Escuela Agrícola Panamericana, Zamorano Maestría en Ciencias en Agricultura Tropical Sostenible Tesis de Grado de Maestría Efecto de la bioestimulación de salvado de arroz y harina de soya con enzimas y microorganismos en la producción de camarón (Litopenaeus vannamei) en Honduras Estudiante Jorge Luis Caballero Morales Asesores Patricio Paz, Ph.D. Luis Maldonado, Ph.D. Honduras, junio 2021 Autoridades TANYA MÜLLER GARCÍA Rectora ANA M. MAIER ACOSTA Vicepresidenta y Decana Académica ARIE SANDERS Decano Asociado de Posgrado HUGO ZAVALA MEMBREÑO Secretario General ZAMORANO MAESTRÍA EN CIENCIAS EN AGRICULTURA TROPICAL SOSTENIBLE Efecto de la bioestimulación de salvado de arroz y harina de soya con enzimas y microorganismos en la producción de camarón (Litopenaeus vannamei) en Honduras Tesis de graduación presentado como requisito parcial para optar al título de Maestría en Ciencias en Agricultura Tropical Sostenible Presentado por Jorge Luis Caballero Morales Zamorano, Honduras Junio, 2021 i ii La defensa oral y el documento de tesis de Jorge Luis Caballero Morales fue revisada y aprobada por el siguiente personal docente y autoridades de la Universidad Zamorano1: Patricio Paz, Ph.D. Asesor principal Luis Fernando Maldonado, Ph.D. Asesor secundario Arie Sanders, Ph.D. Decano Asociado de Posgrado Juan Carlos Rosas, Ph.D. Director de Investigación de la MATS Ana Maier, Ph.D. Vicepresidente y Decana Académica 1La hoja de remisión de Visto Bueno contiene las firmas y este documento se encuentra en custodia de la Oficina de Registro. iii Las actividades de investigación y desarrollo en las que se basa gran parte de este trabajo de tesis fueron posibles en parte gracias al apoyo de la Fundación Nippon. El contenido es responsabilidad del autor y no refleja necesariamente los puntos de vista de Fundación Nippon. iv Efectos de la bioestimulación de salvado de arroz y harina de soya con enzimas y microorganismos en la producción de camarón (Litopenaeus vannamei) en Honduras Jorge Luis Caballero Morales Resumen. El objetivo del estudio fue determinar los efectos de la aplicación de probióticos y prebióticos bio estimulados y cambios nutricionales en salvado de arroz y harina de soya en los parámetros productivos de camarón (Litopenaeus vannamei) y en los suelos de lagunas semi intensivas. El ensayo se realizó en estanques de tierra en una finca comercial en Choluteca, Honduras, con tres tratamientos: bioestimulación de salvado de arroz + 100% alimentación comercial, harina de soya fermentada 29% + 71% de alimentación comercial, y 100% alimentación comercial (control). Se utilizó un diseño completo al azar y análisis de varianza (ANDEVA) con separación de medias de Duncan para la densidad de cosecha/m2, sobrevivencia (%) e índice de conversión alimenticia en camarones cosechados a los88 días de cultivo. No se encontraron diferencias para las variables evaluadas. En los ANDEVA con medidas repetidas en el tiempo para elementos en el suelo, se encontraron diferencias (P ≤0.05) en el aumento de hierro y la relación C:N, y la disminución de N después de un ciclo de engorde. Las pruebas t, antes y después de la bioestimulación, determinaron un aumento (P≤0.05) para extracto etéreo, fibra cruda y Fe, y la disminución en el contenido de P en la harina de soya fermentada; y el aumento en fibra cruda, y la disminución en proteína cruda y extracto etéreo en salvado de arroz. Los parámetros estuvieron dentro de las condiciones óptimas de cultivo. Palabras clave. Alimentos funcionales, biomimetismo, hidróxido de calcio, óxido de silicio. Abstract. The aim of the study was to determine the effects on the application of biostimulated probiotics and prebiotics and nutritional changes in rice bran and soybean meal on the productive parameters of shrimp (Litopenaeus vannamei) and soils of semi-intensive lagoons. The essay was conducted in earthen ponds of a commercial farm in Choluteca, Honduras, with three treatments: biostimulation of rice bran + 100% commercial feed; 29% fermented soybean meal + 71% commercial feed; and 100% commercial feed (control). A randomized complete design and analyses of variance (ANOVA) with Duncan mean separation were used for harvest density/m2, survival (%) and feed conversion rate measured on shrimp harvested at 88 days of cultivation. In this study no differences were found for the evaluated variables. ANOVA were used to analyzed repeated measurements over time for soils elements, and differences were found (P ≤0.05) in the increase in iron and C: N relation and decrease in N after a fattening cycle. The t tests before and after bio stimulation, determinates an increase (P ≤0.05) in ethereal extract, crude fiber, and iron, a decrease in P content in fermented soybean meal, and decrease of crude fiber and ethereal extract in rice bran. The parameters were within the optimal cultivation conditions. Key words. Functional foods, biomimicry, calcium hydroxide, silicon oxide. v CONTENIDO Portadilla ....................................................................................................................... i Página de autorización .................................................................................................. ii Resumen ........................................................................................................................ iv Contenido ...................................................................................................................... v Índice de cuadros figuras y anexos……………………………………….…………………………. ......... vi 1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................................... 1 2. MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................................................................................... 7 3. RESULTADOS ........................................................................................................................................... 14 4. DISCUSIÓN ............................................................................................................................................... 28 5. CONCLUSIONES ....................................................................................................................................... 34 6. REFERENCIAS ........................................................................................................................................... 35 7. ANEXOS ................................................................................................................................................... 48 vi ÍNDICE DE CUADROS, FIGURAS y ANEXOS Cuadros Página 1. Efecto de los tratamientos de alimentación en el incremento de peso acumulado del camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei) en estadio de engorde en nueve semanas de cultivo. ................................................................................................................................................... 177 2. Efecto de los tratamientos de alimentación en la densidad de cosecha por m2, índice de conversión alimenticia, productividad de camarón entero y de colas en el cultivo de camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei) en estadio de engorde en nueve semanas de cultivo. ................................................................................................................................................... 188 3. Diferencias en los insumos de los tratamientos de alimentación en la cantidad de insumos generales por tratamiento y por hectárea en un ciclo de nueve semanas de cultivo de camarón blanco del pacífico (Litopenaeus vannamei) en estadio de engorde. ....................................... 199 4. Efecto de los tratamientos de alimentación en los costos de los insumos generales por tratamiento en un ciclo de nueve semanas de cultivo de camarón blanco del pacífico (Litopenaeus vannamei) en estadio de engorde. ...................................................................... 199 5. Efecto de los tratamientos de alimentación en el uso de hidróxido de calcio y sus emisiones (t CO2/ha) en un ciclo de engorde de nueve semanas de cultivo de (Litopenaeus vannamei) en lagunas semi intensivas. .............................................................................................................. 20 6. Efecto de los tratamientos de alimentación en el costo de producción por hectárea (US$/(ha) en el cultivo de camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei) en estadio de engorde en nueve semanas de cultivo. ......................................................................................................... 211 7. Análisis de hierro, zinc y cobre en suelos antes y después de un ciclo experimental de nueve semanas de engorde de (Litopenaeus vannamei) con tratamientos de alimentación de camarón del Pacífico en lagunas semi intensivas ..................................................................................... 233 8. Análisis de potencial de hidrógeno, materia orgánica, carbono orgánico en suelos antes y después de un ciclo experimental de engorde de (Litopenaeus vannamei) con tratamientos de alimentación de camarón del Pacifico en lagunas semi intensivo............................................. 244 9. Análisis de nitrógeno, relación carbono nitrógeno y fósforo en suelos antes y después de un ciclo experimental de engorde de (Litopenaeus vannamei) con tratamientos de alimentación de camarón del Pacífico en lagunas semi intensivo. ...................................................................... 244 10. Análisis proximal de salvado de arroz sin fermentar, salvado de arroz fermentado, harina de soya sin fermentar y harina de soya fermentada en tratamientos de alimentación de camarón del Pacífico en lagunas semi intensivo. ...................................................................................... 255 11. Análisis de Hierro y fósforo en salvado de arroz sin fermentar, salvado de arroz fermentado, harina de soya sin fermentar y harina de soya fermentada. ..................................................... 266 Figuras Página 1. Crecimiento bacteriano de la bioestimulación aeróbica de salvado de arroz según la metodología de vaciado en placa (crecimiento máximo en 18 h de bio estimulación). ............. 16 vii 2. Crecimiento bacteriano de la fermentación anaeróbica de HSF con la metodología de vaciado en placa (crecimiento máximo en 18 h de bio estimulación). ..................................................... 16 3. Aplicación de Ca(OH)₂ en lagunas de cultivo de camarón en Choluteca, Honduras (finca Biomar Grupo Seajoy 2020). ..................................................................................................................... 21 Anexos Página 1. Efecto de los tratamientos de alimentación en la variación en la cantidad de oxígeno en el cultivo de camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei) en estadio de engorde en nueve semanas de cultivo....................................................................................................................... 48 2. Efecto de los tratamientos de alimentación en la variación en la temperatura (°C) del agua en el cultivo de camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei) en estadio de engorde en nueve semanas de cultivo. ........................................................................................................... 48 3. Efecto de los tratamientos de alimentación en la alcalinidad del agua en el cultivo de camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei) en estadio de engorde en nueve semanas de cultivo. ..................................................................................................................................................... 49 4. Efecto de los tratamientos de alimentación en el comportamiento de fosfatos (mg/L) del agua de cultivo de camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei) en estadio de engorde en nueve semanas de cultivo. ........................................................................................................... 49 5. Efecto de los tratamientos de alimentación en el comportamiento de amonio (NH4) en el cultivo de camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei) en estadio de engorde en nueve semanas de cultivo....................................................................................................................... 50 6. Efecto de los tratamientos de alimentación en el comportamiento de nitratos (mg/L) del agua de cultivo de camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei) en estadio de engorde por tratamiento en nueve semanas de cultivo. ................................................................................. 50 7. Efecto de los tratamientos de alimentación en el comportamiento de pH del agua de cultivo de camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei) en estadio de engorde en nueve semanas de cultivo....................................................................................................................... 51 8. Efecto de los tratamientos de alimentación en el comportamiento de silicatos del agua de cultivo de camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei) en estadio de engorde en nueve semanas de cultivo....................................................................................................................... 51 9. Efecto de los tratamientos de alimentación en la ganancia de peso semanal del cultivo de camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei) en estadio de engorde en nueve semanas de cultivo. ..................................................................................................................................... 52 10. Efecto de los tratamientos de alimentación en el peso inicial (g), peso final (g) y supervivencia del cultivo de camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei) en estadio de engorde en nueve semanas de cultivo. ........................................................................................................... 53 11. Efecto de los tratamientos de alimentación en el conteo de Vibrio en medio agar TCBS en el agua de cultivo de camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei) en estadio de engorde en nueve semanas de cultivo. ...................................................................................................... 54 12. Efecto de los tratamientos de alimentación en el conteo de Vibrio en medio agar TCBS en la carne de juveniles de camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei) en estadio de engorde en nueve semanas de cultivo. ...................................................................................................... 55 viii 13. Efecto de los tratamientos de alimentación en el conteo de cianofitas, clorofitas y diatomeas (cel/mL) en cinco semanas de cultivo de camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei) en estadio de engorde. ..................................................................................................................... 56 14. Perfil de ácidos grasos de salvado de arroz sin fermentar (SASF) y salvado de arroz fermentado (SAF). ............................................................................................................................................ 57 15. Perfil de ácidos grasos de harina de soya desgrasada sin fermentar y harina de soya desgrasada fermentada. .............................................................................................................. 58 1 1. INTRODUCCIÓN La acuacultura, el cultivo de peces, crustáceos y plantas acuáticas, es el sector de producción de alimentos con mayor crecimiento en el planeta (Food and Agriculture Organization of the United Nations 2018). La producción procedente de la acuacultura global aumentó seis veces entre 1990 y 2016, con un promedio de crecimiento de 5.8% durante el período de 2000-2016 (Ahmed et al. 2019). La República de China es el mayor productor (61.5% de la producción mundial), seguido de India, Indonesia, Vietnam, Bangladesh, Egipto, Noruega, Chile, Myanmar y Tailandia (Ahmed et al. 2019). En los años 80´s cuando comenzó el crecimiento del cultivo de camarón en América, el mayor aumento de área cultivada de camarón se produjo en el sur de Honduras, que para 1996, se había convertido en el segundo mayor productor de camarones criados en granjas en el hemisferio occidental. El crecimiento del cultivo fue tal que se expandió hasta Nicaragua, atrayendo a inversionistas que desarrollaron granjas a lo largo del Golfo de Fonseca (Dewalt et al. 1996). Aun cuando el sector tiene una tendencia de crecimiento favorable, existen obstáculos como la disponibilidad de materias primas para la elaboración de alimentos y el aumento de enfermedades (Toledo et al. 2018). Según Audelo Naranjo et al. (2012), la intensificación de la acuacultura es limitada, no solo por el alto costo de los alimentos formulados, sino también por la pérdida del alimento y su bajo aprovechamiento, lo que posiblemente provoca el deterioro del medio ambiente del estanque y un crecimiento deficiente, o genera costos aún más altos, debido a la necesidad de aumentar las tasas de intercambio de agua que es bombeada en la mayoría de los casos por maquinaria que requiere combustible fósil. A medida que se intensifica la producción se ha encontrado mayor dificultad en el manejo de la calidad del agua, causada por la acumulación de materia orgánica y metabolitos tóxicos para los camarones, como los compuestos nitrogenados (Ladino-Orjuela y Rodríguez-Pulido 2009). La mayor parte de los desechos generados en la producción de camarón se han vertido en el océano, ríos, canales, sistemas de drenaje y vertedero (Zarcinas et al. 2004). El cultivo de camarón crea condiciones artificiales en el ambiente que pueden llegar a favorecer la selección, adaptación y crecimiento de comunidades bacterianas que son parte de la flora normal de los organismos acuáticos. Estas comunidades no representan un riesgo para los organismos a menos que éstos se encuentren estresados, débiles y/o inmunodeprimidos (Gomez-Jimenez et al. 2005); (Young et al. 2000). Los camarones pueden acumular diversas especies de bacterias en su tracto intestinal, branquias y exoesqueleto (Gomez-Jimenez et al. 2005). Algunas bacterias pueden ocasionar infecciones que son destructivas para las granjas de camarón. El género Vibrio, uno de los que conforman este microbioma, son microorganismos oportunistas que responden a los cambios en las condiciones ambientales resultantes de la acuacultura llegando a tener características tóxicas y patogénicas para los camarones (Gomez-Jimenez et al. 2005). Las especies del género Vibrio han sido reportadas como las causantes de serias pérdidas económicas en la producción de camarón de cultivo en diversos países. La mortalidad de camarón originada por este 2 grupo de bacterias puede variar desde intervalos insignificantes hasta presentar mortalidades del 100%, afectando principalmente a las postlarvas y juveniles (Gomez-Jimenez et al. 2005). Algunas especies del género Vibrio cumplen un rol muy importante en la producción acuícola; no sólo debido a que algunos miembros de este género son el principal patógeno bacteriano, sino porque también pueden ser probióticos. Diversas especies de Vibrio como V. parahaemolyticus, V. damsela, V. vulnificus y V. harveyi, han sido reportadas como patógenas durante el desarrollo larvario del camarón. Entre estas destaca, la bacteria luminosa V. harveyi, por ser una de las principales causas de la mortalidad masiva del camarón en condiciones de cultivo (Quiroz-Guzmán 2005; Quiroz-Guzmán et al. 2018). Los camarones juveniles o adultos afectados por vibriosis, pueden presentar diferentes signos clínicos según el grado de severidad de la infección. Estos pueden incluir letargia, nado errático, pérdida del reflejo de huida, nado hacia las orillas del estanque, anorexia, intestino vacío, coloración rojiza, urópodos rojos, edema en los urópodos, opacidad del músculo intestinal, perforaciones del exoesqueleto, melanización de la cutícula o apéndices rojos (Cuéllar-Anjel 2013). Una de las bacterias más importantes en el cultivo de camarón V. parahaemolyticus es una bacteria entérica, que habita naturalmente en aguas costeras. Es anaerobia facultativa, crece en condiciones de salinidad de hasta el 8%, a temperatura entre 10 °C a 44 °C con óptima entre 35 °C a 37 °C. Sus condiciones óptimas de pH se encuentran en un rango entre 7.5 a 8.6 y un tiempo de generación estimado en 10 a 12 minutos (Zamora Pantoja 2005). Cuando la temperatura sube se encuentra en las aguas litorales y coloniza a animales del plancton, filtradores como ostiones y mejillones, peces y camarón, mientras que cuando la temperatura baja se encuentra en los sedimentos marinos. V. parahaemolyticus se adhiere a las superficies de quitina (componente estructural de algunos organismos marinos, como es el caso de la superficie del camarón), y sobre ella incrementa su concentración, ya que los nutrientes para su crecimiento se encuentran en mayor abundancia (Rodríguez-Camacho et al. 2014). Para lograr control de estos microorganismos algunos agricultores han usado hipoclorito, formalina, compuestos de amonio cuaternario, yodóforos y peróxido de hidrógeno como desinfectantes y los antibióticos fluoroquinolonas, tetraciclinas y sulfonamidas que ejercen la destrucción no selectiva de los microbios acondicionadores del suelo involucrados en los ciclos y la liberación de nutrientes (Chakravarty et al. 2018). El uso de fármacos como la oxitetraciclina para lograr controlar enfermedades bacterianas pueden tener un efecto adverso ocasionado por la resistencia de microorganismos patógenos. Consecuentemente se han buscado alternativas que ayuden a disminuir pérdidas en la producción, el riesgo para la salud humana e impacto en el medio ambiente (Zokaei Far et al. 2009). Una alternativa al uso de fármacos es la implementación de tecnologías de menor impacto ambiental a través del uso de probióticos. La administración de microorganismos para aumentar la resistencia a enfermedades y mejorar el estado nutricional de los camarones, es un método amigable y más seguro con el medio ambiente (Quiroz-Guzmán et al. 2018; Amir et al. 2019). Los probióticos se definen como microorganismos que normalmente tienen un efecto benéfico directo en el hospedero por la modificación en la comunidad microbiana en el entorno (Verschuere et al. 2000). La modificación de la comunidad microbiana se debe a la colonización del tracto gastrointestinal del huésped, adhiriéndose a la pared epitelial y proliferando en el intestino (Verschuere et al. 2000). Los microorganismos benéficos pueden mejorar la asimilación de alimentos y disminuir la mortalidad por enfermedades infecciosas, debido a que los 3 microorganismos benéficos inhiben el desarrollo de esos patógenos que afectan directamente la producción de camarón (Andani et al. 2012); (Talpur et al. 2012); y (Han et al. 2015), establecen que la manipulación de la microflora intestinal a través de la suplementación dietética de probióticos, también conocidos como “agentes bio-amigables”, es un enfoque novedoso para mejorar la salud intestinal, el rendimiento del crecimiento y el bienestar de los animales acuáticos de cultivo (Asaduzzaman et al. 2018). Los probióticos más comúnmente usados en la nutrición animal son las bacterias ácido-lácticas (BAL) como Lactobacillus acidophillus, L. casei, y L. plantaum (Venkat et al. 2004). Los efectos benéficos de los probióticos incluyen la pre digestión de factores anti nutricionales presentes en algunos ingredientes (Venkat et al. 2004). Las especies de Bacillus se han sugerido como una alternativa adecuada al uso de antibióticos en la acuicultura de camarones (Ziaei-Nejad et al. 2006); (Banerjee et al. 2010; Talpur et al. 2012). Los Bacillus puede producir proteasas y otras enzimas que apoyan la digestión del huésped (Talpur et al. 2012). Los alimentos acuícolas son el costo más alto en acuacultura, y representa un 30 al 70% de los costos totales (Sharawy et al. 2016). El aceite de pescado se ha utilizado como aporte de lípidos y la harina de pescado (HP) se ha utilizado como la principal fuente de proteína en la dieta para el camarón marino cultivado debido a su excelente digestibilidad, un excelente perfil de aminoácidos y ácidos grasos esenciales; sin embargo, es uno de los ingredientes más caros en los alimentos comerciales (Amaya et al. 2007). El aumento del costo de HP, la disminución de su disponibilidad, el suministro irregular y en algunos casos la mala calidad de esta ha puesto énfasis en su reemplazo parcial o completo con fuentes alternativas de proteínas (Ramachandran y Ray 2007). Las proteínas vegetales podrían ser la alternativa viable al reemplazo de la HP, ya que están ampliamente disponibles, provienen de fuentes renovables y tienen un precio razonable. Por lo tanto, existe un interés continuo en identificar y desarrollar ingredientes como alternativas al alto costo de alimentación de HP, para la industria mundial de la acuicultura y limitar el uso y dependencia de HP (Peres y Oliva-Teles 2005; Cheng et al. 2013; Goda et al. 2018; Sharawy et al. 2016). La harina de soya (HS) es uno de los subproductos alimenticios provenientes de plantas que se han investigado para reemplazar la HP, ya que se considera una fuente de proteínas prometedora debido a su suministro estable, precio y composición nutricional (Lemos et al. 2000; Sharawy et al. 2016). Las limitaciones asociadas con el uso de proteínas vegetales en la alimentación acuícola están bien documentadas, la principal es la presencia de factores anti nutricionales (FAN), como el fitato (inositol-1,2,3,4,5,6-hexakis fosfato), que es la principal forma de almacenamiento de fósforo (P) en las proteínas de origen vegetal (NRC 1993; Gemede y Ratta N 2014). En los últimos años se ha trabajado en el desarrollo de bioprocesos para la biorremediación y la desintoxicación biológica de residuos agroindustriales, como el proceso de fermentación en estado sólido para eliminar y reducir la saponina de la soya entera por medio del uso de Rhizopus oligosporus (Fenwick y Oakenfull 1983; EL-Haroun et al. 2006;Sharawy et al. 2016). Otros investigadores han experimentado con cafeína y taninos de las cascaras de café con Aspergillus sp. (EL-Haroun et al; Sharawy et al. 2016), el Bacillus spp. tiene la capacidad de desintoxicar componentes de alimentos potencialmente dañinos y produce muchas vitaminas esenciales en el grupo del complejo B (particularmente vitamina B12 y biotina), lo que resulta en una mayor utilización y digestibilidad de los componentes alimenticios (Fenwick y Oakenfull 1983). 4 Los microorganismos participan en la fermentación al secretar ciertas enzimas que requieren una temperatura óptima (Sugiharto y Ranjitkar 2019). El pH inicial del medio de fermentación debe estar optimizado dependiendo del sustrato, el microorganismo, el organismo de cultivo y la técnica de producción. La calidad de la fermentación depende de varias condiciones incluyendo temperatura, pH, naturaleza y composición del medio, O2 y CO2 disuelto, adición de precursores, la mezcla (ciclos a través de diferentes entornos) y la duración del proceso de fermentación (Dawood y Koshio 2019). Las fuentes de proteínas vegetales pueden tratarse con microorganismos apropiados para preservar sus nutrientes y finalmente incorporarse a los alimentos acuícolas, lo que reduciría los costos de alimentación y la contaminación ambiental debido a la reducción de la HP, fuente principal de proteína de los alimentos comerciales. En una investigación en 2019, se demostró que las comidas fermentadas muestran una mejor eficiencia de nutrientes y pudieron mejorar el valor nutricional de los alimentos acuícolas (Dawood y Koshio 2019). En la acuacultura, el salvado de arroz es ampliamente utilizado como un suplemento alimenticio, según estudios realizados por Ranjan A et al. (2018), afirman que la suplementación de salvado de arroz con enzimas puede mejorar significativamente el crecimiento de peces. Por otra parte, otros estudios como el de Supriyati et al. (2015), confirman que la fermentación de salvado de arroz con Bacillus amyloliquefaciens y sustancias húmicas incrementan el valor nutricional, reduciendo el contenido de fibra cruda, y aumentando el contenido de proteína cruda. En otro estudio Oliveira et al. (2011), la fermentación con Rhizopus oryzae produce un incremento en el contenido de fosfolípidos y ácidos grasos insaturados, mientras que, la grasa total y los ácidos grasos saturados disminuyen. En el cultivo de peces el uso de salvado de arroz se tradujo en excesivos niveles de amonio, debido al consumo lento de esta fuente de carbono según Dauda et al. (2017). Por lo anterior se ha sugerido que se puede lograr una mejor gestión de la calidad del agua (Anh et al. 2010), si se mejora la solubilidad del salvado de arroz mediante tratamientos previos con microorganismos, enzimas o fermentación (Ekasari et al. 2014; Dauda et al. 2017). El biomimetismo en el cultivo de camarón podría ser el camino para una producción sostenible. Según Benyus (2002), es una nueva ciencia revolucionaria que utiliza la comprensión científica de los sistemas biológicos para explotar las mejores ideas de la naturaleza con el fin de construir tecnologías que puedan ser utilizadas e inducir resultados positivos en la vida humana (Chakravarty et al. 2018). Según Benyus (2002), se pueden identificar nueve principios como diseños subyacentes de la naturaleza, la cual (i) funciona con la luz solar, (ii) usa solo la energía que necesita, (iii) ajusta la forma para funcionar, (iv) recicla todo, (v) recompensa la cooperación, (vi) apuesta por la diversidad, (vii) exige experiencia local, (viii) frena los excesos desde adentro y (ix) aprovecha el poder de los límites (Chakravarty et al. 2018). Según Dauda et al. (2017), el biomimetismo enfatiza las técnicas de remediación natural de los ecosistemas al promover el ciclo natural de los minerales y la producción de organismos vivos (Chakravarty et al. 2018). Más recientemente, con Bacillus spp. se ha informado de las actividades reveladoras de exoenzimas y que éstas mejoran el rendimiento de crecimiento del huésped, incluido el aumento de peso y la eficiencia alimenticia (Liu H et al. 2017). Las exoenzimas de Bacillus son muy eficientes para metabolizar una amplia variedad de carbohidratos, lípidos y proteínas, y la suplementación dietética de Bacillus puede mejorar las actividades de las enzimas digestivas (Han et al. 2015). Es ampliamente aceptado que el nivel de actividad de la enzima digestiva es un indicador comparativo útil de la tasa de utilización de alimento del huésped, la capacidad digestiva y el rendimiento del crecimiento (Suzer et al. 2008; Dawood y Koshio 2019). Saccharomyces cerevisiae 5 se encuentra entre los microorganismos conocidos y su eficacia depende de componentes funcionales como β-glucanos, ácidos nucleicos, manano oligosacáridos y quitina (Dawood et al. 2017). La levadura también produce diferentes metabolitos como enzimas, oligosacáridos, aminoácidos, péptidos, ácidos orgánicos, vitaminas y otros factores solubles (Dawood y Koshio 2019). La fermentación es la técnica de conversión biológica de sustratos complejos en compuestos simples por varios microorganismos como bacterias y hongos. Cuando comienza el proceso de esta descomposición metabólica, también se liberan varios compuestos adicionales aparte de los productos habituales de fermentación, como dióxido de carbono y alcohol. Estos compuestos adicionales se llaman metabolitos secundarios. Los metabolitos secundarios van desde varios antibióticos hasta péptidos, enzimas y factores de crecimiento (Balakrishnan K y Pandey A. 1996; Ahmed et al. 2019), se conocen también como "compuestos bioactivos" ya que poseen actividad biológica. Recientemente, investigadores han demostrado que varios de estos metabolitos secundarios son de uso industrial y económicamente importantes. Diversos microorganismos (levaduras y células de bacterias), pueden ser usados como fermentadores. Los microorganismos utilizados en los procesos de fermentación son de diferentes especies es por ello que producen varios productos por ejemplo el ácido láctico, etanol, o ácido acético, y cada organismo por separado puede responder diferente a cada sustrato (Dawood y Koshio 2019). La fermentación en estado sólido (FES) y la fermentación sumergida (FSM) son los dos métodos principales utilizados para la fermentación de materias primas (Subramaniyam y Vimala 2012). El método FES depende de la inclusión de granos, arroz, harina de soya, salvado de arroz y salvado de trigo sin líquido que fluya libremente para producir ingredientes secos fermentados que se pueden agregar a la formulación, ya sea como grano entero o en forma de polvo. Aspergillus spp., Rhizopus spp., y algunos Lactobacillus spp., son los principales microorganismos que pueden usarse en el método FES según Subramaniyam y Vimala (2012). Algunos estudios muestran que el método FES utilizando Lactobacillus acidophillus, S. cerevisiae y Bacillus subtilis, cuando se mezcla, aumenta el recuento de bacterias y la producción del ácido láctico y reduce las enterobacterias en el alimento fermentado (Hu et al. 2008). El método FSM, por otro lado, se basa en el crecimiento de microorganismos en un medio acuoso, siendo el método razonable que se puede usar para preparaciones de probióticos (Shim et al. 2010), mientras que, el método FES se usa para la producción de enzimas, ácidos orgánicos y bioplaguicidas (Dawood y Koshio 2019). Los factores anti nutricionales (FAN), son “sustancias que, por sí mismas o a través de sus productos metabólicos, los cuales se producen en los sistemas vivos, interfieren con la utilización del alimento y afectan la salud y la producción de los animales” (Francis et al. 2001). La mayoría de los FAN no conducen a la mortalidad, pero puede generar impactos fisiológicos negativos, como daño hepático, crecimiento reducido y condiciones de salud adversas. Sin embargo, la gravedad de cualquiera de estos aspectos depende de la cantidad de FAN ingeridos, la especie animal, su edad, tamaño y otras condiciones fisiológicas. Para resolver este problema (Hong et al. 2004; Dawood y Koshio 2019), sugieren que la fermentación por microorganismos puede aumentar la aceptabilidad de los animales acuáticos a las fuentes de proteínas vegetales fermentadas. La bioestimulación de la harina de soya (HS) puede aumentar el valor nutricional, la disponibilidad de nutrientes como péptidos más pequeños, calcio y vitamina A (Hong et al. 2004). El proceso de fermentación también puede reducir el nivel de contenido del inhibidor de tripsina (Hong et al. 2004; Dawood y Koshio 2019). El tipo de sustrato natural puede afectar el producto final de la 6 fermentación (Subramaniyam y Vimala 2012). Se pueden utilizar muchos subproductos del sector agrícola que no se aprovechan como el salvado de arroz y la HS (Dawood y Koshio 2019). Las harinas provenientes de soya y las semillas de colza y algodón se encuentran entre las principales fuentes de proteínas vegetales que se pueden usar debido a su disponibilidad, perfiles ricos en aminoácidos, precios bajos y naturaleza sostenible (Dawood y Koshio 2019). El objetivo del estudio fue determinar los efectos de la aplicación de materias primas bioestimuladas en la producción de camarón blanco del Pacífico (L. vannamei) en los suelos de lagunas de cultivo semi intensivo y algunas características nutricionales de los subproductos bioestimulados con microorganismos y enzimas. 7 2. MATERIALES Y MÉTODOS El estudio se desarrolló en la finca camaronera Biocultivos Marinos (Biomar) del Grupo Seajoy ubicada en la aldea El Faro, municipio de El Triunfo, departamento de Choluteca, Honduras. El experimento se realizó en nueve estanques que limitan al norte con la reserva de vida silvestre Los Delgaditos, al sur con El Cacao Nicaragua, al este con el Golfo de Fonseca y al oeste con la aldea El Triunfo. Para el abastecimiento de agua se utilizó el estero La Berbería, entre los meses de marzo a junio del año 2019. Se utilizaron nueve estanques de 1.82 ha cada uno con una dimensión aproximada de 100 m de ancho × 1 m de profundidad × 182 m de largo y un volumen aproximado de 18,200 m³. Cada uno de estos estanques se abasteció de agua salobre por medio de los canales provenientes del estero. Se incluyeron tres tratamientos: un control con suministro de una dieta 100% de alimento comercial balanceado, 100% alimento comercial balanceado + coctel de microorganismos y enzimas (probiótico) + salvado de arroz, y 71% alimento comercial balanceado + 29% harina de soya + coctel de microorganismos y enzimas. Muestreo de suelo. Se recolectó una muestra homogenizada de suelo a 15 cm de profundidad del fondo con un nucleador de PVC de 2 pulgadas en cada unidad experimental (Kristensen, M. J. y Frangi, J. L. 1995), cada muestra consistió en seis submuestras. Los muestreos se realizaron antes de la siembra y después de la cosecha en los estanques bajo la aplicación de los tratamientos en el ciclo. Se realizó un muestreo final para determinar el estado o condición del suelo de los estanques y conocer la relación en contenidos de materia orgánica, pH, nitrógeno total, fósforo extraíble, relación C:N y metales pesados (cobre, cadmio, hierro, zinc, arsénico, aluminio), las cuales fueron analizadas en el Laboratorio de Suelos de Zamorano. Recolección de muestras para conteo de fitoplancton. El muestreador alcanzó una profundidad de 80 cm conteniendo aguas de la superficie, parte media y del fondo del estanque permitiendo una distribución uniforme de las algas de la columna de agua. Las muestras se tomaron entre las 9 am y 12 del mediodía en las compuertas de la entrada y la salida del agua y de la parte central del estanque. Las muestras de agua fueron depositadas en un balde para homogenizarlas para luego determinar la composición de especies de fitoplancton y su abundancia. Las muestras se llevaron al laboratorio ubicado en la finca “Biomar” donde se colocaron en una probeta de 250 mL y se fijaron con una solución de Lugol. Se aplicaron seis a siete gotas de la solución, dependiendo de la turbidez de la muestra, y se dejaron reposar por 18 a 24 h antes de realizar el conteo con la cámara de Neubauer (Martínez y Herrera Sirias 2009). Se contaron los cuatro cuadrantes en forma de S, se sumaron las especies encontradas de cada uno de los grupos y se multiplicaron por 2,500 y el resultado se expresó como células/mL. La cámara de Neubauer contiene cuatro cuadrantes, y cada uno de estos cuenta con 16 cuadros menores de 250 µm. En esta cámara se contaron los organismos menores a 25 µm y bacterias filamentosas. Se sumaron todos los organismos que están dentro del área de cada cuadrante, empezando por el cuadro superior izquierdo siguiendo la trayectoria sigmoidea. Con relación a los organismos que 8 se encontraron en los límites de los cuadros sobre las líneas, se contaron directamente los que estaban en el lado derecho e inferior y no se tomaron en cuenta los que estaban sobre las líneas izquierda y superior. Parámetros químicos y microbiológicos del agua. El oxígeno disuelto se midió por la mañana y tarde durante todos los días del ensayo para asegurar las condiciones de cultivo. La medición de temperatura y oxígeno disuelto se realizó con un oxigenómetro Hanna HI 9146 (Hanna Instruments, RI, EE. UU.). La transparencia del agua se midió in situ diariamente con un disco Secchi. El pH, alcalinidad y salinidad se registraron semanalmente con su protocolo respectivo (Chávez Sánchez y Higuera Ciapara 2003; Rojas et al. 2005; Balouiri et al. 2016). El pH se midió con un potenciómetro pH Tester 10 (Thermo Scientific, MA, EE. UU.). La salinidad se midió en mg/L mediante un refractómetro Vee Gee STX-3 (Vee Gee Scientific, IL, EE. UU.) según protocolo y manual Merck. El amonio, nitratos, fosfatos y silicatos se midieron y registraron una vez por semana con un fotómetro Spectroquant® NOVA 60A ver (Manual Merck). Se utilizó la metodología sugerida por Rojas et al. (2005) cuyos protocolos se encuentran en su publicación de técnicas de muestreos. Se realizaron muestreos semanales del agua con medios diferenciales, los cuales permiten distinguir entre dos o más bacterias por características coloniales. En este caso se utilizó agar tiosulfato citrato bilis sacarosa (TCBS). Las muestras de agua fueron inoculadas por la técnica de esparcido en placa, utilizando diluciones de 100 mL e inoculando 0.1 mL en en placas con agar TCBS por duplicado. Se incubaron las placas a 35 °C, en una incubadora Modelo Ine 400 Memmert, cap. 53 L, EE. UU. por 24 h, y luego se contaron las colonias de Vibrio fermentadoras (amarillas) y no fermentadoras de sacarosa (verdes). Se calcularon y se reportaron como unidades formadoras de colonias (UFC)/mL. Microbiología en camarones. Se realizaron conteos de UFC en “fresco” en el camarón antes, durante y al finalizar el ciclo de cultivo en los viveros semi intensivos siguiendo la metodología de (Rojas et al. 2005; Balouiri et al. 2016). El TCBS agar es un medio selectivo para el aislamiento de Vibrio parahaemolyticus que pertenecen al género de bacterias Gram negativas que producen enfermedades en el cultivo de camarón (Kobayashi et al. 1963). Una muestra de la hemolinfa recogida (10 μL) se sembró en placas de Petri con agar TCBS bajo condiciones de esterilización. Las muestras de hepatopáncreas fueron maceradas en solución salina estéril (SSE) y en placas de agar TCBS con placas Petri en condición estéril. Las placas se incubaron a 30 °C durante 24 h hasta detectar la presencia de Vibrio spp. Las muestras del tracto digestivo se maceraron en solución salina estéril en una proporción 1: 1 (m:v) como lo indica (Rojas et al. 2005; Balouiri et al. 2016). Descripción de los organismos de siembra y productos comerciales. Se utilizaron post larvas (PL) de camarón blanco (Litopenaeus vannamei) de aproximadamente 20 días, provenientes del Laboratorio de Larvicultura del Pacífico S.A (Larvipac) ubicado en Amapala, Valle. La densidad de siembra fue de 60 a 65 PL/m2. La siembra del ciclo fue directa con un peso promedio de 150 mg y utilizando para la dieta alimento balanceado de 0.8 a 1.2 mm por partícula. Los productos comerciales utilizados en el estudio se describen a continuación. Allzyme SSF® es un complejo enzimático utilizado en alimentación de aves y porcinos. Su aplicación puede realizarse en post peletizado y alimentos funcionales como harinas. Se usa para aumentar la digestibilidad de los productos y subproductos de oleaginosas y cereales como soya, girasol, salvado de arroz; además reduce el costo de los alimentos sin pérdida de productividad. Este 9 complejo enzimático contiene carbonato de calcio y los extractos secos de la fermentación de Aspergillus niger, Trichoderma longibrachiatum y Bacillus subtilis. Actigen® es un producto bioactivo derivado de Saccharomyces cerevisiae que tiene la capacidad de funcionar como estimulador, modificador de la fermentación y el crecimiento microbiano. LactoSacc® es un complejo de bacterias lácticas, enzimas y levadura que mejora la salud y sobrevivencia, mejora el índice de conversión alimenticia (ICA) y el crecimiento. Alimentación automática y con harina de soya fermentada. Todas las unidades experimentales contaron con tres alimentadores automáticos Maof Madan (Masan Technologies, Israel), compuestos por un alimentador, con una capacidad de 180 a 200 kg de alimento para suministrarlo en los intervalos de tiempo programado, con un sistema giratorio con dos orificios que dispersan el alimento a un radio de 12 m; un temporizador, donde se programaron los intervalos de tiempo para que el sistema suministrara el alimento a determinadas horas del día; y una caja de elementos de control, donde se registra la información de alimentación que se proporciona por día y a la vez informa si el aparato está funcionando correctamente. Se sustituyó el 29% de la dieta de alimento comercial por soya bioestimulada (SBE). El alimento que se proporcionó a los juveniles fue Nicovita Terap de 0.8 mm de diámetro con 35% de proteína cruda. Se disminuyó el 30% de la ración diaria de alimento balanceado para un total de suplementación de 29.2%. Se utilizó el método tradicional de alimentación al voleo en los estanques seleccionados para distribuir la soya. Se proporcionaron 288 raciones de alimento balanceado en 24 h, haciendo uso de 60 a 140 libras de ración por día por alimentador en estanques de 1.82 ha, con una densidad de siembra aproximada de 2,600,000 a 2,900,000 camarones por estanque. 2.1 Variables productivas Densidad de cosecha. Variable medida al realizarse la cosecha final de la laguna, calculada mediante la ecuación 1. Densidad de Cosecha = animales sembrados / animales cosechados / Área (m2) [1] Porcentaje de sobrevivencia. Se determinó al finalizar cada ciclo, siendo esta la proporción de animales cosechados con el número de animales sembrados calculado mediante la ecuación 2. Sobrevivencia = (Animales cosechados / Animales sembrados) × 100 [2] Peso. Para determinar el peso se efectuó el muestreo en el momento de cosecha de los animales. Se pesó la totalidad de animales por estanque para obtener un peso promedio, en una balanza digital OhausTM ScoutTM Pro-modelo SPU601 (OHAUS Corporation, NJ, EE. UU.) con capacidad de 2,000 gramos. Calculado mediante la ecuación 3. 10 Peso = Σ Pn1 + Σ Pn2 + …. Σ Pnx / Número de animales cosechados [3] Donde Pn es el peso de 100 camarones. 2.2. Procedimientos de bioestimulación Salvado de arroz. Se utilizó agua del canal del manglar y se añadió hipoclorito de sodio, en una relación de 1 g/10 L de agua. Pasadas las 24 h, se oxigenó el agua durante media hora para expulsar las partículas remanentes de hipoclorito. La bioestimulación del salvado de arroz se realizó por medio de la fermentación aeróbica sumergida durante 24 h inoculada con un coctel de microorganismos con Saccharomyces cerevisiae y Lactobacillus acidophillus y enzimas. La dieta de probióticos + salvado de arroz (prebióticos) pasó por un proceso de bioestimulación de 24 h en el cual se utilizaron 15 kg/ha de salvado por semana, según el protocolo desarrollado por Kawahigashi (2019), promotor de sistemas simbióticos. La primera inoculación se aplicó cuatro días antes de la siembra dejando cerrados los estanques tratados con salvado de arroz. Posteriormente las aplicaciones se realizaron semanalmente en la misma proporción. El objetivo de la bioestimulación de salvado de arroz es regular los parámetros de calidad de agua y mejorar las sobrevivencias. Para calcular el fermento de salvado de arroz se multiplicó el área por la cantidad de salvado que se aplicó por hectárea, es decir 15 kg de salvado × 1.82 ha = 27.3 kg de salvado. Para saber la cantidad de agua a utilizar se multiplicó a razón de 1:10, lo que significa que por cada kg de salvado se agregaron 10 L de agua de estero tratada con 0.03 g/L de hipoclorito de sodio durante 24 h, es decir 27.3 kg de salvado × 10 L de agua = 273 L de fermento por cada 1.82 ha. Para calcular los ingredientes Actigen®, Allzyme® y LactoSacc®, se multiplicó la dosis recomendada y la cantidad de salvado en kg a utilizar por unidad de área. Bioestimulación. Los pasos para realizar la bioestimulación del salvado de arroz consistieron en filtrar y desinfectar 273 L de agua del vivero con 8.5 g de hipoclorito, mezclar muy bien el agua con el hipoclorito (diluido previamente), y dejar reposar por 24 h. Se Inició el proceso de aireación del agua con hipoclorito, mínimo 20 min antes de mezclar el salvado de arroz con los ingredientes (Actigen®, Allzyme®, y LactoSacc®). Se mezclaron 27.27 kg de salvado de arroz en 273 L de agua libre de hipoclorito para cada vivero, se adicionaron 81 g de LactoSacc®, 137g de Allzyme® y 218 g de Actigen®. Posteriormente, se monitoreó que el pH estuviese entre 6.0-6.5 y se reguló con bicarbonato de sodio cada dos horas. Harina de soya. El objetivo fue el reemplazo de 29% del alimento balanceado diario. El proceso de bioestimulación de harina de soya, inoculada con el mismo coctel de microorganismos y melaza, consistió en dos etapas de fermentación de 24 h cada una. En las primeras 24 h se proporcionó un medio rico en carbono para el crecimiento de las bacterias y posteriormente las bacterias en líquido se mezclaron con la harina de soya para pasar por un proceso de fermentación sólida que duró 24 h. Procedimiento de elaboración de agua madre. Previo a la preparación de la harina de soya y salvado de arroz, se determinó la ración diaria y semanal. A la 24 h antes de la mezcla de los ingredientes, se desinfectaron 900 L de agua del estero con 30 g de hipoclorito. Se mezclaron 40 g de soya en 8 L de agua salada desinfectada, luego se adicionaron 24 g de LactoSacc®, 24 g de 11 Allzyme®, 64 g de Actigen® y 400 mL de melaza. La mezcla fue sellada herméticamente durante 24 h. Procedimiento de fermentación de harina de soya en sólido. Se inició el proceso de aireación del agua con hipoclorito, con un tiempo mínimo de 20 min antes de mezclar la harina de soya con el agua madre. Luego se mezclaron uniformemente 8 L de agua madre con 8.18 kg de harina de soya, los cuales fueron fermentados durante 24 h en condiciones anaeróbicas. Curva de crecimiento de organismos. Se realizó la activación de los organismos comerciales y sus respectivas curvas de crecimiento en el medio de cultivo Tiosulfato sacarosa agar (TSA) (Kobayashi et al. 1963)desarrollado para determinar en el laboratorio la cantidad de UFC que se aplicarían en los fermentos utilizados. Se monitorearon durante 18 h las fermentaciones bacterianas aeróbicas utilizando salvado de arroz y anaeróbicas utilizando harina de soya. Los muestreos se realizaron cada dos h para proporcionar una curva del crecimiento de las bacterias utilizadas en la bioestimulación para luego evaluar el crecimiento de éstas. Para realizar dichas curvas de crecimiento se utilizó la metodología de vaciado en placa la cual nos da a conocer las UFC/mL de muestra. 2.3 Análisis de materias primas (salvado de arroz y harina de soya) Bioestimulación de salvado de arroz. Se utilizaron 100 g de salvado de arroz tamizado a 425 µm, 1,000 mL de agua desionizada, 1.0 g de Allzyme®, 20 g de bicarbonato de sodio, 1.6 g de Actigen® y 0.6 g de Lactosacc®. Se colocaron los ingredientes en un matraz Erlenmeyer dando aireación durante 24 h. Se secó el material bioestimulado en un horno a 55 °C durante 24 h y se utilizó el molino para homogenizar la muestra y luego analizar. Harina de soya fermentada (HSF). Se utilizaron 200 mL de agua desionizada, 1.0 g de Allzyme®, 10 mL de melaza, 1.6 g de Actigen® y 0.6 g de Lactosacc®. Se colocaron los ingredientes en un matraz Erlenmeyer durante 24 h en condiciones anaerobias. Luego se agregaron 200 g de harina de soya y se acondicionó un recipiente para que el material permaneciera en condiciones anaerobias por 24 h. De igual forma bajo el mismo tiempo el material fermentado se secó en el horno a 55 °C. Finalmente, se utilizó el molino para homogenizar la muestra y analizar. Existen varias alternativas para conocer el contenido de nutrientes de las materias primas. Una de las alternativas es la utilización de tecnologías emergentes, siendo la más utilizada para el análisis de composición química la espectroscopia en el infrarrojo cercano (NIRS, siglas en ingles). Ésta se basa en la quimio métrica, que relaciona la luz absorbida en una muestra con la composición química de la misma y con base en ello se desarrollan ecuaciones de predicción. Esta metodología ha sido aplicada en el análisis de productos, alimentos, químicos y en farmacéutica, entre otros (Asekova et al. 2016; Jiang y Lu 2018). La tecnología NIRS es empleada desde la década de los setenta como una técnica alternativa a los métodos tradicionales, con alto potencial para la obtención de resultados de la composición nutricional confiables y rápidos (Peguero Gutiérrez 2010). Permite determinar la composición nutricional a un bajo costo, en menor tiempo, además es una técnica no destructiva y para ello es necesario validar modelos que relacionan los datos espectrales obtenidos del equipo NIRS y la composición nutricional obtenidos por métodos tradicionales como el método proximal (Bagchi et al. 2016; Galasso et al. 2017). 12 Proteína cruda (PC). Se utilizó el método AOAC 2001.11 para determinar la cantidad de proteína cruda por medio de la técnica de Kjeldahl. Las muestras fueron digeridas con H2SO4, ácido que convierte el N en (NH4)2SO4. La muestra digerida se enfrió, se diluyó con agua y se neutralizó con NaOH al 40%, el cual transforma el N en un amoníaco ionizado, por último, la muestra se destiló y se tituló con ácido clorhídrico 0.1 N (Pandey 2001). Cenizas. Se midió el contenido de cenizas totales utilizando el método AOAC 923.03. Las cenizas representan el contenido en minerales totales en un alimento, las cuales suponen menos del 5% de la materia seca de los alimentos. Las cenizas se determinaron como el residuo que queda al quemar en un horno o mufla los componentes orgánicos a 550 °C durante ≤ 8 h (Pandey 2001). Materia Seca (MS). La materia seca se determinó como la diferencia del peso del alimento menos su contenido de humedad. La humedad se determinó utilizando el método AOAC 950.46B con un horno de convección a 105 °C. Fibra cruda (FC). El contenido de fibra cruda en las materias primas fue determinado con el método AOAC 962.09. Este método se basa en la digestión ácida y alcalina de la muestra obteniéndose el residuo de fibra cruda y sales. Estas últimas son incineradas para obtener la fibra cruda. Se tomaron 2 g de la muestra y se llevaron a ebullición, se le adicionaron 25 mL de hidróxido de sodio (0.556 N) durante 30 min, con recirculación constate de agua, se realizaron lavados con agua destilada caliente. Seguidamente se adicionaron 25 mL de ácido sulfúrico (0.6 N) y se dejaron en el extractor de fibra cruda durante 30 min. Pasado este tiempo, las muestras se colocaron en la mufla a 550 °C por aproximadamente tres h, la pérdida de peso debido a la incineración corresponde a la FC (Pandey 2001). Grasa cruda. Para este análisis se secaron las muestras y se realizó la extracción de grasa cruda utilizando el método AOAC 983.23. Brevemente, se pesaron 3 g de cada muestra y se mezclaron con 80 mL de metanol y 40 mL de cloroformo. Se realizaron diversos lavados con agua y múltiples adiciones de cloroformo y metanol para separar la porción lipídica en el cloroformo. Para lograr una mejor separación de las fases acuosa y lipídica se utilizó una solución acuosa de cloruro de potasio al 0.88%. Adicionalmente, las fases se separaron en un embudo separador; después de separar las dos fases, se evaporó el cloroformo y se pesó el contenido de grasa extraída. Fósforo. El análisis se realizó de acuerdo con el método A0AC 991.25. Se pesó 1 g de cada muestra en crisoles de porcelana y después se incineraron en una mufla a 550 °C durante 8 h. Las cenizas fueron solubilizadas en 50 mL de ácido nítrico 1 M. Previo al análisis se realizó una curva estándar y la concentración de fósforo se midió a 400 nm con un espectrofotómetro de UV visible Cary 8454 (Agilent Technologies, CA, EE. UU.). Hierro. El contenido de hierro se determinó mediante el método A0AC 985.35. Las mediciones se realizaron en un espectrofotómetro de absorción atómica iCE 3000 Series (Thermoscientific, MA, EE. UU.) provisto con una lámpara de hierro y llama aire-acetileno. La determinación se realizó a una longitud de onda igual a 248.3 nm. 2.4 Diseño Experimental. Se utilizó un diseño completamente al azar (DCA). Se utilizaron tres tratamientos con tres repeticiones, para un total de nueve unidades experimentales. Los datos se 13 analizaron utilizando el programa “Statistical Analysis System (SAS® versión 9.4)” con un nivel de probabilidad de P ≤0.05. La separación de medias se realizó con la prueba Duncan a una significancia de P ≤0.05 para las variables porcentaje de sobrevivencia, índice de conversión alimenticia (ICA), biomasa por hectárea. Para evaluar variables de calidad de agua se utilizó un análisis de varianza (ANDEVA) con medidas repetidas en el tiempo y diferenciación de medias Duncan (P ≤0.05). La evaluación de las variables materia orgánica, pH, nitrógeno total, fósforo extraíble y metales pesados (cobre, cadmio, hierro, zinc, arsénico y aluminio), en el suelo de las lagunas se realizó con ANDEVA, medidas repetidas en el tiempo y diferenciación de medias Duncan (P ≤0.05). Se realizó una prueba T para los contenidos de PC, EE, FC, Fe y P en el salvado de arroz y harina de soya antes y después de la bioestimulación. 14 3. RESULTADOS En esta sección se presentan los resultados de los parámetros fisicoquímicos que indican la idoneidad del medio y los productivos que indican el comportamiento relacionado con los tratamientos aplicados. En la sección de anexos se encuentra la información más detallada de los parámetros fisicoquímicos estudiados. Es importante mencionar que el recambio de agua durante este experimento fue limitado. 3.1 Parámetros Oxígeno. En el transcurso de la prueba de campo, el oxígeno disuelto (OD) se mantuvo dentro del rango óptimo para la cría de L. vannamei. Teniendo en cuenta que una concentración por debajo de 3 mg/L induce a estrés que puede causar una mayor susceptibilidad a las enfermedades y conducir a un crecimiento lento (Prapaiwong y Boyd 2012). El valor mínimo de OD fue de 4.7 mg/L, lo que indica que este cultivo mantuvo las condiciones necesarias de OD para el desarrollo de L. vannamei), el intervalo óptimo de oxígeno disuelto para el cultivo de camarón es variable, mayor a 5 mg/L (Lee y Wickins 1992); y entre 4 y 7 mg/L según otros estudios (Sonnenholzner S. 2014)). Temperatura. La temperatura del agua de cultivo se mantuvo entre los valores de 28 a 30 °C. Cuando el agua tiene diferentes temperaturas afecta a la densidad, viscosidad, solubilidad de los gases y en particular la del oxígeno, así como la velocidad de las reacciones químicas y bioquímicas de los estanques (Alpuche, J. Pereyra, A y Agundis 2005). Alcalinidad. Se registró una alcalinidad entre 104 y 107 mg/L. La alcalinidad en un estanque de cultivo de L. vannamei no debe bajar de 80 mg/L CaCO3 para lograr un óptimo crecimiento y buena supervivencia (Limsuwan C. 2005). Cuando el agua está con nivel bajo de alcalinidad, el pH varía mucho y estos cambios fuertes pueden causar estrés, bajo crecimiento, e incluso mortalidad en el camarón (Ching y Vargas Sylva J. 2007). Según conversaciones con (Kawahigashi 10 de junio de 2020), el nivel de dureza adecuado para el cultivo de camarón está entre 80 y 200 mg/L CaCO3, lo que coincide con observaciones de (Ching y Vargas Sylva J. 2007). Fosfato. El fosfato PO4 presentó valores promedios que oscilan entre 0.231 y 0.268 mg/L. El valor más alto se encontró en el grupo tratado con harina de soya (0.176 ±0.011 mg/L). Los promedios por semana no presentaron diferencias significativas entre los tratamientos. Los camarones tratados con 100% alimento balanceado y salvado de arroz presentaron valores similares de 0.153 ±0.005 y 0.156 ±0.005 mg/L, respectivamente. Generalmente el fosfato es el nutriente limitante para la productividad primaria en los estanques acuícolas. Los suelos del fondo 15 del estanque absorben fuertemente el fósforo y debido a su insolubilidad, el fósforo fijado en el suelo tiene poca disponibilidad para el fitoplancton. Amonio (NH4). En este ensayo el amonio se mantuvo dentro del rango adecuado para el cultivo de camarón, concordando con los reportado por Fast y Lester (1992) y Fox et al. (2006). Durante los 63 días de período experimental las mediciones de parámetros fisicoquímicos y la adición de los tratamientos demuestran que no hay cambios significativos en los rangos de amonio entre los tratamientos. Se reportaron valores de nitrógeno amoniacal dese 0.249 a 0.308 mg/L en el ciclo experimental. Si la concentración de amonio es mayor de 0.1 mg/L, podría constituirse como un indicador de contaminación por aguas residuales (Boone Kauffman et al. 2017), domésticas o industriales. (Frías Espericueta M. G. y Páez Osuna 2001) observaron que el exceso de nitrógeno con respecto a la capacidad de asimilación de los estanques de cultivo provoca un deterioro de la calidad del agua, por la gran acumulación de amonio, nitritos y nitratos, los cuales son tóxicos para la biota. Nitrato (NO2). Se presentaron niveles altos de nitrato en todos los tratamientos durante todas las semanas de cultivo. El nitrato con valores entre 1.38 y 1.54 mg/L, sobrepasó los niveles recomendados, marcando una leve tendencia a ser menor (1.38 mg/L) en el grupo de lagunas tratadas con bioestimulación de salvado de arroz, sin embargo, no reflejaron diferencias significativas entre los tratamientos durante nueve semanas de cultivo. Hay que destacar que el nitrato sólo es detectado cuando se manifiesta un problema de salud en organismos de cultivo. Niveles de nitrato entre 0.4 y 0.8 mg/L, son generalmente seguros para los camarones, mientras que, cualquier valor superior a 0.8 mg/L puede ser tóxico (Fox et al. 2006). Por otra parte, Lakshmanan y Soundarapandian (2008), investigaron el efecto de los probióticos comerciales (Bacillus spp.), en el cultivo de camarones P. monodon y observaron que los probióticos podrían reducir significativamente las concentraciones de nitrito y amoníaco en el agua del estanque en comparación con el control; en el presente estudio, no hubo diferencias significativas en amonio entre los tratamientos. Salinidad. La salinidad promedio fue de 39.1 ±0.10 (mg/L), registros mayores a los encontrados en otras fuentes. La salinidad está determinada principalmente por sólidos disueltos, como fosfatos, bicarbonatos, sulfatos, nitratos y otros (Guerrero Olazarán et al. 2004)). Los niveles óptimos de salinidad para el camarón están entre 5 y 25 mg/L (Hirono 1983) y 15 y 30 mg/L (Lee y Wickins 1992). pH. El potencial de hidrógeno (pH) es un indicador de que el agua se encuentre ácida o básica en su reacción. Mientras que el pH es un indicador de la concentración del ion hidrógeno en el agua (H+), la acidez representa la capacidad de neutralizar bases fuertes y la alcalinidad de neutralizar ácidos fuertes (Hernández Gurrola 2016). Para el pH, las mediciones indicaron valores entre 8.2 y 8.3, lo que indica que no se encontraron cambios que generasen diferencias significativas entre los tratamientos a pesar de que se aplicaron cantidades considerables en los tratamientos control y soya. El intervalo óptimo de pH para L. vannamei es variable y va de 6 a 9 (Guerrero Olazarán et al. 2004), de 7 a 8 (Hirono 1983), y de 7.8 a 8.3 (Lee y Wickins 1992). 16 3.2 Conteo bacteriano Conteo bacteriano en salvado de arroz. La concentración de bacterias en el producto final estuvo entre 4.60 × 108 y 9.1 × 1016 UFC/mL. En la Fig. 1 se puede observar el crecimiento de las colonias bacterianas a través del tiempo de muestreo antes de ser agregadas a las lagunas experimentales. El producto fue suministrado dos veces por semana a razón de 10 L de agua marina/kg de salvado de arroz, y la dosis de salvado de arroz fue de 15 kg/ha. Figura 1. Crecimiento bacteriano de la bioestimulación aeróbica de salvado de arroz según la metodología de vaciado en placa (crecimiento máximo en 18 h de bio estimulación). Conteo bacteriano en harina de soya. La cantidad de unidades formadoras de colonias (UFC)/mL de los cocteles de bacterias introducidos a las lagunas de semi intensivo fue de 9.18 UFC/mL en salvado de arroz y 1.46 UFC/mL en HSF. Figura 2. Crecimiento bacteriano de la fermentación anaeróbica de HSF con la metodología de vaciado en placa (crecimiento máximo en 18 h de bio estimulación). 3.3 Parámetros productivos Sobrevivencia. Se registraron valores entre 55.1 y 60.5%, pero no se presentó diferencias entre los tratamientos. El peso promedio por semana de los camarones tratados no fue diferente para los tratamientos de la semana 1 a la -8, lo que concuerda con estudios de Vieira et al. (2016), que suplementó el probiótico Lactobacillus plantarum y no encontró diferencias entre los pesos a los 30 y 60 días. 4.60E+08 5.10E+08 1.50E+10 2.80E+10 8.80E+10 7.40E+12 6.30E+14 1.10E+16 1.80E+16 9.10E+16 -5.00E+16 0.00E+00 5.00E+16 1.00E+17 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 u fc /m L Horas 2.50E+04 3.60E+04 2.20E+05 3.50E+05 1.40E+05 4.30E+05 4.00E+05 4.00E+05 1.40E+06 2.70E+08 0.00E+00 5.00E+07 1.00E+08 1.50E+08 2.00E+08 2.50E+08 3.00E+08 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 UFC/ml 17 Ganancia de peso. En este estudio, no se encontraron diferencias para la ganancia de peso semanal similar a la información de Vieira et al. (2016), quienes afirman que no hay diferencia en la ganancia de peso con el uso de dietas suplementadas con probióticos en camarón blanco del pacífico. Crecimiento acumulado. Solo en la semana 9 se presentaron diferencias en crecimiento (p= 0.028), siendo menor con el tratamiento con harina de soya con relación al control absoluto y el tratamiento de salvado de arroz bioestimulado (Cuadro 1). Cuadro 1. Efecto de los tratamientos de alimentación en el incremento de peso acumulado del camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei) en estadio de engorde durante nueve semanas de cultivo. Semana de Cultivo Tratamiento Crecimiento de camarón acumulado (g) Valor P R2 CV (%) 1 AC 100%, 0.256 ±0.054 a 0.426 0.458 36.178 AC 100% + 15 kg/ha SA 0.166 ±0.076 a AC 71% + HSF (29%) 0.222 ±0.041 a 2 AC 100%, 0.557 ±0.062 a 0.227 0.591 15.933 AC 100% + 15 kg/ha SA 0.648 ±0.079 a AC 71% + HSF (29%) 0.737 ±0.096 a 3 AC 100%, 1.148 ±0.046 a 0.193 0.835 9.001 AC 100% + 15 kg/ha SA 1.116 ±0.156 a AC 71% +HSF (29%) 1.323 ±0.228 a 4 AC 100%, 2.280 ±0.093 a 0.324 0.577 11.481 AC 100% + 15 kg/ha SA 2.163 ±0.170 a AC 71% +HSF (29%) 2.543 ±0.336 a 5 AC 100%, 3.839 ±0.418 a 0.923 0.257 13.852 AC 100% + 15 kg/ha SA 4.012 ±0.095 a AC 71% +HSF (29%) 3.974 ±0.584 a 6 AC 100%, 5.685 ±0.323 a 0.502 0.523 12.18 AC 100% + 15 kg/ha SA 5.945 ±0.419 a AC 71% +HSF (29%) 5.246 ±0.875 a 7 AC 100%, 7.268 ±0.573 a 0.501 0.541 12.68 AC 100% + 15 kg/ha SA 7.278 ±0.177 a AC 71% +HSF (29%) 6.473 ±1.226 a 8 AC 100%, 8.887 ±0.702 a 0.286 0.552 11.198 AC 100% + 15 kg/ha SA 8.806 ±0.156 a AC 71% +HSF (29%) 7.811 ±1.210 a 9 AC 100%, 12.33. ±0.579a 0.028 0.647 9.905 AC 100% + 15 kg/ha SA 10.272 ±0.278a AC 71% +HSF (29%) 9.585 ±1.724b a,b Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas (P ≤0.05). AC: alimento comercial; SA: salvado de arroz; HSF: harina de soya fermentada 18 Lo anterior podría ser indicador que sustituir el 29% de la dieta normal por alimentos como la HSF puede ser una opción para disminuir la cantidad de alimento balanceado y harina de pescado por ha de camarón cultivado bajo estas condiciones. Por otra parte, el grupo de camarones que fue tratado con bioestimulación de salvado de arroz, en cuanto al peso semanal acumulado y ganancia de peso semanal se comportó muy similar al control absoluto. Densidad de cosecha. No se presentó diferencia significativa en la densidad de cosecha. Se cosecharon 27, 32 y 27 animales por metro cuadrado con los tratamientos AC 100%, AC 100% +15 kg/ha SA y AC 71% + HSF (29%), respectivamente. Peso final. Se cosecharon animales entre 16 y 17 gramos. No hubo diferencias en los pesos finales de camarones tratados con alimento balanceado (100%); HSF 29% + 71% alimento balanceado y bioestimulación de 15 kg/ha de salvado de arroz + 100% alimento balanceado. Índice de conversión alimenticia. No se presentaron diferencias entre los tratamientos en los parámetros de densidad de cosecha, ICA, camarón entero y colas de camarón en la etapa de cosecha después de un estadio de engorde de nueves semanas (Cuadro 2). Cuadro 2. Efecto de los tratamientos de alimentación en la densidad de cosecha por m2, índice de conversión alimenticia, productividad de camarón entero y de colas en el cultivo de camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei) en estadio de engorde durante nueve semanas de cultivo. Tratamiento Densidad de cosecha (camarones/m2) Índice conversión alimento Camarón entero (t/ha) Colas de camarón (t/ha) AC 100% 27.6 ±1.77 1.52 ±0.058 4.96 ±0.386 3.25 ±0.266 AC 100% + 15 kg/ha SA 32.3 ±5.82 1.58 ±0.116 5.36 ±0.570 3.50 ±0.365 AC 71% + HSF (29%) 27.3 ±7.01 1.34 ±0.115 4.64 ±0.785 3.05 ±0.505 Valor P 0.5908 0.1024 0.5120 0.5173 R2 0.272 0.711 0.350 0.355 CV (%) 21.80 7.15 13.83 13.67 AC: alimento comercial; SA: salvado de arroz; HSF: harina de soya fermentada. Estos resultados se mantuvieron dentro de los rangos adecuados para el cultivo de camarones según su tiempo de cultivo, bajo las mismas condiciones, además, no se demostraron cambios que generen diferencias (P >0.05) entre los tratamientos. 3.4 Insumos. El grupo de camarones evaluados con el tratamiento de salvado de arroz mostró una disminución significativa en el uso de hidróxido de calcio Ca(OH)₂ y óxido de silicio (SiO2) con respecto a los tratamientos control y a la fermentación sólida de la harina de soya. Uso de insumos. El uso de SiO2 en los diferentes tratamientos osciló entre 0.06 a 0.213 t/ha, la evaluación de esta variable refleja diferencias significativas entre los tratamientos bajo las mismas condiciones de cultivo. Los camarones tratados con salvado de arroz utilizaron menor cantidad de 19 SiO2/ha, lo que indica que el uso de la bioestimulación de salvado de arroz reduce el uso de este fertilizante obteniendo los mismos resultados en el crecimiento de diatomeas. Ver (cuadro 3). Cuadro 3. Diferencias en los insumos de los tratamientos de alimentación en la cantidad de insumos generales por tratamiento y por hectárea en un ciclo de nueve semanas de cultivo de de camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei) en estadio de engorde. Tratamiento SiO2 Ca(OH)₂ (t/ha) Alimento balanceado (t/ha) (t/ha) AC 100% 0.21 ±0.02a 2.73 ±0.26a 7.53 ±0.42a AC 100% + 15 kg/ha SA 0.06 ±0.11a 0.78 ±0.69b 8.47 ±1.52a AC 71% + HSF (29%) 0.20 ±0.001a 3.06 ±0.32a 6.26 ±1.62a Valor P 0.079 0.037 0.303 R2 0.773 0.811 0.4856 CV (%) 38.49 27.059 20.294 a, b Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas (P ≤0.05). AC: alimento comercial; SA: salvado de arroz; HSF: harina de soya fermentada. Costo de insumos. El costo de Ca(OH)₂ osciló entre 115 y 458 US$/ha entre todos los tratamientos. El tratamiento de salvado de arroz mostró menor uso y costo de Ca(OH)₂, este estudio se encontró, diferencias significativas (P ≤0.05), en relación al costo de Ca(OH)₂ utilizado entre los tratamientos. Los camarones tratados con HSF recibieron en promedio 9,186 kg Ca(OH)₂/ha; al tratamiento control en este caso se le aplicó un total de 8,206 kg Ca(OH)₂ /ha. Sin embargo, el grupo de camarones que fue tratado con bioestimulación de salvado de arroz se aplicó un total de 2,361 kg Ca(OH)₂ /ha, lo cual implica una disminución promedio de 72.84% en el uso de kg Ca(OH)₂ /ha. En el cuadro 4, se observan los costos de insumos como el óxido de silicio e hidróxido de calcio y alimento balanceado por tratamiento y por hectárea que se utilizó en este ensayo. Cuadro 4. Efecto de los tratamientos de alimentación en los costos de los insumos generales por tratamiento en un ciclo de nueve semanas de cultivo de camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei) en estadio de engorde. Tratamiento SiO2 Ca(OH)₂ ($/ha) ($/ha) AC 100% 176 ± 17a 412 ± 38a AC 100% + 15 kg/ha SA 57 ± 98a 115 ± 101b AC 71% +HSF (29%) 170 ± 1.41a 458 ± 46a Valor P 0.088 0.0129 R2 0.75 0.88 CV (%) 39.77 24.88 a, b Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas (P ≤0.05). La tasa de cambio de moneda se calculó a 24.53 lempiras por cada 1 dólar. SiO2 = Fertilizante óxido de silicio (promotor de diatomeas). Ca(OH)₂= Enmienda hidróxido de calcio (cal hidratada) para desinfección de suelos de los estanques. AC: alimento comercial; SA: salvado de arroz; HSF: harina de soya fermentada. 20 El alimento representa un 60% del costo de producción total y con buenas prácticas y manejo se puede obtener entre el 1.5 y 2 en el valor ICA, estando además la supervivencia sobre el 50% para considerarlo aceptable, sin embargo, entre mayor sea el porcentaje de supervivencia se generará mayor rentabilidad. El crecimiento o ganancia de peso puede mantenerse entre 1.2 y 1.5 gramos por semana para estar dentro de los parámetros considerables (Lara-Espinoza et al. 2015). Lo antes mencionado tiene relación directa con mantener la productividad por área y disminuir las emisiones y los impactos al medio ambiente. El Ca(OH)₂ es uno de los insumos utilizados en la producción de camarón blanco del Pacífico en Honduras. El pH elevado resultante de la reacción de la cal con el agua es la razón por la que este material a menudo se recomienda como un desinfectante del suelo o agua de estanques. La cal puede aplicarse también a los fondos de los estanques entre cultivos con el fin de aumentar el pH y eliminar los organismos no deseados, incluidos los vectores de enfermedad ver aplicación de cal en lagunas de tierra en la Figura 3. Los estudios han demostrado que se deben aplicar de 3,000 a 5,000 kg/ha de cal hidratada (2,300 a 3,800 kg/ha de cal quemada) al suelo para aumentar el pH por encima de 11 durante al menos 12 h. En el cuadro 5 se puede observar la cantidad aproximada de emisiones CO2eq/ha relacionadas con el uso de Ca(OH)₂ en este experimento de campo. Cuadro 5. Efecto de los tratamientos de alimentación en el uso de hidróxido de calcio y sus emisiones (t CO2/ha) en un ciclo de engorde de nueve semanas de cultivo de camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei) en lagunas semi intensivas. Tratamiento Factor de emisión CO2eq (t/ha) Ca(OH)₂ (t/ha) AC 100% 2.73 ±0.26a 0.59 1.61 ±0.15a AC 71% + HSF (29%) 3.06 ±0.32a 1.80 ±0.18a AC 100% + 15 kg/ha SA 1.12 ±0.84a 0.66 ±0.40b a, b Letras diferentes en la misma columna es indicador de diferencias significativas (P ≤0.05). AC: alimento comercial; SA: salvado de arroz; HSF: harina de soya fermentada. El pH del suelo cae rápidamente después de su aplicación, ya que el ion hidróxido de la aplicación de cal reacciona con el dióxido de carbono. Además, en suelos ácidos, el pH disminuye a medida que la cal reacciona con la acidez del suelo. Esto aumenta el pH del suelo, pero hace que el pH alto inicial resultante del ion hidroxilo caiga rápidamente a un nivel demasiado bajo para eliminar los organismos no deseados. Los productores rara vez usan más de 500-1.000 kg/ha, y la mayoría de los tratamientos de cal para desinfectar los fondos del estanque son ineficaces. 21 Figura 3. Aplicación de Ca(OH)₂ en lagunas de cultivo de camarón en Choluteca, Honduras (finca Biomar Grupo Seajoy 2020). Las cantidades de alimento balanceado comercial kg/ha y el cálculo de harina de pescado (HP) se puede observar en el cuadro 6. Cuadro 6. Efecto de los tratamientos de alimentación en el costo de producción por hectárea (US$/(ha) en el cultivo de camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei) en estadio de engorde en nueve semanas de cultivo. Tratamientos Costos de Producción (US$/ha) AC 100% 22,901 ±1,778 AC 100% + 15 kg/ha SA 24,734 ±2,636 AC 71% +HSF (29%) 21,462 ±3,617 AC: alimento comercial; SA: salvado de arroz; HSF: harina de soya fermentada La HP un polvo molido grueso hecho de la carne de pescado cocida Miles y Chapman (2006). Ciertas especies de pescado azul, como menhaden (Brevoortia y Ethmidium), anchoa (Engraulidae), arenque (Clupeidae) y sardina (Sardinae) son la principal fuente de HP y su producto complementario, el aceite de pescado. El uso de harina de pescado (HP) en el ciclo de producción de nueve semanas en el engorde de camarón blanco del pacífico alcanzó un rango de 824 a 1,160 kg HP/ha aproximadamente. El uso de HP se calculó con el 25% de contenido de alimento balanceado como harina de pescado (HP) Existen diferencias significativas (P ≤0.05), en la cantidad de HP utilizada por ha de camarón producido siendo menores las cantidades encontradas en el tratamiento en dónde se reemplazó 29% de alimento comercial por harina de soya fermentada. En el cuadro 6 se muestran los costos de producción por hectárea en el experimento 22 La tasa de cambio de moneda se calculó a 24.53 lempiras por cada 1.0 dólar. Este costo de producción es la suma de costos de larvas, alimentos, óxido de silicio, hidróxido de calcio probióticos, prebióticos. En resumen, el resultado del uso de HSF en sustitución de alimento balanceado en el cultivo de camarón L. vannamei fue el crecimiento desacelerado de los grupos tratados con HSF que se reflejó en la semana ocho de cultivo en dónde hay diferencias significativas comparando con el control (100% alimento balanceado), la sustitución parcial de 29% del total de la ración dio como resultado 2.77% más de mortalidades con respecto al tratamiento control (100% alimento balanceado). Al observar los registros en términos de uso de harina de pescado los datos reflejan que se podría disminuir el uso de harina de pescado en un 23.9% lo que equivale aproximadamente a 259 kg HP/ha. En promedio se utilizaron 5.6 ha por tratamiento y se reemplazó e 29% de la dieta usual por soya HSF en el cultivo de camarón blanco del pacífico en estadio de engorde lo que equivale a 2,147 kg de soya HSF/ha distribuido en nueve semanas de engorde. Por otra parte, el promedio de volumen de aplicación de la bioestimulación con salvado de arroz fue de 253 kg/ha distribuido en nueve semanas de cultivo con un aproximado de 15.3 kg/ha por semana. Por lo tanto, y desde un punto de vista económico, las dietas que contienen HSF, son una buena fuente de proteínas en la dieta para la alimentación de postlarvas de camarón L. vannamei y pueden reemplazar hasta un 29% de dietas que contienen aproximadamente 25% de HP y aceite de pescado, lo que podría considerarse más económico en comparación con la dieta que contiene un alto contenido de proteínas. 3.5 Conteo de plancton y zooplancton. Según Martínez y Herrera Sirias (2009), estos organismos fotoautótrofos, constituyen un elemento alimenticio valioso para sostener el crecimiento del zooplancton y demás eslabones de la cadena alimenticia incluyendo a los camarones, principalmente en los sistemas extensivos y semi-intensivos. Sin embargo, en estanques donde se utiliza alimento complementario (modalidad semi-intensiva e intensiva) para incrementar la producción del organismo bajo cultivo, el fitoplancton es menos importante, pero su abundancia se incrementa en respuesta al incremento en la concentración de nutrientes producto de la alimentación suministrada. Por lo tanto, el grupo de organismos del fitoplancton que se encuentra en los estanques es heterogéneo y comprende principalmente miembros de las siguientes divisiones: Chrysophyta (diatomeas), Pyrrophyta (dinoflagelados), Cyanophyta (algas verde - azules), Chlorophyta (algas verdes) y Euglenophyta. En el transcurso del ensayo, los conteos de cianofitas, clorofitas, diatomeas, dinoflagelados y zooplancton (células/mL) no mostraron diferencias (P >0.05). 3.6 Conteo de Vibrio en agua. El conteo de UFC Vibrio para este estudio demostró que para el conteo bacteriológico en medio agar TCBS en el agua de cultivo de camarón durante los 63 días del período experimental, no hay diferencias significativas entre los tratamientos. Se puede observar que no existe tendencia de crecimiento por semana y por tratamiento durante el período del ensayo experimental. Sin embargo, las cantidades de UFC que se contabilizaron durante el experimento tienen similitud y concuerdan con los datos presentados por Vieira et al. (2016). Los recuentos bacterianos de Vibrio spp. en el agua de cultivo no varió entre tratamientos o 23 recolección períodos (P ≥0.05) y también fueron similares a los valores observados por Sung et al. (2001), en una granja de P. monodon. 3.7 Conteo de Vibrio en camarón. En el tracto digestivo de camarones tratados con salvado de arroz y HSF en comparación con los controles no se encontró diferencia (P >0.05) en el recuento bacteriano total del tracto digestivo de los camarones tratados y de control, en los períodos de recolección lo que concuerda con la información registrada por Vieira et al. (2016) en condiciones de laboratorio. En este estudio no se encontraron diferencias estadísticas entre los tratamientos estudiados para los conteos de Vibrio tanto en agua como en hepatopáncreas lo que difiere con estudios realizados por Carolina K. et al. (2018). 3.8 Análisis de suelo. En el análisis de suelo se han podido detallar algunas características que pueden ayudar a la toma de decisiones para aplicación de enmiendas y solucionar problemas de acumulación de elementos por su uso excesivo. La calidad del suelo del fondo ha sido reconocida durante mucho tiempo como un factor que influye en la calidad del agua y la producción de animales acuáticos en los estanques (Neess 1949; Boyd 1992; Banerjee et al. 2010), pero se han realizado relativamente pocas investigaciones sobre el papel de los suelos de estanques en la acuicultura. A menudo cuando los administradores de los estanques de producción de camarón reportan bajos niveles de sobrevivencia y no pueden justificarlos, sospechan que la causa podría asociarse con las condiciones de suelo. Dentro de los elementos que presentaron mayor variabilidad en el presente estudio, se destaca la alta cantidad de hierro ver el cuadro 7. Siendo estas diferencias marcadas, estos rangos no afectan la calidad del fondo de los estanques, según Ambasari y Harahap (2017). Cabe mencionar que, pese a los resultados obtenidos, el mismo será apto para su uso posterior en el siguiente ciclo productivo. El contenido final de hierro en los suelos en este ensayo fue diferente al contenido inicial de los mismos. El contenido de hierro aumentó significativamente (P <0.05), en las muestras que se tomaron después de un ciclo completo de engorda de juveniles que duró 63 días aproximadamente hasta llegar a un peso de 15 a 17 gramos por camarón. Cuadro 7. Análisis de hierro, zinc y cobre en suelos antes y después de un ciclo experimental de nueve semanas de engorde de camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei) con tratamientos de alimentación de camarón del Pacífico en lagunas semi intensivas Tratamientos Hierro Zinc Cobre Antes Después Antes Después Antes Después AC 100%, 827 ±11.2a 1180 ±147b 6.87 ±0.83 a 9.18 ±1.73 a 9.09 ±0.34 a 10.19 ±1.00 a AC 100% + 15 kg/ha SA 968 ±136a 1086 ±142b 6.90 ±0.34 a 7.58 ±0.90 a 9.40 ±0.88 a 10.93 ±1.19 a AC 71% + HSF (29%) 859 ±156a 1078 ±69.4b 6.97 ±3.55 a 8.43 ±1.10 a 10.09 ±2.21 a 9.88 ±1.82 a Valor P 0.0017 0.0971 0.2387 R2 0.61 0.275 0.2125 CV (%) 12.19 22.89 13.96 a, b Letras diferentes en la misma columna es indicador de diferencias significativas (P ≤0.05). AC: alimento comercial; SA: salvado de arroz; HSF: harina de soya fermentada 24 A continuación, en el cuadro 8 se puede ver la cantidad de pH, materia y carbono orgánicos, antes y después del ciclo experimental. Cuadro 8. Análisis de potencial de hidrógeno, materia orgánica, carbono orgánico en suelos antes y después de un ciclo experimental de engorde de camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei) con tratamientos de alimentación de camarón del Pacifico en lagunas semi intensivo. Tratamientos pH Materia orgánica Carbono orgánico Antes Después Antes Después Antes Después AC 100%, 8.15 ±0.14 a 8.06 ±0.12 a 1.34 ±0.23 a 1.44 ±0.40 a 0.78 ±0.13 a 0.84 ±0.22 a AC 100% + 15 kg/ha SA 8.26 ±0.07 a 8.09 ±0.14 a 1.41 ±0.17 a 1.11 ±0.17 a 0.81 ±0.10 a 0.64 ±0.09 a AC 71% + HSF (29%) 8.10 ±0.19 a 8.13 ±0.15 a 1.33 ±0.27 a 1.27 ±0.20 a 0.77 ±0.15 a 0.73 ±0.11 a P época 0.5087 0.5748 0.4331 R2 0.23 0.3 0.21 CV (%) 1.8 38.08 19.21 a, b Letras diferentes en la misma columna es indicador de diferencias significativas (P ≤0.05). AC: alimento comercial; SA: salvado de arroz; HSF: harina de soya fermentada En este estudio se encontraron diferencias significativas en la variable Nitrógeno (N) antes del ciclo experimental, cuando se comparó con Nitrógeno (N) después del ciclo experimental ver el cuadro 9. Se sabe que el modo de acción de los inóculos bacterianos es la mejora de procesos naturales como la materia orgánica, degradación, nitrificación, eliminación de amoníaco, desnitrificación, oxidación de sulfuro y degradación de contaminantes tóxicos entonces se puede observar la disminución en los contenidos de nitrógeno de los suelos luego que son utilizados para el ciclo de cultivo. Cuadro 9. Análisis de nitrógeno, relación carbono nitrógeno y fósforo en suelos antes y después de un ciclo experimental de engorde de camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei) con tratamientos de alimentación de camarón del Pacífico en lagunas semi intensivo. Tratamientos Nitrógeno C: N Fósforo Antes Después Antes Después Antes Después AC 100% 0.06 ±0.01 a 0.04 ±0.02 b 12.04 ±0.55 a 23.44 ±9.35 b 425 ±7.37 a 526 ±99.4 a AC 100% + 15 kg/ha SA 0.06 ±0.01 a 0.01 ±0.00 b 12.99 ±3.09 a 33.16 ±5.27 b 407 ±111 a 358 ±13.3 a AC 71% + HSF (29%) 0.06 ±0.01 a 0.02 ±0.01 b 12.24 ±1.93 a 53.30 ±39.27 b 393 ±235 a 422 ±42.9 a Valor P 0.0001 0.0096 0.6229 R2 0.75 0.546 0.23 CV (%) 30.72 68.04 27.3 a, b Letras diferentes en la misma columna es indicador de diferencias significativas (P ≤0.05). AC: alimento comercial; SA: salvado de arroz; HSF: harina de soya fermentada 25 Los análisis de suelo de lagunas de semi intensivos, muestran que no hay diferencias significativas entre los tratamientos en las muestras de suelo extraídas antes y después del ciclo de engorde de camarón, en elementos como CO, MO, Cu, As Zn CN y pH, sin embargo, hay diferencias significativas en las muestras que fueron extraídas después del ciclo de engorde en los elementos hierro y nitrógeno analizados, mostrando aumento o mayor cantidad de éstos elementos en los suelos de lagunas después de un ciclo de engorde. 3.9 Análisis proximal Considerando su calidad, costo y disponibilidad el uso de subproductos del sector agrícola es fuente importante en la elaboración de dietas y suplementos alimenticios alrededor del mundo. La pasta o harina de soya se ha establecido por sí misma como un ingrediente clave en los alimentos para acuacultura (Allan et al. 2000). En este estudio se encontró que la harina de soya descascarada y extraída con solventes contenía alrededor de 45.58% de proteína cruda. La digestibilidad de la harina de soya puede ser hasta de 89.9%; algunos autores comparan la digestibilidad de la proteína de harina de soya con la digestibilidad de la proteína de harina de pescado entero (Lovell 1998). Con respecto a la harina de soya utilizada en los experimentos, se encontró que el contenido de proteína oscilaba entre 44-46%. Asimismo, se registró un aumento en la fibra cruda de HSF, comparado con harina de soya sin fermentar (HSSF). Como se puede ver en el cuadro 10, la fermentación en estado sólido de la harina de soya no afectó el contenido de proteína cruda, grasa y fibra cruda (P >0.05). Cuadro 10. Análisis proximal de salvado de arroz sin fermentar, salvado de arroz fermentado, harina de soya sin fermentar y harina de soya fermentada en tratamientos de alimentación de camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei) en lagunas semi intensivas. Tratamiento Materia Seca (%) Grasa (%) Proteína cruda (%) Ceniza (%) Fibra cruda (%) Extracto Libre de Nitrógeno (%) SASF& 91.42 ±0.06a 16.05 ±0.07 a 13.23 ±0.43 a 9.25 ±0.07 a 6.05 ±0.07 a 47.32 ±0.30 a SAF& 94.13 ±0.09b 13.37 ±0.52 b 11.17 ±0.07 b 15.59 ±0.04 b 6.83 ±0.05 a 47.17 ±0.28 a Valor P 0.001 0.013 0.001 0.001 0.925 0.506 HSSF& 88.77 ±0.01 a 2.10 ±0.14 a 45.58 ±0.29 a 6.50 ±0.14 a 3.65 ±0.21 a 30.78 ±0.21 a HSF& 90.95 ±0.09 b 2.57 ±0.06 b 44.03 ±0.58 a 6.37 ±0.11 a 5.34 ±0.57 a 32.64 ±1.11 a Valor P 0.001 0.013 0.054 0.082 0.057 0.061 &Los valores son presentados como el porcentaje promedio ± desviación estándar en base seca. SASF (salvado de arroz sin fermentar); SAF (salvado de arroz fermentado); HSSF (harina de soya sin fermentar); HSF (harina de soya fermentada). a, b Letras diferentes en la misma columna es indicador de diferencias significativas (P ≤0.05). 26 En este estudio el valor de materia seca (MS) aumenta de 91.42 a 94.13, cuando el salvado de arroz es sometido a una bioestimulación con enzimas y microorganismos. La harina de soya sin fermentar (HSSF) como testigo indicó un valor de 88.77% de MS y se comparó con harina de soya fermentada que registró 90.95%. En el presente estudio registró un aumento de 2.96% de MS en el salvado de arroz fermentado (SAF) comparado con un testigo sin fermentar (SASF) y 2.45% en harina de soya fermentada comparado con el testigo sin fermentar. Estudios como los de Ribeiro et al. (2017), reportaron que el proceso de fermentación de los hongos filamentosos Rhizopus oryzae afectó positivamente la composición proximal del salvado de arroz, aumentando los niveles de fibra, cenizas, proteínas y lípidos. Sin embargo, en el presente estudio los contenidos de proteína y grasa disminuyen y aumenta la ceniza y la fibra cruda. Los resultados del análisis de hierro y fósforo del salvado de arroz y harina de soya realizados antes y después del proceso de bioestimulación se presentan en el cuadro 13. En el caso del hierro se puede observar que existió un incremento significativo (P ≤0.05) en harina de soya después del proceso de bioestimulación. En el salvado de arroz bio estimulado se encontró un incremento alrededor del 106% en el contenido de hierro comparando el salvado sin bioestimulación con el salvado bioestimulado durante 24 h. La HSF incrementó en 152% el contenido de hierro cuando se comparó la harina de soya sin bioestimular con la harina de soya bioestimulada. En resumen, en ambos casos el contenido de hierro aumenta considerablemente después de una bioestimulación con enzimas y microorganismos durante 24 h. Los resultados de este estudio difieren de los reportados en estudios previos, donde el contenido de hierro en el salvado tratado con probióticos no presentó cambios significativos (Bhosale y Vijayalakshmi 2015; Ribeiro et al. 2017). Asimismo, la harina de soya fermentada presentó un incremento en su contenido de hierro. Esta tendencia también fue reportada en la fermentación de harina de soya con Aspergillus usamii por Hibarabayashi et al. (1998). El salvado de arroz fue la materia prima que presentó el mayor contenido de fósforo como lo indica el cuadro 11, comparado con la harina de soya. Se encontró que el proceso de bio estimulación no afecta el contenido de fósforo en el salvado de arroz; en ambas materias prima no se encontró diferencia (P >0.05). Cuadro 11. Efectos de los tratamientos de bioestimulación en los contenidos de hierro y fósforo en salvado de arroz sin fermentar, salvado de arroz fermentado, harina de soya sin fermentar y harina de soya fermentada. Tratamiento Hierro (mg /kg) Fósforo (mg /kg) SASF1 104 ±2.11 18448 ±11 SAF1 215 ±36.52 17085 ±1563 HSSF1 82 ±1.92 6590 ±30 HSF1 125 ±2.18 5490 ±350 1 Los valores son presentados como el promedio ± desviación estándar en base seca, miligramos de mineral por kilogramo de materia prima. SASF (salvado de arroz sin fermentar); SAF (salvado de arroz fermentado); HSSF (harina de soya sin fermentar); HSF (harina de soya fermentada). 27 Los procesos de fermentación o degradación enzimática reducen el contenido de ácido fítico; y se ha reportado que la fermentación hace más disponible a los minerales, incluyendo hierro y fósforo provenientes de granos, ya que estos se encuentran unidos al ácido fítico (Gupta et al. 2015). El salvado de arroz en otro estudio después de la fermentación con R. oryzae muestra cambios en la composición físico química; uno de esos cambios es la reducción en lípidos (Oliveira et al. 2010). En este estudio se registró aumento en la fibra cruda de HSF, comparado con harina de soya sin fermentar (HSSF).Según algunas investigaciones como las de Aranda et al. (2012), indican que el incremento de la fibra cruda puede ser explicado porque el tiempo de fermentación aumenta significativamente el contenido de paredes celulares, con relación al contenido de almidón del producto usado (Aranda et al. 2012). Esto debido al uso de los azúcares que se encuentran en el contenido celular por los microorganismos que se desarrollan en el sistema (Fernández Cabrera 2009) proceso que se ve reflejado aproximadamente a las 48 h de fermentación según Rodríguez et al. (2001). 3.10 Perfil de ácidos grasos en el salvado de arroz El salvado de arroz presentó cambios en su perfil de ácidos grasos después del proceso de bio estimulación. El salvado de arroz bio estimulado mostró una reducción en las grasas saturadas. Los ácidos grasos mono- y poliinsaturados representaron el 83.32% del perfil lipídico. En el cromatograma de ácidos grasos (g/100 g de grasa) destaca el predominio de C (18:1, cis-9) o ácido oleico con 42.28% y C (18:2, cis-9,12) o ácido linoleico con 35.70% y con una apreciable cantidad de C (18:3) linolénico de 1.03%. También se aprecia C (16:0) o ácido palmítico con 13%. La información recolectada en el Laboratorio de análisis de alimentos de Zamorano (LAAZ), coincide con la información reportada en el Instituto de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Girona (IRTA, por sus siglas en inglés). En general, el salvado de arroz mostró la predominancia de los ácidos grasos oleico, linoleico y palmítico, con valores similares a los de la literatura (Lemos et al. 2000). Cabe destacar la aparición de ácido tridecenoico y ácido eicosatrienoico en bajas concentraciones y la desaparición de algunos AG como el ácido undecenoico y el vaccénico después de la bioestimulación. 3. 11 Perfil de ácidos grasos de harina de soya. La harina de soya presentó cambios en su perfil de ácidos grasos después del proceso de fermentación. En la harina de soya fermentada existió una reducción en las grasas saturadas y los ácidos grasos mono- y poliinsaturados representaron el 75.64% del perfil lipídico. En el cromatograma de ácidos grasos (g/100 g de grasa) los AG más sobresalientes en la muestra (HSSF) fueron: el C (16:0) palmítico con 18.09%, C (18:0) o esteárico con 7.79%, también se aprecian los ácidos grasos insaturados C (18:1) ácido oleico con 16.36%, C (18:2) alfa linoleíco con 44.14% y el C (18:3) linolénico con 5.56%. 28 4. DISCUSIÓN No se registraron cambios significativos en el oxígeno disuelto (OD), temperatura y parámetros fisco químicos, debido a que los volúmenes de las piscinas tratadas son superiores a las cantidades de harina de soya y salvado de arroz utilizados respectivamente. El OD en el agua es un factor regulador del metabolismo de los camarones e influye en el estanque de cultivo afectando el crecimiento del organismo cultivado y la eficiencia de conversión alimenticia, así como causa de estrés, bajo apetito, susceptibilidad a enfermedades y mortalidad en los cultivos (Alpuche, J. Pereyra, A y Agundis 2005). Los sistemas intensivos y semi intensivos con mínimos recambios de agua dependen directamente de la aireación y la disponibilidad de oxígeno disuelto, es uno de los factores de mayor relevancia, para la respiración de los organismos cultivados, como para la oxidación, la suspensión y circulación de la materia orgánica en el estanque (Boyd 2008). La temperatura del agua presentó rangos entre 28 y 30 °C lo cual se encuentra entre los rangos sugeridos de 25 a 32 °C en los estudios de Ponce-Palafox et al. (1997; Prapaiwong y Boyd (2012); y Hernández Gurrola (2016), y de 20 a 30 °C en los de Hirono (1983) y Lee y Wickins (1992), valores mayores o inferiores a los mencionados pueden causar estrés crónico y ser letales para esta especie. Asimismo, el presente estudio concuerda con algunos estudios que informan que la aplicación de probióticos no mejora los parámetros productivos evaluados en el cultivo de camarón (Bolívar Ramírez et al. 2013). Los resultados sugieren que la frecuencia de aplicación y las dosis empleadas de salvado de arroz y de harina de soya, así como el sistema de producción en estanques al aire libre o en condiciones más controladas influyen en dicho efecto (Toledo et al. 2018). La alcalinidad mantuvo rangos entre 98 y 116 mg/L. El comportamiento de los parámetros fisicoquímicos de agua registrados en este estudio concuerda con los reportados por Zhou et al. (2013), quienes no encontraron diferencias en alcalinidad entre tratamientos con probióticos comparados con controles sin probióticos en el cultivo de larvas y poslarvas de L. vannamei. La alcalinidad influye en el proceso de nitrificación por el desarrollo de bacterias nitrificantes (Ebeling et al. 2006). De acuerdo con Furtado et al. (2011), el pH y los niveles de alcalinidad disminuyen durante todo el período de cultivo y la corrección mediante la aplicación de compuestos alcalinizantes es necesaria para evitar un efecto negativo en la calidad del agua y el rendimiento de los organismos cultivados. L