en la permeabilidad a vapor de agua de los bioplásticos. ............................................ 25 7. Valores óptimos de las variables independientes sobre las propiedades ópticas, mecánicas y de barrera de un bioplástico con orégano y combinación de almidón de maíz y yuca. ...................................................................................... 26 Anexos Página 1. Conteo de esporas en cámara Neubauer. ............................................................. 34 2. Espectrofotometría de las películas de almidón de yuca y maíz con diferentes concentraciones de orégano. ................................................................................ 34 3. Zona de inhibición de bioplásticos con diferentes concentraciones de orégano. 35 1 1. INTRODUCCIÓN Las frutas y hortalizas poseen una corta vida de anaquel y es que su calidad no deja de disminuir una vez que son cosechadas. Para solucionar dicho problema se han utilizado sustancias químicas que se pueden aplicar de forma directa o a través de un vehículo como bioplásticos. Los biopolímeros han generado mucho interés en la industria de los plásticos y en la sociedad debido a la reducción en el impacto ambiental que tienen. Un biopolímero puede cumplir las mismas funciones que un polímero a base de petróleo; sin embargo, lo que le da valor agregado a este producto es que no contamina el ambiente y es fabricado a base de recursos renovables o biodegradables. Una de las técnicas actuales para la aplicación de los biopolímeros en frutas y hortalizas es el revestimiento (Vásquez-Briones 2013). El revestimiento con biopolímeros ha tomado una importancia muy grande en la industria alimentaria ya que puede potencialmente alargar la vida útil de las frutas y además les confiere un aspecto brillante el cual es muy valorado por los consumidores (Alvarez 2012). Existen diferentes técnicas para producir biopolímeros como: casting, prensado, moldeado, y extrusión termoplástica. Durante la última década, los revestimientos han servido como vehículo para incorporar sustancias como: vitaminas, antioxidantes, sustancias antimicrobianas y antifúngicas. Sin embargo, los polímeros hidrocoloidales presentan dos grandes desventajas que son: su permeabilidad a la humedad y son poco resistentes al manejo mecánico. Consecuentemente, los investigadores han enfocado sus estudios para determinar cómo mejorar las propiedades mecánicas de dichos biopolímeros (Durango et al. 2011). Los almidones tienen un alto potencial para su aplicación como plásticos biodegradables a pesar de su alta permeabilidad al vapor de agua. Para mejorar las propiedades mecánicas y de barrera de las películas de almidón, se puede incorporar nanocompósitos en la matriz, proteínas, fibras, y arcillas (González et al. 2016). Los compósitos refuerzan las películas debido a su gran área interfacial, lo cual ayuda a cambiar la movilidad molecular y consecuentemente las propiedades mecánicas y de barrera del polímero (Kamperepappum et al. 2007). El mango se clasifica dentro de los cinco frutos tropicales más finos. La producción de mango al nivel mundial se estima en 92.2 millones de toneladas y representa el 51% de la producción de las principales frutas tropicales (FAO 2017). Sin embargo, los índices de pérdidas post cosecha son altos. Se reporta hasta un 50% de daños causados por microorganismos a pesar de los esfuerzos realizados con la ayuda de la tecnología (López et al. 2013). Uno de los principales hongos fitopatógenos que afecta al mango durante la postcosecha es la Alternaria alternata. Este hongo causa una enfermedad conocida como 2 la mancha negra del fruto. Los frutos se oscurecen y la pulpa se ablanda a medida las manchas penetran la cáscara. Esto provoca una mala apariencia en la fruta y consecuentemente el rechazo inmediato por parte del consumidor (Sullon 2012). El uso de productos naturales en la conservación de alimentos ha incrementado en la última década. Los aceites esenciales de ciertas hierbas como (orégano, tomillo, canela, entre otros) han sido utilizados para contrarrestar los efectos dañinos de ciertos microorganismos. El orégano contiene dos componentes químicos (carvacrol y timol) que actúan como agentes inhibidores de bacterias y hongos (García-Camarillo et al. 2006). Esta investigación tuvo como objetivo formular un biopolímero utilizando una mezcla de almidón de maíz y tapioca, glicerol y orégano deshidratado además de evaluar el efecto antifúngico de este último. Se definieron los siguientes objetivos específicos:  Determinar la combinación de almidón, glicerol y orégano que optimice las propiedades mecánicas y de barrera del bioplástico.  Evaluar las propiedades antifúngicas de las hojas de orégano aplicado a un biopolímero. 3 2. MATERIALES Y MÉTODOS Ubicación del estudio. Los experimentos se realizaron en la Escuela Agrícola Panamericana Zamorano, Honduras. Los bioplásticos se elaboraron en el Laboratorio de Análisis de Alimentos de Zamorano (LAAZ) y la evaluación de susceptibilidad se realizó en el laboratorio de Microbiología de Alimentos de Zamorano (LMAZ). Obtención del orégano en polvo. El orégano fue adquirido de la unidad de agricultura orgánica de la Escuela Agrícola Panamericana. Las hojas fueron secadas en el horno a 50 °C por 24 horas según la metodología propuesta por Velásquez-Santos y Acevedo-Álvarez (2014) con adaptaciones. Una vez secado, el orégano se trituró utilizando un molino de rodillo. Posterior al triturado, se tamizó el compósito con la ayuda de un juego de tamices de 850 micras. Finalmente, el orégano en polvo se almacenó en una bolsa plástica a temperatura ambiente. Los equipos utilizados para la elaboración de los bioplásticos se describen en el cuadro 1. Cuadro 1. Equipo utilizado para elaborar y analizar los bioplásticos. Equipo Marca/Modelo Texturómetro BROOKFIELD CT3 4500 Estufa agitador Barnstead Thermolyne Cámara de estabilidad NORLAKE Scientific Balanza analítica OHAUS ADVENTURER Colorímetro Espectrofotómetro Colorflex Hunterlab Agilent Tech Elaboración de los bioplásticos. Para elaborar los filmes se realizaron pruebas preliminares para determinar: la cantidad de glicerol (%peso/volumen), la proporción de mezcla de almidón de maíz (AM) y almidón de yuca (AY), la cantidad de orégano y agua a utilizar. Se diluyó 5 ml de glicerol con agitación magnética constante en dos tercios de agua destilada del volumen total (100ml) hasta alcanzar una temperatura de 65 °C. Paralelamente se procedió a mezclar, en una placa de calentamiento a temperatura ambiente, el resto del agua con el almidón y el orégano. Posteriormente, se agregó la mezcla con almidón a la solución de glicerol. Se calentó y se agitó la mezcla de almidones y glicerol a 65 ± 2 °C. Al iniciar la gelatinización de los almidones se sacó el vaso de precipitado de la placa de calentamiento y se enfrió la solución a 50 °C. 4 Finalmente se vertieron 30 ± 0.5 g de solución filmogénica en platos Petri de plástico de 169 cm2. Los films o biopelículas se secaron en una cámara de estabilidad a 33 ± 2 °C y 55% de humedad relativa durante 24 horas. Al finalizar el secado, las biopelículas fueron separadas de los platos manualmente y almacenadas por 7 días en un desecador a temperatura ambiente (25 °C) con una solución saturada de hidróxido de sodio al 60%. Diseño experimental. Para evaluar el efecto combinado de los polímeros y orégano como sustancia antifúngica, se utilizó una metodología experimental basada en el análisis de superficie respuesta con una probabilidad de significancia del 10% (Box et al. 1978). Los parámetros del proceso fueron establecidos como variables independientes estudiadas en tres niveles codificados como -1,0, 1, y se calcularon de acuerdo a la ecuación 1: xi = [(Xi × Z) / Δxi] [1] Dónde: xi: Valor codificado de la variable xi Xi: el valor real de la variable Z: valor real de la variable en el punto central Δxi: intervalo de la variable xi Este modelo presenta dos niveles de variables axiales, que son codificadas como + α y - α. El valor de α depende del número factorial (F= 2k) del diseño y del número de variables independientes (K=2), en el caso de este experimento se definió según la ecuación 2: ± α = (𝑓)1/4 = (2𝑘)1/4 =(22)1/4 = 1.4142 [2] Para calcular el número de tratamientos se utilizó un diseño factorial completo con la ecuación 3. n= 2k + 2k +m [3] Dónde: 2k = número de puntos factoriales 2k = número de puntos axiales m = número de repeticiones del punto central. De esta manera, los tratamientos se distribuirán de la siguiente manera: 2k = 22 = 4 puntos factoriales 2k = 2 × 2 = 4 puntos axiales m = 4 replicados del punto central 12 unidades experimentales La amplitud en el rango de las variables se determinó según los resultados de las pruebas preliminares, literatura consultada y experiencia del investigador. Para analizar los resultados se usó un modelo que describe el comportamiento de la variable independiente (Yi) o respuesta, en función de las variables dependientes (Xk). La respuesta fue evaluada 5 en función de los niveles en que los factores fueron combinados. La variable independiente fue definida por la ecuación 4, según Humberto y Román (2008). Yi = F (X1, X2, ......, Xk) [4] Para predecir el comportamiento de cada variable se realizó un análisis de regresión ajustada con un polinomio cuadrático con las variables (Xk) para cada respuesta (Y). La ecuación [5] se utilizó para predecir cada respuesta. Yi = β0 + β1X1 + β2X2 + β11X12 + β22X22 + β12X1X2 + ε [5] Dónde: Yi= Función respuesta; X1, X2= Valores de las variables independientes; B0= Coeficiente relativo a la interpretación del plan con la respuesta en el eje; B1, B2, B3= Coeficientes lineales estimados por el mínimo cuadrado; B11, B22, B33= Coeficientes de variables cuadráticas; B12, B13, B22=Coeficiente de interacción entre las variables independientes; ℇ= Error experimental. En el cuadro 2 se presentan los niveles codificados (-1, 0, +1) y los valores axiales (-α y +α). Posteriormente, se describen los niveles codificados y los valores reales de los tratamientos a evaluar en el cuadro 3. Cuadro 2. Niveles codificados de las variables del experimento. Variables Independientes Niveles - α -1 0 1 + α % Orégano 0.00 0.90 3.00 5.10 6.00 % AM:AY* 67.90 70.00 75.00 80.00 82.10 *Hace referencia a la proporcion de almidón de maiz (AM) el restante es almidón de yuca (AY) 6 Cuadro 3. Diseño experimental completo con valores codificados y decodificados. Tratamientos Niveles reales de variables % Orégano Almidón Maíz/Yuca Almidón Maíz/ Yuca % Orégano 1 -1.00 -1.00 70:30 0.90 2 -1.00 1.00 80:20 0.90 3 1.00 -1.00 70:30 5.10 4 1.00 1.00 80:20 5.10 5 -1.41 0.00 75:25 0.00 6 1.41 0.00 75:25 6.00 7 0.00 -1.41 67.9:22.1 3.00 8 0.00 1.41 82.1:17.9 3.00 9 © 0.00 0.00 75:25 3.00 10 © 0.00 0.00 75:25 3.00 11 © 0.00 0.00 75:25 3.00 12 © 0.00 0.00 75:25 3.00 © Puntos centrales Caracterización de bioplástico. Después de la etapa de acondicionamiento, a los filmes se les realizaron análisis físicos para determinar las propiedades mecánicas (perforación y elongación), de barrera (permeabilidad y solubilidad en agua) y análisis ópticos (color y opacidad). Grosor. El grosor de las biopelículas fue evaluado utilizando un micrómetro manual Mitutoyo con una precisión de 0.001 mm. Para determinar la espesura se tomaron medidas en 10 puntos aleatorios de las muestras (Mali et al. 2008). Análisis ópticos. Opacidad. La opacidad de las películas se midió con un espectrofotómetro con una longitud de onda de 500 nm. Se utilizó el aire como control y la absorbancia obtenida fue sustituida en la ecuación 6 para obtener la opacidad (Muñoz 2014). Opacidad = A500 / T [6] Donde: A500= Absorbancia a 500 nm T= Espesor de la película en milímetros 7 Color. Los filmes fueron cortados en diámetro de 30 mm y se utilizó el Colorflex Hunterlab® para evaluar este parámetro. La caracterización se relizó en la escala L*, a*, b* donde: L*= Luminosidad (0: negro y 100: blanco) a*= -80 a 0: verde y 0 a 100: rojo b*= -100 a 0: azul y 0 a 70: amarillo ∆E= diferencia total de color ∆Elab = √(∆𝐿)2 + (∆𝑎)2 + (∆𝑏)2 [7] Donde ∆L= L-L0, ∆a = a-a0, ∆b =b*-b0 L*, a* y b* representan los valores del color de las muestras y L0, a0 y b0 representan los valores del tratamiento sin orégano utilizado como control (L0=32.52 a0=-0.36 b0=-1.05). Los análisis ópticos fueron realizados por triplicado. Propiedades mecánicas. Este análisis incluyó las evaluaciones de perforación y elongación (módulo de Young). Para este análisis se utilizó el texturómetro BROOKFIELD CT3. En ambos casos se realizaron 6 pruebas a cada una de las muestras. Perforación. Consiste en determinar la fuerza y la distancia que requiere un material para romperse. Las películas se cortaron en 40 mm de longitud y 15 mm de ancho (Muñoz 2014), estas fueron colocadas en el soporte diseñado para este propósito basado en especificaciones del fabricante del texturómetro. Al texturómetro se le acopló una sonda de 2 mm de diámetro y la velocidad fue de 0.1 m/s. La ecuación 8 se utilizó para calcular la resistencia a la perforación (h) de la película. Resistencia a la perforación (h)= Fp / L [8] Donde: Fp= pico de fuerza antes de la ruptura L= espesor de la película Elongación. Mediante este análisis se puede determinar tres propiedades: tensión, deformación y módulo de elasticidad (Vicentini 2003) y está basado en la norma ASTM 828-95 (ASTM 1995). Se cortaron muestras de 40 mm de longitud y 15 mm de ancho y el texturómetro se calibró con velocidad de 0.1cm/s. La distancia entre las mordazas fue de 30 mm. El módulo de elasticidad se calculó con la siguiente ecuación (Farias et al. 2012): Módulo de elasticidad = Ts / h [9] Donde: Ts = Fuerza de tensión h = deformación 8 Propiedades de barrera. Solubilidad en agua. Se siguió la metodología propuesta por Gontard (1992) modificada. Se cortaron dos círculos con diámetro de 25mm y se pesaron. Uno de ellos fue secado por 24 horas a 105 ± 2 °C y se pesó después de ese tiempo. El otro círculo se puso en un tubo de ensayo con 50 ml de agua destilada durante 24 h a temperatura ambiente (25 °C) y fue agitado suavemente cada tres horas. Para obtener la solubilidad, se secó este círculo de bioplástico durante 24 horas a 105 °C y se pesó. Los pesos se sustituyeron en la ecuación 10 para obtener el porcentaje de solubilidad. El análisis se realizó por duplicado. % Solubilidad = ((Pi – Pf) /Pi)) × 100 [10] Donde: Pi= Peso inicial Pf= Peso final Permeabilidad a vapor de agua (PVA). Este análisis se realizó gravimétricamente basado en el método E96-92 de la ASTM modificado, el cual establece que se deben utilizar desecadores de sulfato de calcio anhídrido a una temperatura de 25 ± 3°C. Las muestras se cortaron en círculos de diámetro de 30 mm para tapar vasos volumétricos con 30 ± 2.5g de agua destilada (25 °C). Los vasos se pesaron cada 24 horas durante 9 días (Muñoz 2014). La PVA fue calculada con la ecuación 11. PVA = ( 𝑔 𝑡 𝑥 𝑎 ) × 𝑋 ∆𝑃 [11] Donde: g= pérdida de peso del vaso volumétrico t= tiempo en horas a= área de permeabilidad x= espesor de la película ∆P= diferencia de presiones entre el gel de silicato (0 kPa a 25 °C) y el vapor de agua pura (3.167 kPa a 25 °C) Ensayo de zona de inhibición. Para la evaluación antifúngica in vitro se utilizó la metodología de difusión en agar propuesta por Ponce et al. (2008) con adaptaciones. Se realizó una siembra por inclusión del cultivo del hongo patógeno. Para ello se preparó una solución de esporas de aproximadamente 7×105 ufc/ml en agua con Tween 85 (0.1%), usando colonias de 7 días de crecimiento en agar papa dextrosa acidificado (PDA). Se añadieron 4 ml de la suspensión de esporas por cada medio litro de PDA en matraz a 45 °C, previamente esterilizado. Los matraces inoculados con las esporas del hongo se mantuvieron en agitación orbital durante 10 min a 170 rpm. Una vez repartido en placas, se dejó solidificar y posteriormente se depositaron los discos de 1 cm de diámetro. En cada plato se colocaron tres discos de los cuales dos fueron de los tratamientos evaluados y el otro representó al tratamiento control. Los platos fueron colocados a 25 °C en una incubadora. Las lecturas de resultados de los platos se realizaron midiendo el halo de 9 inhibición desde el centro del disco del film hasta el extremo de la superficie de inhibición a las 48 horas. Se tomaron dos medidas del diámetro de la superficie inhibida y se calculó la media para todos los tratamientos y el control (Wang et al. 2011). Análisis estadístico. Se utilizó el programa Statistica 7 para realizar el análisis de los datos obtenidos y luego obtener los coeficientes de regresión seguida de los valores necesarios para posteriormente elaborar los gráficos de superficie respuesta. Al mismo tiempo, se determinaron los puntos óptimos de las variables independientes y así se optimizaron todas las variables dependientes. El valor del R2 se utilizó para determinar el tipo de modelo obtenido. Un R2 mayor a 0.6 se consideró como modelo predictivo y un R2 menor a 0.6 se consideró como tendencioso. Para los valores del F calculado mayores o iguales al F tabular, a un nivel de significancia (P < 0.10), se consideró que el modelo de regresión es significativo (Rocha 2009). Para el ensayo de zona de inhibición se utilizó un diseño completamente al azar con nueve tratamientos. Se realizaron pruebas de separación de medias Duncan y análisis de varianzas ANDEVA con un nivel de significancia de P < 0.05 usando el programa estadístico “Statistical Analysis System” (SAS 9.4). 10 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Grosor. El grosor de las biopelículas puede afectar las propiedades ópticas, mecánicas y de barrera. Oliveira et al. (1996) definió el grosor como la distancia perpendicular entre dos superficies. Los resultados encontrados para esta variable dependiente obtuvieron un rango entre 0.30 y 0.38 mm y se presentan en el cuadro 4. El tratamiento que presentó mayor grosor fue el que contenía una relación 75:25 de almidón de maíz y yuca sin orégano. Mientras que el tratamiento con 0.90% de orégano y 80:20 AM:AY presentó el menor grosor con 0.30 mm. Muñoz Garrido (2014), quien elaboró bioplásticos a base de almidones bajo los mismos parámetros con la excepción del orégano, encontró valores similares (0.25-0.42 mm). El grosor de las películas varió en función a la cantidad y manera en la cual se dispersó la solución filmogénica en las placas. No se encontraron variables significativas, consecuentemente no se pudo generar modelo matemático para la variable espesor. Cuadro 4. Efecto de la combinación de porcentaje de orégano, almidón de maíz y yuca en el grosor en mm de los bioplásticos. Tratamiento % Relación AM:AY€ % Orégano Grosor¥ T1 70:30 0.90 0.35 T2 80:20 0.90 0.30 T3 70:30 5.10 0.37 T4 80:20 5.10 0.37 T5 75:25 0.00 0.38 T6 75:25 6.00 0.34 T7 67.9:22.1 3.00 0.36 T8 82.1:17.9 3.00 0.37 T9 75:25 3.00 0.34 T10 75:25 3.00 0.36 T11 75:25 3.00 0.36 T12 75:25 3.00 0.35 % Coeficiente de Variación 14.26 € Hace referencia a la proporción de almidón de maíz, el restante es almidón de yuca. ¥ Media 11 Cuadro 5. Coeficiente de regresión y probabilidad (P) de un modelo de regresión polinomial aplicado para grosor de bioplástico. Variable Coeficiente P Intercepto 1.253481 0.238224 ns X1 -0.087493 0.185550 ns X1 2 -0.000024 0.979199 ns X2 -0.019715 0.447983 ns X2 2 0.000102 0.547957 ns X1X2 0.001190 0.479605 ns Falta de ajuste 0.03 £ R2 0.19 X1: % Relación AM:AY X2: % Orégano nsNo significativo £significativo a P < 0.10 Opacidad. En el cuadro 6 se presentan los valores de opacidad encontrados durante el experimento. El rango fue de 5.36 a 7.77 siendo el tratamiento sin orégano y con una relación de almidón de maíz y yuca 75:25 con el menor valor. El tratamiento con mayor opacidad contenía el mayor porcentaje de orégano (6%) y la combinación 75 y 25 % de almidón de maíz y yuca, respectivamente. Cuadro 6. Efecto de la combinación de porcentaje de orégano, almidón de maíz y yuca en la opacidad a 500 nm de los bioplásticos. Tratamiento % Relación AM:AY€ % Orégano Opacidad¥ T1 70:30 0.90 6.06 T2 80:20 0.90 6.87 T3 70:30 5.10 7.02 T4 80:20 5.10 6.71 T5 75:25 0.00 5.36 T6 75:25 6.00 7.71 T7 67.9:22.1 3.00 6.92 T8 82.1:17.9 3.00 6.38 T9 75:25 3.00 6.60 T10 75:25 3.00 6.76 T11 75:25 3.00 6.63 T12 75:25 3.00 6.98 % Coeficiente de Variación 5.65 € Hace referencia a la proporción de almidón de maíz, el restante es almidón de yuca. ¥ Media 12 Según los resultados obtenidos en el estudio, se puede concluir que a mayor cantidad de orégano los bioplásticos son más opacos. Estos resultados coinciden con los obtenidos por Bagán et al. (2009), quienes encontraron que a medida aumentaba la concentración de antimicrobiano, las películas resultaron más opacas. Los coeficientes de regresión obtenidos fueron utilizados para generar la ecuación 12, la cual muestra un efecto positivo de la variable orégano en su nivel lineal y un efecto negativo de la combinación de almidón y orégano (Cuadro 7). El F calculado fue mayor que el F tabular y el ajuste del modelo fue de 70%, con una falta de ajuste significativa (P < 0.10). Consecuentemente, el modelo se consideró tendencioso (Rocha 2009) y se pudo apreciar un comportamiento equivalente en la Figura 1. La opacidad de las películas aumentó al incorporar una sustancia antimicrobiana o antifúngica en la matriz (Torres y Rojas 2014). Miramont (2012) evaluó carvacrol y sorbatos como compósitos, y encontró que, a mayor porcentaje de antioxidante, las películas presentaron mayor opacidad y menos brillo. Opacidad= -0.02659X1X2 + 2.35664X2 [12] Cuadro 7. Coeficiente de regresión y probabilidad (P) de un modelo de regresión polinomial aplicado para opacidad de bioplástico. Variable Coeficiente P Intercepto -6.01021 0.723710 ns X1 0.24266 0.596145ns X1 2 -0.00113 0.706898ns X2 2.35664 0.033005£ X2 2 -0.01944 0.294439ns X1X2 -0.02659 0.048722£ Falta de ajuste 0.039£ R2 0.70 F. Tabular 3.11 F. Calculado 27.12 X1: % Relación AM:AY X2: % Orégano £significativo a P < 0.10 nsNo significativo 13 Figura 1. Efecto de la combinación del % de orégano y relación AM:AY en la opacidad de los bioplásticos. Diferencia de color. Los resultados de análisis de diferencia de color ∆E de los bioplásticos se describen en el cuadro 8. Se observaron diferencias de color en un rango de 0 hasta 7.85. El tratamiento 5 (25% almidón de maíz, 75% almidón de yuca y 0% orégano) fue utilizado como referencia para establecer la diferencia de color. El tratamiento con mayor cambio de color corresponde al tratamiento con mayor porcentaje de orégano. 14 Cuadro 8. Efecto de la combinación de porcentaje de orégano, almidón de maíz y yuca en la diferencia de color de los bioplásticos. Tratamiento % Relación AM:AY€ % Orégano ∆E¥ T1 70:30 0.90 1.87 T2 80:20 0.90 2.24 T3 70:30 5.10 7.83 T4 80:20 5.10 7.40 T5(b) 75:25 0.00 0.00 T6 75:25 6.00 7.85 T7 67.9:22.1 3.00 7.06 T8 82.1:17.9 3.00 4.27 T9 75:25 3.00 6.84 T10 75:25 3.00 6.12 T11 75:25 3.00 7.10 T12 75:25 3.00 7.19 % Coeficiente de Variación 2.63 € Hace referencia a la proporción de almidón de maíz, el restante es almidón de yuca. ¥ Media (b): Tratamiento utilizado como punto de referencia para establecer la comparación ∆E: Diferencia de color de los bioplásticos Los coeficientes de regresión para la variable color se describen en el cuadro 9. En su nivel cuadrático, las variables orégano y almidón tienen un efecto positivo en su nivel lineal y negativo en su nivel cuadrático en la diferencia de color entre tratamientos. El modelo presentó un ajuste de 90%, con una falta de ajuste no significativa y el F calculado mayor que el F tabular, el modelo se considera de carácter predictivo (Rocha 2009). De la ecuación 13 se generó la Figura 2, en donde se puede observar el comportamiento de las variables. ∆E = -123.626 + 3.339 X1 + 4.65X2 – 0.023X1 2 - 0.32X2 2 [13] La diferencia entre tratamientos para la variable color se atribuye a la cantidad de compósito incorporado a lo bioplásticos. Chariguaman Chanatasig (2015), evaluó el albedo de maracuyá en bioplástico, y encontró que a mayor proporción de harina de albedo se obtiene mayor diferencia de color. La incorporación de una sustancia antimicrobiana como aceites esenciales, sorbatos y otros tienen un efecto positivo en el aumento para esta variable dependiente (Miramont 2012). Estos resultados también coinciden con los obtenidos por Echeverría (2012), quien encontró un aumento de ∆E causado por la adición de nanoarcilla en la matriz polimérica. Este efecto se explica debido a que disminuyó la luminosidad (L), el parámetro a* tendió hacia valores más negativos (más verde) y el b* hacia valores más positivos (más amarillo). 15 Cuadro 9. Coeficiente de regresión y probabilidad (P) de un modelo de regresión polinomial aplicado para diferencia de color de bioplástico. Variable Coeficiente P Intercepto -123.626 0.065857£ X1 3.339 0.063140£ X1 2 -0.023 0.060926£ X2 4.650 0.078278 £ X2 2 -0.320 0.005088£ X1X2 -0.019 0.477364 ns Falta de ajuste 0.219 ns R2 0.94 F. Tabular 3.01 F. Calculado 41.98 X1: % Relación AM:AY X2: % Orégano £significativo a P < 0.10 nsNo significativo Figura 2. Efecto de la combinación del % de orégano y relación AM:AY en la diferencia de color de los bioplásticos. Resistencia a la perforación. La fuerza de perforación se define como el pico de fuerza aplicada al material que se deforma antes de la ruptura del mismo (Vicentini 2003). La longitud y el espesor de la película son dos factores que influyen en la prueba para determinar la resistencia a la 16 perforación (Sobral et al. 1998). En los tratamientos evaluados se encontraron valores en un rango de 5.18 y 9.06 N (Cuadro 10). El tratamiento con 0.90% de orégano y una relación 80:20 de almidón de maíz y yuca presentaron la media más alta. Henríquez Velasco (2016) obtuvo valores muy similares (4.18 y 9.04 N) para bioplásticos elaborados a base de almidón de yuca y proteína de soya. Cuadro 10. Efecto de la combinación de porcentaje de orégano, almidón de maíz y yuca en la resistencia en Newton/mm (N/mm) de los bioplásticos. Tratamiento % Relación AM:AY€ % Orégano Resistencia a la perforación¥ T1 70:30 0.90 7.34 T2 80:20 0.90 9.06 T3 70:30 5.10 5.18 T4 80:20 5.10 6.74 T5 75:25 0.00 5.73 T6 75:25 6.00 6.93 T7 67.9:22.1 3.00 5.20 T8 82.1:17.9 3.00 7.15 T9 75:25 3.00 8.13 T10 75:25 3.00 8.01 T11 75:25 3.00 7.43 T12 75:25 3.00 7.31 % Coeficiente de Variación 13.47 € Hace referencia a la proporción de almidón de maíz, el restante es almidón de yuca. ¥ Media Los niveles lineal y cuadrático de las variables independientes fueron altamente significativos (P < 0.10). La variable almidón muestra un efecto positivo mientras que la variable orégano presenta un efecto negativo a nivel cuadrático. Con los coeficientes de regresión mostrados en el cuadro 11, y que fueron significativos, se generó la ecuación 14. El F calculado fue mayor que el F tabular, por lo que, el modelo se consideró de carácter predictivo y el comportamiento de todas las variables se ilustra en la Figura 4. Resultados similares fueron observados por Burgos (2013) en bioplásticos de nanocompuestos a base de ácido poliláctico y reforzado con montmorillonita. En este estudio, este efecto fue causado por la fuerte interacción interfacial entre la matriz y el orégano, debido a la gran superficie expuesta (Echeverría 2012). Resistencia a la perforación= -132.44 + 3.562 X1 - 0.023 X1 2 - 0.110 X2 2 [14] 17 Cuadro 11. Coeficiente de regresión y probabilidad (P) de un modelo de regresión polinomial aplicado para la resistencia a la perforación de bioplástico. Variable Coeficiente P Intercepto -132.442 0.035832 £ X1 3.562 0.034702 £ X1 2 -0.023 0.038848 £ X2 0.789 0.630590 ns X2 2 -0.110 0.055424 £ X1X2 -0.004 0.854548 ns Falta de ajuste 0.03£ R2 0.56 F. Tabular 3.98 F. Calculado 17.18 X1: % Relación AM:AY X2: % Orégano £significativo a P < 0.10 nsNo significativo Figura 3. Efecto de la combinación del % de orégano y relación AM:AY en la resistencia a la perforación de los bioplásticos. 18 Fuerza de tensión. Es considerado como un parámetro alternativo para caracterizar la resistencia (Sarantopoulos 2002). La fuerza de tensión representa la máxima resistencia de una película sometida a una prueba de elongación. En el cuadro 12 se detallan los valores encontrados en este estudio. Las medias de los análisis varían de 2.82 hasta 5.56 Newtons. El tratamiento con menor fuerza de tensión corresponde a un 3% de orégano y una relación 80:20 de almidón de maíz y yuca. El tratamiento con 0.90% de sustancia antifúngica y una mezcla de almidones de 70:30 presenta mayor fuerza de tensión y corresponde a un punto axial. El modelo fue considerado de carácter tendencioso ya que su falta de ajuste fue significativa. Los coeficientes de regresión significativos del cuadro 13 fueron utilizados para generar el modelo matemático expresado en la ecuación 15. Fuerza de tensión= -80.4102 + 2.474 X1 - 0.0178 X1 2 – 2.3489X2 - 0.0708 X2 2 + 0.0323 X1X2 [15] Cuadro 12. Efecto de la combinación de porcentaje de orégano, almidón de maíz y yuca en la fuerza de tensión en Newton de los bioplásticos. Tratamiento % Relación AM:AY€ % Orégano Tensión¥ T1 70:30 0.90 5.56 T2 80:20 0.90 4.11 T3 70:30 5.10 2.91 T4 80:20 5.10 3.93 T5 75:25 0.00 4.98 T6 75:25 6.00 3.59 T7 67.9:22.1 3.00 4.83 T8 82.1:17.9 3.00 3.24 T9 75:25 3.00 4.70 T10 75:25 3.00 4.85 T11 75:25 3.00 4.80 T12 75:25 3.00 4.73 % Coeficiente de Variación 18.90 € Hace referencia a la proporción de almidón de maíz, el restante es almidón de yuca. ¥ Media 19 Cuadro 13. Coeficiente de regresión y probabilidad (P) de un modelo de regresión polinomial aplicado para fuerza de tensión de bioplástico. Variable Coeficiente P Intercepto -80.4102 0.000956 £ X1 2.4740 0.000616 £ X1 2 -0.0178 0.000490 £ X2 -2.3489 0.002508 £ X2 2 -0.0708 0.001352 £ X1X2 0.0323 0.002209 £ Falta de ajuste 0.003£ R2 0.91 F. Tabular 5.25 F. Calculado 298.10 X1: % Relación AM:AY X2: % Orégano £significativo a P < 0.10 nsNo significativo El comportamiento del modelo se observa en la Figura 5. Se pudo observar que a medida aumenta el porcentaje de orégano disminuye la tensión de ruptura debido al efecto plastificante que tiene el antimicrobiano. Flores et al. (2007) observaron que la tensión a la ruptura de las películas hechas a base de almidón de mandioca y que contenían sorbato de potasio bajaba, al incrementar las proporciones del preservador. La pérdida de resistencia mecánica puede atribuirse a la ruptura de la microestructura de la red de película causada por los aceites añadidos. La microestructura se vuelve discontinua debido a sustancias incompatibles, la distribución de la fuerza externa en cada enlace de matriz se vuelve desigual, lo que lleva a una disminución en la resistencia mecánica del sistema (Wang et al. 2011). 20 Figura 4. Efecto de la combinación del % de orégano y relación AM:AY en la fuerza de tensión de los bioplásticos. Módulo de elasticidad. Mano y Mendes (1999) definieron el módulo de elasticidad como la razón entre la tensión y la deformación dentro del límite elástico, en el cual la deformación es proporcional a la tensión. Consecuentemente, esta variable permite expresar la rigidez de los bioplásticos. En el cuadro 14 se presentan los resultados del análisis de módulo de elasticidad, obteniendo valores desde 0.07 hasta 0.15 MPa. El tratamiento que mostró mayor moduló de elasticidad fue el tratamiento 1 con 0.90% de orégano y combinación de 70:30 de almidones, el cual fue un punto factorial. Mientras que el tratamiento 5 presentó menor módulo de elasticidad y corresponde a un punto axial. Los coeficientes de regresión no fueron significativos, consecuentemente no se pudo elaborar un modelo matemático para la variable módulo de elasticidad (Cuadro 15). 21 Cuadro 14. Módulo de elasticidad de bioplásticos con variables de combinación de porcentaje de orégano, almidón de maíz y yuca. Tratamiento % Relación AM:AY€ % Orégano Módulo de elasticidad (MPa) T1 70:30 0.90 0.15 T2 80:20 0.90 0.12 T3 70:30 5.10 0.09 T4 80:20 5.10 0.09 T5 75:25 0.00 0.07 T6 75:25 6.00 0.12 T7 67.9:22.1 3.00 0.12 T8 82.1:17.9 3.00 0.13 T9 75:25 3.00 0.12 T10 75:25 3.00 0.10 T11 75:25 3.00 0.11 T12 75:25 3.00 0.12 € Hace referencia a la proporción de almidón de maíz, el restante es almidón de yuca. Cuadro 15. Coeficiente de regresión y probabilidad (P) de un modelo de regresión polinomial aplicado para módulo de elasticidad de bioplástico. Variable Coeficiente P Intercepto 1.862538 0.082232 X1 -0.044361 0.104035 ns X1 2 0.000279 0.117232 ns X2 -0.044694 0.220006 ns X2 2 -0.001492 0.126610 ns X1X2 0.000698 0.164417 ns Falta de ajuste 0.003£ R2 0.20 X1: % Relación AM:AY X2: % Orégano £significativo a P < 0.10 nsNo significativo Solubilidad. Se define como la capacidad que tiene una sustancia de disolverse en otra (Ferreira 1986). Esta característica es importante ya que define la aplicabilidad de los bioplásticos. En el cuadro 16 se presentan los valores obtenidos del porcentaje de material soluble en agua para cada tratamiento. El menor porcentaje de solubilidad encontrado corresponde al tratamiento que no contiene orégano. Según los resultados, la incorporación de la fibra aumentó la solubilidad de los bioplásticos. 22 Cuadro 16. Efecto de la combinación de porcentaje de orégano, almidón de maíz y yuca en la solubilidad en agua (%) de los bioplásticos. Tratamiento % Relación AM:AY€ % Orégano Solubilidad (%)¥ T1 70:30 0.90 46.95 T2 80:20 0.90 52.02 T3 70:30 5.10 49.20 T4 80:20 5.10 55.93 T5 75:25 0.00 37.20 T6 75:25 6.00 50.53 T7 67.9:22.1 3.00 54.00 T8 82.1:17.9 3.00 48.48 T9 75:25 3.00 53.71 T10 75:25 3.00 51.87 T11 75:25 3.00 51.88 T12 75:25 3.00 50.23 % Coeficiente de Variación 4.02 € Hace referencia a la proporción de almidón de maíz, el restante es almidón de yuca. ¥ Media La variable orégano muestra un efecto negativo a nivel cuadrático. El modelo tuvo un ajuste de 0.61 y una falta de ajuste significativo, por lo cual se considera tendencioso. A partir de los coeficientes de regresión presentados en el cuadro 17, se generó el modelo matemático para la variable solubilidad (ecuación 14). La figura 3 presenta el comportamiento de las variables independientes donde se observó un aumento de solubilidad con la incorporación del material antifúngico. En un estudio realizado por Miramont (2012) encontró efecto de las sustancias antimicrobianas en la solubilidad de los bioplásticos. Este efecto negativo se debe a una menor organización de la estructura de la matriz. Los valores encontrados en este estudio coinciden con Chariguaman Chanatasig (2015), quien obtuvo menor porcentaje de solubilidad al no incluir harina de maracuyá en uno de sus tratamientos a diferencia del resto de tratamientos. Sin embargo, González et al. (2016), encontraron que al adicionar montmorillonita en las películas el porcentaje de solubilidad fue menor. La nanoarcilla interactúa con la matriz polimérica y disminuye los grupos hidroxilos disponibles. Por lo tanto, hay un mayor grado de dificultad de flujo de moléculas de agua. Solubilidad= - 0.7110 X2 2 [16] 23 Cuadro 17. Coeficiente de regresión y probabilidad (P) de un modelo de regresión polinomial aplicado para solubilidad de bioplástico. Variable Coeficiente P Intercepto 153.7502 0.311466 ns X1 -2.98410 0.439763ns X1 2 0.0198 0.441586ns X2 2.7873 0.624901 ns X2 2 -0.7110 0.0108873£ X1X2 0.0395 0.600065 ns Falta de ajuste 0.025£ R2 0.61 F. Tabular 3.11 F. Calculado 27.40 X1: % Relación AM:AY X2: % Orégano £significativo a P < 0.10 nsNo significativo Figura 5. Efecto de la combinación del % de orégano y relación AM:AY en la solubilidad de los bioplásticos. 24 Permeabilidad a vapor de agua (PVA). Se define como la tasa de transmisión de vapor de agua que pasa por unidad de superficie de un material de espesura conocida, que es inducida por una diferencia de presiones entre dos superficies específicas, con condiciones de temperatura y humedad relativa especifica ASTM E96-80 (ASTM 1989). Este proceso consta de tres etapas: la sorción y la solubilidad del líquido en la superficie del material. La segunda, al integrarse a ésta, genera una gradiente de concentración en la matriz, donde se toma en cuenta el grosor y el área de la película. Finalmente, la desorción y la evaporación del líquido en el otro lado del material (Trejo et al. 2001). La permeabilidad a vapor de agua se calcula como el cociente de la pendiente de perdida de agua versus el tiempo y el área de la película expuesta (Murillo 2011). Los valores obtenidos para el análisis de permeabilidad a vapor de agua se presentan en el cuadro 18. El tratamiento con menor valor de permeabilidad correspondió al tratamiento sin orégano incluido en la matriz. Cuadro 18. Permeabilidad a vapor de agua en g×mm/h×m2×kPa de los bioplásticos con los variables de combinación de porcentaje de orégano, almidón de maíz y yuca. Tratamiento % Relación AM:AY€ % Orégano PVA¥ T1 70:30 0.90 6.40 T2 80:20 0.90 3.61 T3 70:30 5.10 6.13 T4 80:20 5.10 8.65 T5 75:25 0.00 3.97 T6 75:25 6.00 8.72 T7 67.9:22.1 3.00 7.09 T8 82.1:17.9 3.00 7.26 T9 75:25 3.00 8.43 T10 75:25 3.00 8.25 T11 75:25 3.00 8.77 T12 75:25 3.00 8.97 % Coeficiente de Variación 13.54 € Hace referencia a la proporción de almidón de maíz, el restante es almidón de yuca. ¥ Media El ajuste del modelo fue de 93% con una falta de ajuste no significativa. Con los coeficientes de regresión obtenidos del Cuadro 19 se generó la ecuación 17 que es de carácter predictivo. El comportamiento del modelo se muestra en la Figura 6. Las variables independientes tuvieron efectos significativos en todos los niveles (lineal, cuadrática y combinación). La incorporación del compósito en los bioplásticos causó un aumento en el valor de permeabilidad a vapor de agua. La combinación de orégano y mezcla de almidón tuvo un efecto significativo en el aumento de la permeabilidad. Esto se atribuye a una mayor distancia entre las cadenas del polímero por la adición del compósito (Kamperepappum et al. 2007). Mientras que la adición de compuestos antimicrobianos como árbol de té en películas de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) presentó menores valores de PVA en 25 comparación al tratamiento control (Bagán et al. 2009). La disminución del porcentaje de almidón en la formulación también aumenta la permeabilidad a vapor de agua (Villada et al. 2007). En comparación a los polímeros sintéticos como el polietileno de baja densidad, las biopelículas presentan muy baja resistencia al vapor de agua (Miramont 2012). PVA= -160.584 + 4.766 X1 - 0.034 X1 2 – 7.011X2 -0.283 X2 2 + 0.125X1X2 [17] Cuadro 19. Coeficiente de regresión y probabilidad (P) de un modelo de regresión polinomial aplicado para permeabilidad a vapor de agua de bioplástico. Variable Coeficiente P Intercepto -160.584 0.011840 £ X1 4.766 0.008651 £ X1 2 -0.034 0.006930 £ X2 -7.011 0.009247 £ X2 2 -0.283 0.002210 £ X1X2 0.125 0.003877 £ Falta de ajuste 0.153 ns R2 0.93 F. Tabular 2.96 F. Calculado 44.79 X1: % Relación AM:AY X2: % Orégano £significativo a P < 0.10 nsNo significativo Figura 6. Efecto de la combinación del % de orégano y relación AM:AY en la permeabilidad a vapor de agua de los bioplásticos. 26 Función de utilidad. Se consideraron las variables dependientes ΔE, opacidad, resistencia a la perforación, fuerza de tensión y permeabilidad a vapor de agua. La optimización se observa en la figura 7. Los valores encontrados fueron de 77.60% de combinación almidón de maíz, 22.40% almidón de yuca y 1.7% de orégano. Figura 7. Valores óptimos de las variables independientes sobre las propiedades ópticas, mecánicas y de barrera de un bioplástico con orégano y combinación de almidón de maíz y yuca. 27 Actividad antifúngica in vitro de los bioplásticos. La cuantificación de la actividad inhibitoria se realizó a través de la medición de diámetro de inhibición. Al momento de colocar los discos sobre la superficie del agar inoculado con esporas, se evaluó la capacidad de los bioplásticos de interactuar con el medio. La migración de las sustancias antifúngicas se determinó con la observación de halos claros en la superficie de los platos. En el cuadro 20 se presentan los valores de diámetro de inhibición que se encontraron durante el experimento. El rango fue de 0.5 a 1.112 cm de diámetro. Siendo el tratamiento sin orégano y con una relación de almidón de maíz y yuca 75:25 con el menor valor. El tratamiento con mayor diámetro de inhibición contenía el mayor porcentaje de orégano (6%) y la combinación 75 y 25% de almidón de maíz y yuca, respectivamente. Se observaron diferencias estadísticas entre los distintos tratamientos evaluados. Los tratamientos: 3, 4 y 6 presentaron mayores diámetros de inhibición en comparación a los otros tratamientos. El incremento en el porcentaje de orégano implica un incremento de la zona de inhibición. Consecuentemente, se confirmó que el compósito posee propiedades antifúngicas. Estos resultados son consistentes con los de Suarez et al. (2015), quienes encontraron que la aplicación de aceite esencial de orégano en papaya contrarrestó la antracnosis en un 37%. El carvacrol, uno de los principales componentes del orégano, podría interactuar con las membranas celulares al cambiar la permeabilidad de los cationes pequeños. Como los compuestos químicos en aceites esenciales y extractos de orégano son complejos, podrían inhibir microorganismos a través de diferentes objetivos celulares (Liu et al. 2017). Cuadro 20. Efecto de la combinación de porcentaje de orégano, almidón de maíz y yuca en el diámetro de inhibición en centímetros contra Alternaria alternata. Tratamiento % Relación AM:AY€ % Orégano Diámetro de inhibición + D.E¥ T1 70:30 0.90 0.700 + 0.04 C T2 80:20 0.90 0.592 + 0.03 D T3 70:30 5.10 1.087 + 0.05 A T4 80:20 5.10 1.080 + 0.05 A T5 75:25 0.00 0.500 + 0.00 E T6 75:25 6.00 1.112 + 0.05 A T7 67.9:22.1 3.00 0.900 + 0.03 B T8 82.1:17.9 3.00 0.907 + 0.01 B T9 75:25 3.00 0.905 + 0.04 B % Coeficiente de Variación 5.28 A-E Medias seguidas con letras mayúsculas diferentes en la columna son estadísticamente diferentes (P < 0.05). € Hace referencia a la proporción de almidón de maíz, el restante es almidón de yuca. ¥ Media + deviación estándar. 28 4. CONCLUSIONES  Se determinó que la combinación de 77.60% almidón de maíz, 22.40% almidón de yuca y 1.7% de orégano resultan en una mejora de las propiedades físicas y de barrera de los bioplásticos.  Se elaboraron dos modelos de carácter predictivo y cuatro de carácter tendencioso que explican el comportamiento de las propiedades de los bioplásticos en función de las variables orégano y almidón.  La incorporación de orégano en polvo en la matriz polimérica fue capaz de inhibir el crecimiento del hongo de manera significativa (P < 0.05). 29 5. RECOMENDACIONES  Realizar el revestimiento en frutas susceptibles al hongo patógeno para evaluar la eficacia del bioplástico.  Reformular las biopelículas utilizando un menor tamaño de partícula de orégano.  Caracterizar el perfil reológico de la solución filmogénica y las propiedades térmicas de las películas. 30 6. LITERATURA CITADA Alvarez RM. 2012. Formulación de un recubrimiento comestible para frutas cítricas. [Tesis]. Universidad de Antioquia, Medellín Colombia. 207 p. ASTM(American Society for Testing Material) 1995. Annual Book of ASTM Standars. D828-95a ed. Philadelphia. Bagán MM, González LS, Cháferl M, Martinez CG, Boix AC. 2009. Recubrimientos antimicrobianos a base de hidroxipropilmetilcelulosa y aceite esencial de árbol de té [Tesis]. Departamento de Tecnología de Alimentos, Instituto Universitario de Ingeniería de Alimentos para el Desarrollo, Universidad Politécnica de Valencia, Camino de Vera s/n, 46022 Valencia, España. 20 p. Box EP, Hunter JS, Hunter WG. 1978. Statistics for experimenters: An introduction to design, data and model building, New York: John Wiley y Sons. 664 p. Burgos BN. 2013. Desarrollo de bionanocompuestos en base a poli (ácido láctico) y plastificantes de alta compatibilidad para el envasado de alimentos. España. [consultado 2018 agosto 17]. https://rua.ua.es/dspace/bitstream/10045/31986/1/tesis_nuriaburgosbo lufer.pdf Chariguaman Chanatasig JA. 2015. Caracterización de bioplástico de almidón elaborado por el método de casting reforzado con albedo de maracuyá (Passiflora edulis spp.) [Tesis]. Escuela Agrícola Panamericana, Zamorano-Honduras. 68p. Durango AM, Soares NF, Arteaga MR. 2011. Filmes y revestimientos comestibles como empaques activos en la conservación de alimentos. Biotecnología sector agropecuaria y agroindustria. 9 (1): 112-118. Echeverría I. 2012. Materiales biodegradables en base a proteínas de soja y montmorillonitas [Tesis]. Universidad Nacional de La Plata, Argentina. [consultado 2018 sep 05]. http://sedici.unlp.edu.ar/handle/10915/18534. FAO (Food and Agriculture Organization) 2017. Perspectivas mundiales de las principales frutas tropicales. [consultado 2018 mayo 10]. http://www.fao.org/fileadmin/templates/es t/COMM_MARKETS_MONITORING/Tropical_Fruits/Documents/Tropical_Fruits_Spa nish2017.pdf https://rua.ua.es/dspace/bitstream/10045/31986/1/tesis_nuriaburgosbo%20lufer.pdf https://rua.ua.es/dspace/bitstream/10045/31986/1/tesis_nuriaburgosbo%20lufer.pdf 31 Farias MG, Fakhouri FM, Carvalho WP, Ascheri LR. 2012. Caracterizacao físico-química de filmes comestíveis de amido adicionado de acerola (Malphigia emarginata D.C.). Quim. Nova 35:546-552. [consultado 2018 mayo 23]. http://www.scielo.br/scielo.php?script=s ci_arttext&pid=S010040422012000300020&lng=en&nrm=iso&tlng=pt Ferreira A. 1986. Novo Dicionátio De Língua Portuguesa, 2a Ed. 35a Impressao, Editora Nova Fronteira. 2151 p. Flores S, Famá L, Rojas A, Goyanes S, Gerschenson L. 2007. Physical properties of tapioca-starch edible films: Influence of filmmaking and potassium sorbate. Food Research International 40(2): 257–265. García-Camarillo EA, Quezada-Viay MY, Moreno-Lara J, Sánchez-Hernández E, Pérez- Reyes MC. 2006. Actividad antifúngica de aceites esenciales de canela (Cinnamomum zeylanicum) y orégano (Origanum vulgare L.) y su efecto sobre la producción de aflatoxinas en nuez pescara. Revista Mexicana de Fitopatología 24(1):8-12. Gontard N, Guilbert S, Cuq J-L. 1992. Edibe Wheat Gluten Films: Influence of the Main Process Variables on the Film Properties using Response Surface Methodology. J. Food Sci. 57:190-195. González RA, Sotelo BM, Gutiérrez MF. 2016. Películas de almidón de papa obtenidas por casting y extrusión reforzadas con montmorillonita de sodio modificada. México. [consultado 2018 Agosto 27]. http://www.fcb.uanl.mx/IDCyTA/files/volume1/2/8/110.pdf Henríquez Velasco JG. 2016. Optimización de revestimientos comestibles a base de proteína de soya, almidón de yuca y plastificantes en manzanas (Malus domestica) [Tesis]. Escuela Agrícola Panamericana, Zamorano-Honduras. 39p. Humberto GP, Roman VS, 2008. Análisis y diseño de experimentos. Segunda edición. México. Editorial Mc Graw-Hill Interamericana. 736 p. ISBN-10: 970-10-6526-3. Kamperapappum P, Pentrakoon D, Srikulkit K. 2007. Preparation of cassava starch/montmorillonite nanocomposite film. J Sci Res Chula. 29(2):183-197. Liu Q, Meng X, Li Y, Zhao CN, Tang GY, Li HB. 2017. Antibacterial and Antifungal Activities of Spices. Int J Mol. Sci 18:2-7. López LI, Martínez PG, Baños SB, Jiménez LF, Zavaleta HA. 2013. Evaluación de la actividad antifúngica del quitosano en Alternaría alternata y en la calidad del mango 'Tommy Atkins' durante el almacenamiento. Chapingo 19(3):315-331. Mali S, Grossman M, García M, Martino MN, Zaritzky NE. 2008. Antiplasticizing effect of glycerol and sorbitol on the properties of cassava starch films. Braz. J. Food Technol. 11:194–200. http://www.scielo.br/scielo.php?script=s%20ci_arttext&pid=S010040422012000300020&lng=en&nrm=iso&tlng=pt http://www.scielo.br/scielo.php?script=s%20ci_arttext&pid=S010040422012000300020&lng=en&nrm=iso&tlng=pt http://www.fcb.uanl.mx/IDCyTA/files/volume1/2/8/110.pdf 32 Mano E, Mendes L. 1999. Avalicao das propiedades dos polímeros. In: introducao A polímeros. Editoria Edgard Blucher Ltda. Sao Paulo, Brasil. p. 58-64. Miramont S. 2012. Recubrimientos elaborados a partir de biopolímeros para el soporte de sustancias con actividad antimicrobiana: carvacrol y sorbatos [Tesis]. Buenos Aires, Argentina. [consultado 2018 sep 12]. http://posgrado.frba.utn.edu.ar/investigacion /tesis/MTA-2012-Sofia%20Miramont.pdf Muñoz Garrido JM. 2014. Evaluación, caracterización y optimización de un bioplástico a partir de la combinación de almidón de maíz, yuca y glicerol en sus propiedades físicas y de barrera [Tesis]. Escuela Agrícola Panamericana, Zamorano-Honduras. 30p. Murillo MM, 2011. Evaluación de propiedades mecánicas, ópticas, antioxidantes y de barrera de películas comestibles elaboradas con emulsiones dobles w1/o/w2 adicionadas con extracto de té verde (Camellia sinensis) [Tesis]. División De Ciencias Biológicas Y De La Salud: Universidad Autónoma Metropolitana. México D.F., México. [consultado 2018 agosto 30]. http://148.206.53.84/tesiuami/UAMI15374.pdf Oliveira LM, Vercelino Alves RM, Sarantópulis CIGL, Padula M, Correa Garcia EE, Coltro L. 1996. Ensaios para avaliaco de embajagens platicas flexiveis. Centro de Tecnologia de Embalagem, Campinas-Brasil. 219 p. Ponce A, Roura SC, Moreira M. 2008. Antimicrobial and antioxidant activities of edible coatings enriched with natural plant extracts: In vitro and in vivo studies. Postharvest Biology and Technology 49:294-300. Rafael Álvarez. 2012. Formulación de un recubrimiento comestible para frutas cítricas. [Tesis]. Medellín, Colombia: Universidad de Antioquia. http://bibliotecadigital.udea.edu.co/bitstream/10495/1618/1/TESIS%20DOCTORAL%20 RAFAEL%20ALVAREZ.pdf. Rocha GO. 2009. Obtencao e caracterizao de films biodegradáveis a partir de misturas de amido de amndioca e extrato protéico de soja [Tesis]. Universidad Federal Rural, Rio de Janeiro-Brasil. 45 p. Sarantópoulos CL, Oliveira M, Padula L, Coltro R, Alves García E. 2002. Embalagens plasticas flexiveis. Principais polímeros e avaliacao de propiedades [Tesis]. CETEA, Campinas Brasil. 267 p. Sobral PJ, Ocuno D, Savastano Junior H. 1998. Preparo de proteínas miofibrilares de carne e elaboracao de biofilmes con dois tipos de ácidos; propiedades mecánicas. Braz. J. Food Technol. 1(1-2):44-52. http://posgrado.frba.utn.edu.ar/investigacion http://148.206.53.84/tesiuami/UAMI15374.pdf http://bibliotecadigital.udea.edu.co/bitstream/10495/1618/1/TESIS%20DOCTORAL%20RAFAEL%20ALVAREZ.pdf http://bibliotecadigital.udea.edu.co/bitstream/10495/1618/1/TESIS%20DOCTORAL%20RAFAEL%20ALVAREZ.pdf 33 Suárez AG, Márquez MA, Vargas AA. 2015. Desarrollo de un recubrimiento con efecto antifúngico y antibacterial a base de aceite esencial de orégano para la conservación de papaya ´Maradol´. Rev. Iber. Tecnología Postcosecha 16(1):58-63. Sullon HP. 2012. Etiología del manchado y pudrición peduncular del mango [Tesis]. Universidad Nacional de Piura, Perú. 113p. Torres CA, Rojas AJ. 2014. Efecto de recubrimientos comestibles a base goma Gellan, gelatina y caseína sobre la cinética de deterioro de la mora de castilla Rubus glaucus Benth. Tolima. 154 p. [consultado 2018 ago 30]. https://www.scribd.com/document /254426691/RIUT-FBA-spa-2014-Efecto-de-Recubrimientos-Comestibles-a-Base-Goma- Gellan-Gela tina-y-Caseina-Sobre-La-Cinetica-de-Deterioro-de-La-Mora-de-Castilla-Ru. Trejo V, Aragón N, Miranda P. 2001. Estimación de la permeabilidad al vapor de agua en películas a base de quitosán. Journal of the Mexican Chemical Society. 45(1):1-5. Vázquez-Briones MC. 2013. Recubrimientos de frutas con biopelículas. [Tesis]. Puebla, México: Universidad de las américas Puebla. http://web.udlap.mx/tsia/files/2014/12/TSIA- 72-Vazquez-Briones-et-al-2013.pdf Velásquez-Santos CO, Acevedo-Álvarez CA. 2014. Procedimiento para deshidratación de orégano utilizando gas propano como combustible. Tecno Lógicas. 17(33): 13-20. Vicentini NM. 2003. Elaboração E Caracterização De Filmes Comestíveis À Base De Fécula De Mandioca Para Uso Em Pós-Colheita [Tese de Doutorado]. Faculdade de Ciencias Agronomicas- Unesp, Botucatu-Brasil. 198 p. Villada H, Acosta HA, Velasco RJ. 2007. Biodegradables biopolymers naturals used in biodegradable. Polymer (Guildf). 12:5–13. Wang L, Liu F, Jiang Y, Chai Z, Li P, Cheng Y, Jing H, Leng X. 2011. Synergistic Antimicrobial Activities of Natural Essential Oils with Chitosan Films. J. Agri. Food Chem. 59(23):12411-12419. https://www.scribd.com/document%20/254426691/RIUT-FBA-spa-2014-Efecto-de-Recubrimientos-Comestibles-a-Base-Goma-Gellan-Gela%20tina-y-Caseina-Sobre-La-Cinetica-de-Deterioro-de-La-Mora-de-Castilla-Ru https://www.scribd.com/document%20/254426691/RIUT-FBA-spa-2014-Efecto-de-Recubrimientos-Comestibles-a-Base-Goma-Gellan-Gela%20tina-y-Caseina-Sobre-La-Cinetica-de-Deterioro-de-La-Mora-de-Castilla-Ru https://www.scribd.com/document%20/254426691/RIUT-FBA-spa-2014-Efecto-de-Recubrimientos-Comestibles-a-Base-Goma-Gellan-Gela%20tina-y-Caseina-Sobre-La-Cinetica-de-Deterioro-de-La-Mora-de-Castilla-Ru 34 7. ANEXOS Anexo 1. Conteo de esporas en cámara Neubauer. Anexo 2. Espectrofotometría de las películas de almidón de yuca y maíz con diferentes concentraciones de orégano. 35 Anexo 3. Zona de inhibición de bioplásticos con diferentes concentraciones de orégano. Portada Portadilla Resumen Tabla de contenido Indice de cuadros, figuras y anexos Introducción Materiales y Métodos Resultados y Discussión Conclusiones Recomendaciones Literatura Citada Anexos