E.A.P. 149(21) C.2 tí IZAMORANO ESCUELA AGRICOLA PANAMERICANA DEPARTAMENTO DE ZOOTECNIA MANUAL DE LABORATORIO NUTRICION ANIMAL Beatriz Murillo 1994 ESCUELA AGRICOLA PANAMERICANA DEPARTAMENTO DE ZOOTECNIA MANUALDE LABORATORIO NUTRICION ANIMAL Beatriz Morillo 1994 "Si el camino es largo y duro no te rindas, ¡lucha!, el mundo es de aquel que se esfuerza y que a pesar de los altos y bajos de la vida, persevera hasta alcanzar "sus máximos sueños". Autor anónimo Clase 93, E A P. TABLA DE CONTENIDO INDICE DE FIGURAS vii INTRODUCCION 1 Objetivos 2 Reglas básicas de seguridad 2 Bibliografía 3 CLASIFICACION DE ALIMENTO 4 Componentes de la nomenclatura internacional de alimentos 4 Ejemplo de la nomenclatura internacional 6 Bibliografía 7 MUESTREO CONSERVACION Y ENVIO DE MUESTRAS 8 Muestreo de alimentos balanceados, suplementos e ingredientes alimenticios sólidos 9 Muestreo de alimentos e ingredientes líquidos 12 Muestreo de forrajes 12 Muestreo de pastos 14 Muestreo de hierbas y arbustos 16 Muestreo de forrajes ensilados 17 Muestreo de forrajes henificados 17 Muestreo de material biológico 18 Heces y orina 18 Líquido ruminal 19 Muestreo de suelos 19 Tamaño y tipo de envase para muestras 20 PREPARACION DE LAS MUESTRAS PARA ANALISIS 21 Deshidratación 21 Refrigeración o congelación 22 Efecto de la temperatura sobre la composición química de la muestra 22- Uso de preservadores químicos 23 Identificación de muestras 24 TECNICAS DE PREPARACION Y ENVIO DE MUESTRAS 24 Preparación y envío de alimentos balanceados, suplementos e ingredientes alimenticios sólidos 24 Preparación y envío de forrajes 25 i Preparación y envío de material biológico Bibliografía 25 26 ANALISIS PROXIMO 27 Humedad 28 Proteína cruda 28 Extracto etéreo o grasa 28 Material mineral 28 Fibra cruda 28 Extracto libre de nitrógeno 29 Esquema de flujo del análisis proximo o proximal 30 Hojas de registro de análisis 31 Bibliografía 32 DETERMINACION DE AGUA O HUMEDAD 33 Cálculos 34 Determinación de humedad aparente 34 Formas de expresar el contenido de materia seca de los alimentos 35 DETERMINACION DE MATERIA INORGANICA (CENIZAS) Y MATERIA ORGANICA 37 Cálculos 37 DETERMINACION DE PROTEINA CRUDA (Método de Kjeldahl) 38 Reactivos 38 Digestión 38 Destilación 39 Titulación 40 Cálculos 40 DETERMINACIONDE EXTRACTO ETEREO O GRASA CRUDA 42 Reactivos 42 Procedimiento 42 Cálculos 43 DETERMINACION DE FIBRA CRUDA 44 Reactivos 44 Digestión ácida 44 Digestión alcalina 44 Cálculos • 45 ii DETERMINACION DE LA ENERGIA GRUESA O BRUTA 46 Aparatos y reactivos 46 Preparación de la muestra 46 Estandarización del calorímetro 48 Cálculos del calor de combustión de la muestra 49 DETERMINACIONDE LA ACTIVIDAD INHIBIDORA DE TRIPSINA 50 Reactivos 50 Preparación de la muestra 50 Procedimiento 50 Cálculos 51 PROTEINA DIGESTIBLE EN PEPSINA 52 Reactivos 52 Procedimiento 52 Cálculos 52 PROTEINA SOLUBLE 54 Reactivos 54 Procedimiento 54 Cálculos • 54 UREASA ACTIVIDAD UREASICA 55 Material 55 Procedimiento 55 Cálculos 56 DETERMINACION DE CALCIO 57 Reactivos 57 Preparación de la muestra 57 Cálculos 58 DETERMINACION FOSFORO 59 Reactivos 59 Preparación de los estándares 60 Procedimiento 60 Cálculos 61 ANALISIS DE FORRAJES Y ENSILAJES 62 Introducción 62 Ensilaje 62 Tipo de fermentación sobre la composición del ensilaje 65 Fibra dietética 66 iii Á Solubilidad de proteína Bibliografía 67 68 DETERMINACION DE UREA EN ALIMENTOS PARA ANIMALES 70 Reactivos 70 Procedimiento 70 Cálculos 71 DETERMINACION DE FIBRA NEUTRO DETERGENTE Y CONTENIDO CELULAR 72 Principio 72 Equipo 72 Reactivos 73 Procedimiento 74 Cálculos 75 DETERMINACION DE PAREDES CELULARES (FND) EN ALIMENTOS AMILACEOS 76 Reactivos 76 Procedimiento 76 DETERMINACION DE FIBRA POR EL METODO ACIDO DETERGENTE 78 Principio 78 Reactivos 78 Procedimiento 78 Cálculos 79 DETERMINACION DE LIGNINA, CELULOSA Y SILICIO (CENIZAS INSOLUBLES) POR PERMANGANATO 8 1 Principio 81 Teoría del método 81 Reactivos 82 Procedimiento 83 Obtención de las fracciones: lignina, celulosa y óxido de silicio 84 Cálculos 86 NITROGENO INSOLUBLE EN DETERGENTE ACIDO 87 Importancia 87 Reactivos 87 Procedimiento 87 Cálculos 88 iv NITROGENO INSOLUBLE EN PEPSINA 89 Reactivos 89 Procedimiento- 89 Cálculos 90 DETERMINACIONDE NITROGENO AMONIACAL ENENSILAJES 91 Principio 91 Procedimiento 91 Cálculos 9 1 DETERMINACION DE HUMEDAD EN ENSILAJES 92 Principio 92 Procedimiento 92 Cálculos 93 MATERIA INSOLUBLE ENAGUA CALIENTE Y SU CONTENIDO DE NITROGENO 94 Principio 94 Procedimiento 94 Cálculos 94 DETERMINACION DEL pH ENENSILAJE FRESCO O CONGELADO 95 Principio 95 Procedimiento 95 DETERMINACION DE ACEDO LACTICO EN ENSILAJES 96 Principio 96 Reactivos 96 Procedimiento 97 Cálculos 98 DIGEST©ILIDAD INVITRO DE FORRAJES 99 Principio 99 Reactivos 99 Procedimiento 101 Preparación del inóculo 101 Procedimiento de Tilley y Terry 102 Procedimiento detergente neutro, para estimación de la digestibilidad verdadera 102 Cálculos 103 v DETERMINACION DE LA DIGESTTBILÍDAD IN VITRO Y ENERGIA METABOLIZABLE POR EL METODO DE PRODUCCION DE GASES 104 Principio 104 Reactivos 104 Equipo 105 Procedimiento 106 Cálculos 108 CALCULO DE LA DIGESTTBILIDAD APARENTE (ECUACION SUMATIVA) 110 vi 2 INDICEDE FIGURAS 1 MUESTREADORES PARA SOLIDOS 10 2 FORMA CORRECTA DE INSERTAR EL MUESTREADOR EN UN SACO- 10 3 PUNTOS DE MUESTREO 11 4 FORMAS DE TOMAR MUESTRAS ENUNPOTRERO 15 5 MUESTREO SECUENCIAL DE UNA PARCELA 16 6 ESQUEMA DEFLUJO DEL ANALISIS PROXIMO O PROXIMAL 30 7 HOJAS DE REGISTRO DE ANALISIS 3 1 8 DISTRIBUCION DE LA FIBRA EN LA DIETA 66 viii INTRODUCCION Elconocimiento de lacomposición químicadelos alimentos permitesuutilizaciónenuna forma racional, así como, la incorporación como alimentos de productos desconocidos, o de aquellos queencondicionesnaturales sontóxicospero quemedianteciertos procesospuedenser usados con confianza. Elanálisis también indica qué y cuáles requerimientos nutricionales se pueden cubrir con los alimentos, para evitar deficiencias o excesos de nutrientes, que sean perjudiciales para los animales domésticos. Elanálisis químico nutricionalde los alimentos es, por consiguiente, indispensable para establecer programas de alimentación adecuados, tanto para los animales como para el hombre que los alimenta. Desde hace tiempo elhombre se hapreocupado por analizar los alimentos para conocer sus características nutritivas. Diferentes cuadros de composición de alimentos se encuentran publicados en todo el mundo (Latin American tables of feed composition, 1974;US Canadian tables offeed composition, 1969;Valor nutritivo de los alimentos para Centroaméricay Panamá 1971). Estoa cuadros indican lacomposición proximalde los alimentos y algunos incluyen los aminoácidos, minerales, vitaminas e incluso pruebas con animales. Sin embargo, el empleo de cuadros de composicióntiene limitacionesyaque se indicanúnicamentepromedios;además,hay variaciones en la composición química debido a diferencias entre especies, localización geográfica, sistemas de recolección, procesos industriales, sistemas agrícolas y, por supuesto, adulteraciones. Todo ésto origina errores que en ocasiones pueden ser importantes (Tejada, 1981). Por todo ésto debe hacerse siempre uso del laboratorio como un instrumento esencial para constatar la pureza de los alimentos empleados en un determinado lugar. Según su composición química, los alimentos se puedenclasificar en grupos diferentes; por lo tanto, los métodos para analizarlos también pueden ser característicos de un tipo de alimento. Por supuesto, hay determinaciones que son comunes a varias clases de alimentos, como la determinación de "proteína cruda" o de minerales; sin embargo, "calidad de proteína" se aplica de preferencia a concentrados proteicos como pastas o tortas de oleaginosas y harinas de carne o pescado. En general los alimentos para animales pueden clasificarse en las siguientes categorías: 1.- FORRAJES 3.- SUPLEMENTOS 2.- CONCENTRADOS 4.- ADITIVOS 1 Independientementedelcriteriousadoparaclasificarlos,hayalimentosqueno caendentro de ninguna o varias de estas categorías. Com'o quiera que sea, lo importante no es clasificarlos en forma rigurosa, sino conocer sus características químicas y las condiciones que afectan el valor nutritivo de cada alimento para la especie animal a la que se dedica, o al programa de alimentación que lo incluye. Objetivos. ElLaboratorio deNutriciónAnimal está diseñado paraproporcionar a los estudiantes el entrenamiento necesario en el análisis de alimentos concentrados y forrajes y lo que es más importante, capacitarlos en los criterios de interpretación de resultados paraque puedanutilizar eficientemente en la práctica la información que se genera en el laboratorio. El presente manual es la recopilación de los métodos más comúnmente usados para el análisis de alimentos destinados al consumo de los animales domésticos yrepresenta laguíapára el trabajo diario en el laboratorio. Además de servir en el módulo, este documento quedará como material de referencia para cada uno de los participantes del curso. Reglas básicas de seguridad : 1.- GUARDE SIEMPRE ÓRDEN Y LIMPIEZA ENEL TRABAJO. 2.- POR NINGUNA RAZON JUEGUE DENTRO DEL LABORATORIO. "BROMEAR" PUEDE SER PELIGROSO TRATANDOSE DE REACTIVOS CUYA COMPOSICION Y CORROSIVIDAD USTED NO CONOCE. 3.- DEBE TENER ESPECIAL CUIDADO EN EL MANEJO DEL MATERIAL DE VIDRIERIA Y PORCELANA CUANDO ESTA CALIENTE. SIEMPRE USE PINZAS O GUANTES DE ASBESTO PARA EVITAR QUEMADURAS. 4.- USE MANDIL PARA PROTEGER NO SOLO SU ROPA DE POSIBLES SALPICADURAS DE COMPUESTOS CORROSIVOS, SINO A USTED MISMO. 5.- NUNCA SE LIMPE LAS MANOS EN LA ROPA. MUCHOS REACTIVOS CONTIENEN ACIDOS O SUBSTANCIAS CORROSIVAS, QUE ADEMAS DE QUEMAR LA ROPA PUEDEN LLEGAR A QUEMAR O IRRITAR LA PEL. LAVESE Y SEQUESE CON PAPEL TOALLA. 6.- NO USE PAPEL TOALLA PARA SECAR ACIDOS O SUS RESPECTIVAS SOLUCIONES VERTIDAS SOBRE LAS MESAS O EL PISO. USE ESPONJAS EMBEBIDAS ENAGUA Y LIMPEENJUAGANDO LA ESPONJA TANTAS VECES COMO SEA NECESARIO EN EL LAVAMANOS MAS CERCANO. EL PAPEL 2 TOALLA SE QUEMA CONFACILIDAD Y PUEDEPRODUCIR QUEMADURAS EN LAS MANOS POR SIMPLE POROSIDAD. ' 7.- MANIPULE SIEMPRE EN LA CAMPANA EXTRACTORA, REACTIVOS Y REACCIONES QUE GENEREN VAPORES IRRITANTES O TOXICOS, HAGALO SIEMPREENLA CAMPANA EXTRACTORAY UTILICEBULBOSAUTOMATICOS PARA EXTRAER CON UNA PIPETA SOLUCIONES VOLATILES TOXICAS. NUNCA HUELA DIRECTAMENTE UN FRASCO CON REACTIVOS. 8.- SI SE QUEMA CON ACIDO LAS MANOS O ROPA NO TIRE EL MATERIAL CON . QUE ESTA TRABAJANDO. COLOQUELO SOBRE LA MESA Y LAVESE EFUSIVAMENTE LAS MANOS EN EL CHORRO MAS CERCANO. NI EL ACIDO CLORHIDRICO PURO, QUE ES EL MAS FUERTE, ES CAPAZ DE DESTRUIR TEJIDO EN ESCASOS SEGUNDOS. ¡NO SE DESESPERE! PIENSE Y ACTUE SENSATAMENTE. INFORME INMEDIATAMENTE DE LA QUEMADURA AL PROFESOR. Bibliografía Me Dowell, L.R., J.H. Conrad, J.E. Thomas and L.E. Harris. 1974. LatinAmerica tables of feed composition. University of Florida. Gainesville, Florida, U.S.A. Tejada Hernández, I. 1981. Composición química de los alimentos. Panafga (89), 59. Unites States-Canadian Tables ofFeed Composition. 1982. (3th revision)NationalAcademy of Sciences, Washington, D.C., U.S.A. Flores, M., M.T. Menchú y MY. Lara. 1971. Valor nutritivo de los alimentos para Centroamérica y Panamá. Instituto de Nutrición de Centro América y Panamá. Guatemala, Guatemala. 3 á CLASIFICACION DEALIMENTO El consejo nacionalde Investigaciónde los Estados Unidos (NRC) creó un programade clasificación y nomenclatura de los alimentos que reuniera los siguientes factores: 1.- Un medio para describir los alimentos exactamente y en detalle. 2.- Permitir la formulación de raciones por computadora. 3.- Proveer una clasificación internacional de alimentos para animales. Harris et al. (1968) propusieron una nomenclatura que describiera a los alimentos en forma tal, que indicara algunas de sus propiedades cualitativas. Así, el nombre internacional consiste de nueve componentes escritos en forma lineal, separando cada componente con una coma. Componentes de la nomenclatura internacional de alimentos 1.- Nombre científico (género y especie). 2.- Variedad o clase. 3.- Nombre común del alimento. 4.- Parte de la planta, animal o subproducto. 5.- Proceso(s)ytratamiento(s)aplicado(s) al alimento,antes deser consumido porlos animales. 6.- Estado de madurez (cuando sea necesario). 7.- Corte o cosecha (cuando sea necesario). 8.- Grado o calificación de calidad. 9.- Clasificación. Los alimentos del mismo origen (especie, variedad o clase) están agrupados en ocho clases: 1.- FORRAJES SECOS Y ALIMENTOS TOSCOS FORRAJES DIFICILES DE DIGERIR. HENOS de gramíneas y/o leguminosas PAJAS: La parte aérea del forraje con espiga, cáscara y/o panícula. RASTROJO: La parte aérea del forraje sin espiga, cáscara y/o panícula. OTROS PRODUCTOS CON MAS DE 18% DE FIBRA. Esta clase incluye todos los pastos y forrajes no cultivados cortados y/o curados. Estos forrajes son bajos en energía neta por unidad de peso, generalmente debido a niveles elevados de fibra. De acuerdo a lanomenclatura internacional, los productos que en estado seco tienen más de 18%de fibra -cruda, se clasifican como forrajes secos y/o alimentos toscos. En este grupo se- inplpyeñ las cascarillas como las de avena, cacahuate y algodón. 4 2.- PASTURAS CULTIVADAS, PASTOS NATIVOS Y FORRAJES UTILIZADOS VERDES FORRAJES QUE NO HAN SIDO CORTADOS Y/O CURADOS. Por ejemplo, todos los forrajes cortados y ofrecidos en forma verde o curados en pie, como plantas nativas en estado de latencia negativa. Eltérmino verde se usa como un término de procedencia para la mayoría de estos alimentos, aunque ellos pueden ser- secados antes de ser consumidos. 3.- ENSILAJES ALIMENTOS CONSERVADOS POR FERMENTACION. Por ejemplo, maíz, sorgo, guinea, mezcla de leguminosas con gramíneas, etc. 4 - AUMENTOS ENERGETICOS ALIMENTOS CONMENOSDE20% DEPROTEINA CRUDA Y MENOSDE 18%DE FIBRA CRUDA. Granos de cereales (maíz, sorgo, trigo, avena, etc.) Subproductos de molinería. Nueces. Raíces. Grasas. Melazas. 5.- AUMENTOS PROTUCO ALIMENTOS CON MAS DE 20% DE PROTEINA CRUDA Y MENOS DE 18% DE FIBRA CRUDA. Proteínas de origen animal (harinas de carne, residuos de aves, de pescado, etc.) Proteínas de origen vegetal (harinas de soya, algodón, cártamo, etc.) Proteínas de origen microbiano (levaduras, algas, hongos, bacterias) Subproductos industriales (granos secos de destilería, de cervecería) 6.- SUPLEMENTOS MINERALES. 7 - SUPLEMENTOS VITAMINICOS. 8- ADITIVOS. Preservadores de los alimentos. Moduladores de 1a. digestión. Alteradores del metabolismo y de la salud. Modificadores del consumo. Pigmentos. 5 i EJEMPLO DE LA NOMENCLATURA INTERNACIONAL17 Componentes del nombre Alimento 1 Alimento 2 Alimento 3 Género (material del que proviene) Especie Variedad o clase Nombre común Parte consumida Proceso y tratamiento al cual ha sido some¬ tido el producto Grado de madurez Zea mays indentata maíz parte aérea ensilado Digitaria decumbens pasto pangóla parte aérea fresco fertilizado florecimiento tardío Gossypium spp. algodón semilla con algunas cas¬ carillas. extraído con disolventesy molido. Corte o cosecha Grado de calidad Clase (3) Ensilaje uno (2) Pastos pastos nativos forrajes sumi¬ nistrados verdes. 36% de pro¬ teína cruda mínimo. (5) Suplemento proteico No. de referencia 3-02-912 2-10-388 5-01-632. 'Tomado de McDowell et al. (1974). 6 Los nombres de los alimentos quedarán entonces así: Alimento 1 Zea mays,maíz, parte aérea, ensilado, (3). Alimento 2 Digitariadecumbens,pangóla,parteaérea,fresco,fertilizado,florecimiento tardío, primer corte, (2). Alimento 3 Gossypium spp,algodón, semillas con algunas cascarillas, extraída con solventes y molida, mínimo 36% de proteína, (5). Bibliografía Harris,L.E.,J.M. Asplund andE.W. Crampton. 1968. An international feed nomenclature and methods for summarizingandusingfeed data to calculate diets. UtahAgr. Exp. Sta. Bull, 479. McDowell,L.R.,J.H.Conrad, J.E.Thomas andL.E.Harris. 1974. Latin American tables offeed composition. University of Florida. Gainesville, Florida U.S.A. 7 MUESTREO, CONSERVACION Y ENVIO DE MUESTRAS Laquímica analíticacomprendeelanálisis cualitativoycuantitativo.Elanálisis cualitativo es la detección e identificación de los constituyentes de un alimento, mientras que el análisis cuantitativo es la determinación de las cantidades de esos constituyentes. En el campo de la nutrición es de gran importancia conocer los nutrientes que ingiere, excreta y metaboliza el- organismo, por lo que la química analítica junto con la bioquímica y la fisiología se pueden considerar como sus piedras angulares. En la actualidad se han desarrollado técnicas y métodos específicos, exactos y precisos para analizar los diferentes compuestos que intervienen en la bioquímica de la nutrición, los cuales se clasifican según el tamaño de la muestra empleada: CLASIFICACION DE LOS METODOS ANALITICOS SEGUN EL TAMAÑO DE LA MUESTRA. Clase de método Tamaño aproximado de la muestra para el análisis. Ordinarios o macrométodos 100 - 1000 mg Semi-Micrométodos 10 mg Micrométodos 1 mg Ultra-Micrométodos 1 pg Métodos de Sub-Microgramos 0.01 pg Tomado de Blaedel y Meloche (1966). El analista debe escoger el método más adecuado para la determinación que se desea efectuar; sin embargo, aún el más experimentado y utilizando el método más preciso y exacto, no obtendrá resultadosverdaderos si lamuestrano es representativadel espécimen que se desea analizar. O sea que una muestramaltomada invalidaráelmejor análisis. De ahí la importancia que tiene el muestreo, que muchas veces se efectúa incorrectamente. Elobjetivo principalde losprocedimientosdemuestreo es obtener unamuestradetamaño adecuado, que represente a latotalidad de lamasa del espécimen de donde fue tomada para ser trabajada en el laboratorio. El muestreo adecuado dependerá del objetivo del análisis. El muestreo se hace para controlar lacalidaden laproducciónde unconcentrado, paracontrolar lacalidad de las materias primas, o con fines de investigaciónpor supuesto, unmuestreo adecuado dependerátambién del universo que se desea para tomar muestras. 8 Cuando elmuestreo esparacontrol de calidad enlaproducción,existenmétodosbasados en distribuciones estadísticas específicas, cuyonúmero demuestras que se deben tomar sebasan en ecuaciones que correlacionan ciertos parámetros como son: la tolerancia permitida en la calidad del producto, el tamaño del universo muestreado (producción/unidad de tiempo), desviación estándar prefijada, etc. Para fines de investigación, que es el caso de los análisis en nutrición animal, es más- práctico y útilun muestreo alazar. Aquí el término ''azar" no significa literalmente casualidad; al contrario, "selección al azar" es un procedimiento definido y riguroso que asegura que cada parte o unidadde ununiverso particular tiene igualprobabilidadde ser seleccionada o escogida. El proceso umversalmente aceptado de selección al azar, consiste en asignarle a cada unidaddeluniverso unnúmero único ydesignar las unidadesque serán seleccionadas utilizando unatabla o ungenerador de númerosalazar. Este métodopresenta ciertos inconvenientes como son las limitaciones físicas cuando se dificulta asignar un número a cada unidad; algunas veces resulta costoso y en otros casos, si no se tiene idea de la distribución de las unidades en el lote, también resulta complicado. Muestreo de alimentos balanceados, suplementos e ingredientes alimenticios sólidos. Para muestrear este tipo de productos, es necesario utilizar instrumentos diseñados para esta tarea. Los muestreadores deben estar limpios y libres de contaminación tanto interna como externamente; los más comunes se ilustran en la figura 1;sin embargo, sino se dispone de ellos, se puede ingeniar una forma para obtener las muestras. Si se hace con cuidado, se obtienen resultados similares, aunque toma él muestreo toma más tiempo (Cooks y Van Rede, 1976). INSTRUMENTOS PARA TOMAR MUESTRAS a) Lanza muestreadora (probador abierto) b) Cucharón de mano. c) Lanza muestreadora dividida. d) Muestreador cilindrico dividido. e) Boquilla vertedora (probador de sacos). f) Muestreador para flujos continuos. g) Moldes o cuadrantes para cuartear. Si el producto está envasado en bolsas o sacos cerrados, se deberá tomar de cada bulto muestreado 500 a 1000 gramos de material, el cual se extraerá de la siguiente manera: el bulto se colocará horizontalmente y luego se insertará el muestreador diagonalmente de extremo a extremo. El muestreador puede ser la lanza abierta o la boquilla vertedora ( Figura 2). El número de sacos o núcleos a muestrear dependerá del tamaño del lote. Para lotes menores de 10 unidades deberánmuestrearse todos lossacos; si el lotees mayor de 11unidades, 9 tome 10 sacos al azar y obtenga una muestra núcleo de cada uno. Según Cooks y Van Rede (1976), se debe muestrear no menos del 2% de los sacos cuando se trata de lotes grandes. FIGURA 1. MUESTREADORES PARA SOLIDOS. (22«nm) 16mm j FIGURA 2. FORMA CORRECTA DE INSERTAR EL MUESTREADOR EN UN SACO. 10 I Si elproducto a muestrear está a granel, ya sea en camiones,vagones de ferrocarril o en bodega, se utilizará un muestreador cilindrico. Las muestras deben ser del mismo tamaño que las obtenidas de los sacos. Ver figura 3. ÍTGURA 3. PUNTOS DE MUESTREO + + + + + Hasta 5 toneladas: 5 puntos de muestreo. + + + + h + + + + + + + f- + + + + + + De 15 a 30 toneladas: 8 puntos de muestreo. De 30 a 50 toneladas: 11 puntos de muestreo. Otra forma de tomar muestras de los ingredientes a granel, es en el momento de cargar o descargar un lote, la operación se facilita, mucho ya que solo basta introducir un recipiente adecuado bajo latolva de descarga a intervalos de tiempo, que serán proporcionales alvolumen cargado o descargado. Unavez obtenidos los núcleos que constituyen lamuestra,ésta debe ser homogeneizada, ya sea en un recipiente o sobre un papelextendido; después, pormedio de cuarteo, se reducirá hasta tener el tamaño adecuado para ser enviada al laboratorio. Lamanipulación de la muestra debe ser lo mas rápido posible para evitar que pierda o absorba humedad, sobre todo en lugares con condiciones atmosféricas extremas. Las muestras deben ser guardadas en recipientes herméticos y etiquetadas debidamente. 11 La identificación de la muestra es muy importante. La etiqueta debe contener toda la información pertinente. Una forma prácticay segura de identificar la muestra, consiste en atar etiquetas impermeables marcadas con tinta indeleble; también hay que hacer uso de claves adecuadas, que quedarán asentadas en los archivos de quien envía las muestras al laboratorio. Es importante que el recipiente en el cual se envía la muestra, aparte de ser hermético, sea resistente al manejo,ya que algunas veces se puede romper durante el envío; si se emplean bolsas de polietileno, debencerrarse herméticamente; se pueden emplear recipientes deplástico- o nalgeno con tapón de rosca, y bolsas de papel reforzadas. Muestreo de Alimentos e Ingredientes Líquidos. . El muestreo de líquidos como melaza de caña, aceite, leche y aditivos líquidos adicionados a los eñsilajes, es similar al de los ingredientes sólidos. Se empleando dispositivos especiales que tienen trampas para abrirse y llenarse a la profundidad deseada. La toma de muestras de líquidos almacenados enrecipientes, además dehacerse en diferentes sitios, se hace adiferentes profundidades, o bien durante el llenado o vaciado de los tanques. Cuando se trata de materiales de elevada viscosidad, hay que calentar el recipiente paragarantizar uniformidad en el muestreo. Muestreo de Forrajes. El muestreo de forrajes se divide en las siguientes partes: 1.- Forrajes frescos (pastos, herbáceas y arbustivas). 2.- Forrajes ensilados 3.- Forrajes henificados Elmuestreo de forrajes en un potrero tiene que ser representativo de una gran extensión, por lo que al tomar muestras hay que abarcar la mayor área posible; este problema se reduce considerablemente cuando se trata de parcelas experimentales o de jardines de introducción. Para tomar muestras correctamente de un forraje, es necesario conocer el objetivo de la investigación y los parámetros que se van a evaluar. En los forrajes son muchas las variables que influyen en su calidad: calidad genética, estado fenológico de la planta, tipo de suelo, condiciones atmosféricas y prácticas de manejo como sería fertilización, regadío, pastoreo, etc., entre otras. Por lo tanto, dependiendo del parámetro a medir, se definirá la forma de tomar muestras. Engenerales necesario indicarlas condicionesde desarrollo delforraje para saber qué variables permanecen constantes y cuáles cambian. Así, el análisis efectuado pueda arrojar la mayorinformaciónposible. Cuando se toman muestras de unforraje, será idealtener lasiguiente información: 12 1.- MATERIAL DE QUE SE TRATA. Nombre común o regional Nombre científico: género, especie, variedad. 2.- ESTADO FENOLOGICO. Estado o grado de madurez de la planta. Generalmente para clasificar el estado- fenológico se recurre a lanomenclatura usada por el NationalResearch Council (1962), que se describe a continuación: NOMBRE Germinado Retoño u hoja temprana. Inmadurez Preflorecimiento Florecimiento temprano Florecimiento mediano Florecimiento pleno Florecimiento tardío Estado lechoso Estado masoso Estado de madurez DEFINICION Crecimiento del embrión de la semilla después de un período de latencia. Estado en que la planta alcanza 1/3 de su crecimiento antes de florecer. Período entre 1/3 y 2/3 de su crecimiento antes de florecer. Estado en que laplanta alcanza su crecimiento total antes de florecer. Período cuando la planta empieza a florecer (10% de floración). Período durante el cual 1/10 a 2/3 de las plantas están en flor. Cuando 2/3 o más de las plantas están florecidas. Cuando las flores se empiezan a secar y caer, las semillas empiezan a formarse. Las semillas están bien formadas, pero suaves e inmaduras. Cuando las semillas tienen una consistencia dura, pero inmaduras. Estado en el cual la planta sería cosechada para colectar la semilla. 13 Estado de sobre-madurez Estado después de lamaduración; las semillas están madurasy laplanta empieza a ser deterioradapor el clima. Latencia Las plantas son curadas o curtidas en el tallo; las semillas han caído y el follaje ha sido atacado casi en su totalidad por los fenómenos metereológicos. 3 .- LUGAR Y FECHA DE RECOLECCION. Estos datos son tomados con el objeto de conocer el sitio y época de desarrollo de laplantapara que en el futuro se pueda correlacionar la calidad del forraje con el tipo de suelo y clima en que crece. Si se están comparando varios forrajes que crecen en un mismo sitio, es conveniente anotar el sitio en cuestión, la clasificación metereológica y el tipo de suelo. 4.- CONDICIONES DE MANEJO DEL FORRAJE. Dentro del area del manejo, las variables que más influyen son: Fertilización.Tipo y calidad de fertilizante, frecuencia y método de aplicación, o bien, tiempo que ha transcurrido desde la aplicación hasta la recolección de la muestra. Riego y otros manejos. Si es una pradera artificial, hay que especificar el tipo y frecuencia del riego, así como otros tratamientos que se le den al suelo. Pastoreo. Especificar la carga animal, la frecuencia y tipo de rotación, etc. Otros factores de importancia agronómica. Prácticas como chapeo, fumigación, defoliación, control de malezas, quema, etc., definitivamente van a influir en la calidad de un forraje, pero no están dentro de los objetivos de este manual. Muestreo de pastos. El muestreo de pastos en un potrero dependerá de la extensión del mismo. Se deben recolectar pequeñas cantidades en diferentes zonas del terreno. Tratando de que los puntos de muestreo no queden alineados ni latitudinal ni longitudinalmente, ya qué muchas veces la formación geológica o la morfología de un terfeno sigue patrones de bandas y la composición del suelo o su declive influyenpara que haya diferencias en eldesarrollo del forraje. La manera ideal de muestrear un potrero es en forma radial: se parte primero del centro, el cual se puede marcar con un poste o mojonera. Luego se hacen las recolecciones radialmente, a distancias proporcionales a las dimensiones del potrero, 14 Si se desea conocer el rendimiento forrajero, es-necesario medir el forraje de una determinadaunídaddeárea. Generalmentesehaceutilizandounmarco cuadrado (hecho demetal o de madera) de un metro por lado, arrojándolo al azar en las direcciones radiales del potrero, como se ilustra en la figura 4. Se registra la cantidad de forraje que se obtiene de cada muestreo. FIGURA 4. FORMA DE MUESTREAR UN POTRERO Correcta Incorrecta De igual manera, cuando se desea hacer una zona de exclusión en el potrero para muéstreos posteriores, se pueden colocar unasjaulas o corraletas de exclusión que van cerradas con red de alambre, o bien, se cerca la zona que se desea excluir. Para fines de alimentación sólo es necesario conocer lacalidaddelforraje, por lo que con sólo tomar unapequeñamuestra de cada punto del potrero escogido, según el método descrito anteriormente, es suficiente. Al colectar las plantas de pasto en cada punto hay que tomar uno o varios manojos de plantas, evitando seleccionarlas por tamaño uotras características. Las plantas seleccionadas al azar deben cortarse de preferencia como son arrancadas por el animal al pastorear. Aquí se presenta unproblemaya que ciertos pastos, sobre todo los tropicales y otros amacollados como el guinea o el elefante, van lignificando la parte inferior al ir creciendo. Si en el manejo del potrerono se destruyenestas partes(quemándolas porejemplo), enel centro de lamacollaqueda una parte verdaderamente duta que el animal jamás consume. Desde el punto de vista de la alimentación animal, si se desea hacer un estudio de los nutrientes que ingiere el ganado, habrá que analizar solamente laparte que éste consume, o sea, lamenos lignificada. Para estudios agronómicos o de composición forrajera en los que se desea cuantificarlos nutrientestotales contenidos enlaplanta,habráque incluirtambiénen elmuestreo la parte lignificada. Por regla general se acostumbra cortar un pasto a '5 cm" del suelo sin importar de que tipo de estudio se trate, a menos que elestudio determine de antemano la altura de corte. Si se desea hacer un estudio a diferentes edades de la planta o diferentes estados fenológicos, hay que tener cuidado de no volver a cortar las mismas plantas de un muestreo 15 anterior, ya que no serían representativas. Generalmente un estudio de este tipo se efectúa siempre en parcelas de experimentación, por lo que una buena solución es cuadricular las parcelas, desechando las zonas perimetrales y muestreando sucesivamente diferentes cuadros, como se muestra a continuación: En la figura 5 se ilustra como se dividiría una parcela en la que se van hacer seis recolecciones diferidas. Las primeras muestras se tomarán en el cuadro 1; después de dos semanas se tomarán muestras en el cuadro 2, y así sucesivamente, hasta completar el muestreo- doce después el cuadro 6. La zóna en blanco se descarta, por ser perimetral y rodeada de andadores; esta zona no es representativa. FIGURA 5 MUESTREO SECUENCIAL DE UNA PARCELA ' \—1 3 ¿ •'o 2 4 5 i6 Dependiendo de la cantidad de muestra recolectada y del tipo de análisis que se vaya a efectuar, se hará lapreparación de lamisma. Si se obtuvieranvarios kilos (k), conviene cuartear la muestrapara reducir su tamaño. Esta operación hay que hacerla rápidamente, con el objeto de que la muestra no pierda humedad ni sufra deterioro. Muestreo de hierbas y arbustos. El muestreo de hierbas y arbustos es similar al de pastos en cuanto a selección de los puntos de recolección; se diferencia únicamente en lo relativo al corte de la muestra y preparación de la misma. Cuando se trata de analizar una herbácea, leguminosa como alfalfa, siratro y otras similares, se cortarán a la misma altura que un pasto. En una planta arbustiva se cortan únicamente las partes suculentas, que son las que consume el ganado, o sea, las hojas con los tallos más tiernos como es el caso de laLeucaena, Gliricidia, etc. Tratándose de asociaciones de varias especies, como leguminosas con gramíneas, hay que cortar toda una área determinada (1m2 por ejemplo). Si se muestrea cortando manojos de material se puede cometer el error de seleccionar mayor cantidad deunaque de otray no en laproporciónque realmente se encuentra en la pradera. 16 Muestreo de forrajes ensilados. Laobtención de unamuestra representativa del contenido total de un silo es sumamente difícil, ya que durante el llenado del silo hay partes que se compactan mejor debido a mayor presión o mejor acomodo del material picado. Esto provoca que la fermentación sea diferente de una zona a otra y por lo tanto, su composición. Sise deseamuestrear elcontenido total de un silo habrá quetomar lasmuestras utilizando sondas cilindricas similares a las empleadas en el muestreo de suelos. Estas sondas están provistas de una broca o taladro, que horada la muestra al mismo tiempo que la arroja al exterior. Ese método tiene el inconveniente de que al perforar el centro del silo, entra aire que altera la fermentación, lo que puede dañar el ensilaje alrededor de la perforación. Unaforma de minimizar el daño es rellenando el hueco con elmaterial sobrante unavez que se hatomado la muestra. Así se compacta de nuevo, quedando el faltante en laparte superior donde el daño será mínimo. Si el muestreo se va haciendo conforme se va destapando el silo, habrá que tomar muestras de las diferentes capas, eliminando únicamente la superior. De cada capa se debe tomar parte del centro y parte de las zonas cercanas a las paredes. Una vez tomada y homogeneizada, la muestra debe colocarse rápidamente en un recipiente cerrado, ya que los ensilajes contienen sustancias volátiles como alcoholes y ácidos grasos. La muestra debe compactarse lo más que se pueda para conservar las condiciones de anaerobiosis y evitar cambios en el patrón de fermentación y, por lo tanto, en su composición. Unaforma prácticade lograrlo es utilizando bolsas de polietilenó lo suficientementegruesas para resistir la presión al compactar la muestra dentro de ellas. Unavez empacadas lasmuestrasde ensilaje,debencongelarseypermanecereneseestado durante su transporte y hasta su análisis. Muestreo de fonajes henificados. Elmuestreo de forrajes henificados presentael inconveniente de lo voluminoso y lapoca densidad del material, pero tiene la ventaja de que las muestras no necesitan ningúntratamiento para su conservación. BffíNOS EN PACAS. La forma de tomar muestras de henos empacados es similar a la utilizada para alimentos envasados en sacos. Laúnica diferencia es que el probador tiene que ser especial pÿrahoradar lapaca de forraje compactada, pero es exactamente igualen cuanto al número y selección de las pacas. Si las pacas están hacinadas a laintemperie, a lahora detomar 17 muestras hay que descartar las paca exteriores. Para seleccionar las pacas al azar, se pueden numerar utilizando unsistema de tres dimensiones que sería: fila, hileray altura; este sistema es práctico para cualquier material que esté almacenado en forma ordenada. HENOHACINADOENTROJES O A LA INTEMPERIE. Se toman muestras en varios puntos del almiar y a diferentes profundidades. Se tiene cuidado de no manipular mucho la muestrapara evitar lacaídade las hojas delmateriál,que por estar deshidratadas sonsumamente frágiles, sobre todo en henos de plantas de hojaancha; enhenos de gramíneas este problema es- menor. Se debe descartar la capa superior o superficial del almiar. Para los henos se deberá tomar una muestra mayor que en el caso de forrajes frescos, y no se cuarteará, sino que se molerá toda. Una vez molida, se homogeneiza; entonces, si se desea, se procederá a cuartear hasta tener una muestra de tamaño adecuado para su envío al laboratorio. Muestreo de material biológico. Para conocerlos nutrientes quemetaboliza el organismo hayque conocer losque ingiere, los que excreta y los que acumula. Para saber los que ingiere, basta con analizarlos alimentos que consume el animal; para saber los que excreta generalmente basta ccn analizar las heces y la orina. Para conocer los nutrientes acumulados, se puede analizar el organismo entero o porciones de éste, a través de biopsias. Para este tipo de análisis se emplean muestras de sangre, suero, grasa o tejido que van desde pelo, huesos, músculos, hasta el animal entero. Muestreo de heces y orina. El objetivo de colectar heces y orina es para realizar estudios de digestibilidad, de balances de nitrógeno, de calidad de proteína, etc. Cada prueba tiene su metodología especial de la cual dependerá la forma de muestreo. No, es la misma colección para digestibilidad utilizando marcadores que la colección total de los desechos. La colección de orina se debe colectar diariamente a la misma hora durante todo el período de colección cuando se dispone dejaulas metabólicas. La orina colectada se midey se toma una alícuota del 10%en volumen de la cantidad total. Como preservanté a la alícuota se le agrega el 10% de su volumen, de una solución de HC1al 25%; existen otros preservantes como soluciones de HgCl2 y K2Cr207, o de H2S04 con tolueno, pero elHC1es mas eficiente y mas sencillo de preparar. Al hacer los cálculos del análisis, no hay que olvidar corregir en base al preservante agregado. 18 Cuando se conduce un experimento en el cual se recolectan todas las heces excretadas, ya sea con trampas en las jaulas metabólicas o arneses-especiales, se debe hacerla colección diariamente y aproximadamente a la misma hora. Se deben pesar las heces y separar una parte (generalmente el 2 ó el 3% para bovinos y el 10% para ovinos), desechando el resto. Al final del período de recolección se mezclan las heces y se toma una parte (500 g aproximadamente) para su envío al laboratorio. Eluso de marcadores ( Cr203, Fe203, etc.) y de indicadores (sílice, lignina, etc.) en las pruebas de digestibilidadtienen laventaja dequé no esnecesario recolectar latotalidad deheces; sólo es suficiente una parte de lo excretado; sin embargo, hay algunas variantes en cuanto a la forma y período de colección. liquido ruminal. El empleo de animales fistulados es recomendable cuando interesa hacer estudios intensivosque impliquenunmuestreo frecuentedel rumen. Tales el caso de animales donadores de líquido para pruebas de digestibilidad invitro. La colocación de lafístula se hace por medio quirúrgico. La especie animal donadora depende del objetivo del estudio o de la cantidad de líquido ruminal deseado. Si es un ovino, su capacidad ruminalno permite colectar cantidades grandes de líquido ruminal como unbovino por ejemplo. Para obtener líquido ruminal de un ovino fistulado, el tamaño de la cánula obliga a introducir una sonda a través del orificio. En el caso de un bovino con unafístula de un diámetro grande se puede fácilmente introducir con la mano unrecipiente pequeño,y así tener todo elmaterial que se necesite. Al destaparla fístula, siempre hay que quitar el material adherido a las paredes, sobre todo si el animal no ha sido alimentado con anterioridad a la toma de la muestra. Muestreo de suelos. Paraanalizar losmineralesque ingierenlosanimales, se analizandirectamente losforrajes y suplementos que consumen; sin embargo, para localizar ciertos problemas como serían las deficiencias o excesos de minerales, algunas veces hay que tomar muestras y analizar el suelo. Para fines de nutrición, se pueden seleccionar los sitios de muestreo de la mismamanera como se eligen los de forrajes. Se toman las muestras a una profundidad de 10 cm, utilizando un taladro para suelos o un muestreador cilindrico. Lamuestra compuesto debe ser mezclada perfectamente deshaciendo los terrones. Eltamaño de muestra que se envía al laboratorio es de aproximadamente 500 g. Enelsiguiente cuadro se presentan en forma condensada los tamaños de muestras para ser enviadas al laboratorio. 19 TAMAÑO DE MUESTRA Y UPO DE ENVASE PARA MUESTRAS.1' UPO DE ALIMENTO TAMAÑO DELA MUESTRA (g) UPO DEENVASE Alimentos balanceados, suplementos y alimentos sólidos. 100 - 250 g Frascos de vidrio, plástico o nalgeno con tapa de rosca Bolsas de polietileno cerradas herméticamente1 Alimentos líquidos. 250 - 500 mi Frascos de vidrio, plástico o nalgeno con tapón de rosca1. Forrajes frescos, pastos, herbáceas y arbustivos. 150 - 250 g en base seca ó 500 - 1000 g en base húmeda Bolsa de papel grueso o tela Cuando se deshidrata, usar bolsa de polietileno o frasco de vidrio plástico o polietileno con tapón de rosca1. Forrajes henificados. 150 - 250 g Frasco de vidrio, plástico ó nalgeno con tapa de rosca Bolsas de polietileno. Forrajes ensilados. 500 - 1000 g en base húmeda. Frascos de vidrio, plástico o nalgene con tapa de rosca Bolsas dobles de polietileno grueso. Líquido rüminal. 300 - 600 mi para ovinos, 600 - 3000 mi para bovinos. Frascos de vidrio con tapa de rosca o tapa de hule bien asegurada Orina. 50 - 75 mi Frasco de vidrio con tapa de rosca Heces de bovino, ovino, cerdo o ave. 150 - 250 g en base seca Frascos de vidrio, plástico o nalgeno con tapa de rosca . Bolsas de polietileno. 1Cuando se van a determinar minerales es preferible usar nalgeno. 20 PREPARACION DE LAS MUESTRAS PARA ELANALISIS El tratamiento que se da a las muestras después delmuestreo es tan importante como el muestreo mismo, pues si la muestra no es tratada en forma adecuada los resultados de análisis no van a ser válidos. Por ejemplo, si se va a analizar un ensilaje y se pretende cuantifícar los ácidos grasos volátiles, lamuestradebe conservarse congeladapara evitarvolatilizaciones. Eluso . de unfrasco o una bolsasucia o malcerrada puedeprovocar un error importante en el análisis. Unamuestramalconservadano tendrá lamismacomposiciónque laqueha sido apropiadamente tratada para mantenerse inalterada hasta el análisis. Deshidratación. En términos generales el mejor método de conservación es la deshidratación. El agua contenida en el alimento no contribuye a su valor nutritivo y lo hace susceptible a fenómenos de descomposición porbacterias,hongos y enzimas tisulares. No siempre es posible deshidratar sin que la muestra sufra alteraciones. Se usa el término 'DESHIDRATACION" cuando se elimina la humedad por medios artificiales y "SECADO"cuando se realiza al sol o a temperatura ambiente. El secado por baja temperaturay bajapresión (LEOFILIZACION) o por extracción por solventes, sonmétodos que requieren equipos más especializados y generalmente tienen un costo mas alto. Cadauno tiene sus ventajas y desventajas, laselección del método dependerá no solo de las facilidades de que se disponga, sino del tipo de que se trate y del análisis que se realizará. La temperatura elevada durante la deshidratación altera la proteína del alimento, disminuyendo su digestibilidad (Porter y Rolls, 1972) y la disponibilidad de los aminoácidos, debido a la formación de compuestos insolubles entre los aminoácidos y los azúcares por reacciones de Maillard, lo que disminuye su valor nutritivo. Elcontenido de algunas vitaminas como la Bt A, D y C se disminuye. Se observan cambios en el olor y el color, registrándose obscurecimiento. En muestras con elevados contenidos de grasa es frecuente que se presente cierto tipo de enranciamiento. Enforrajes se ha observado que latemperatura altera elnitrógeno insoluble en ácido detergente, por la formación de compuestos semejantes a la lignina (Van Soest, 1965). En el secado al sol y a temperatura ambiente, la muestra se seca más lentamente y por lo tanto, sufre menos alteraciones debidas al calor. Sin embargo, dependiendo del tipo de producto de que se trate, puede haber desarrollado bacterias y hongos que lo dañarán. Tal es el caso de los tubérculos de yuca, que se ahongan cuando el secado no es rápido. Elsecado abajatemperaturay bajapresión (LEOFILIZACION) es probablemente elque menos daño causa a lamuestra, aunque no siempre es posible aplicarlo por eltipo de equipo que 21 se requiere. Las características de este tipo de deshidratación son las siguientes: 1." Es adecuada para todo tipo de alimento. 2.- El secado se realiza a temperatura y presión baja (menos de 4 mm de Hg). 3.- Es adecuada para deshidratar carne. 4.- El tiempo de secado es entre 12 y 24 horas. 5.- El agua se elimina por sublimación. 6.- El olor y color permanecen normales. 7.- Su costo es cinco a seis veces superior al de los métodos de deshidratación que aplican calor. En el secado por solventes, la principal desventaja es que el producto empleado va a arrastrar no solo el agua, sino también otros compuestos solubles en él. Refrigeración o congelación. La refrigeración o congelación de las muestras hasta el análisis, son procedimientos aplicados con frecuencia para la conservación de las muestras. En el caso de la refrigeración, latemperatura (1-5°C) puedeno ser lo suficientemente bajaparaprevenir deterioro por enzimas, bacterias y hongos; por lo tanto, su almacenaje deberá ser por períodos de tiempo cortos. La congelación que generalmente se realiza a(-10°C) sí permitelaconservación de lasmuestras por períodos de tiempo mas largos, aunque no todas las muestras la resisten sin alterarse. La congelación de las muestras deberá realizarse rápidamente para que no haya cambios en la composiciónde losnutrimientos. Si lacongelación serealizalentamentese observanfenómenos de proteóíisis y enranciamiento de grasas. Así mismo, hay pérdidas de vitaminas. Cuando la muestra va a ser conservada por congelación durante un tiempo largo, la temperatura de congelación deberá estar entre -20 y -30°C. Efecto de la temperatura sobre la composición química de la muestra. El efecto de la temperatura de secado de forraje sobre ladigestibilidad de laproteína ha sido estudiado por DuckworthyWoodham, 1961. Ellos encontraronquetemperaturas de 100°C disminuía la digestibilidad de la proteína, debido a formación de complejos no digeribles. 22 Van Soest (1965) encontró que la exposición de muestras de alimentos a altas temperaturas causabaunincremento en el contenido de la ligninasoluble enH2S04. Georinget al. (1972) compararon la digestibilidad in vitro de forrajes y ensilajes sobrecalentados, con algunas constantes químicas como PAREDES CELULARES, FIBRA ACIDO DETERGENTE (FAD), LIGNINA EN H2S04 y NITROGENO en el residuo de la FAD. Encontraron que el nitrógeno insoluble en FAD y el nitrógeno insoluble en pepsina eran muy afectados por el sobrecalentamiento. Georing et al. (1973) midieron como indicador del daño térmico, el nitrógeno ligado a la FND-N encontrando qué el secado por arriba de los 60°C por mas de 24 - horas, ya había daño térmico, el daño es mayor cuando la humedad del forraje varía de 20 a 70%. En base a esos estudios y nuestra experiencia en el manejo de muestras, la temperatura óptima de secado para forrajes es de 58 a 60°C por 48 a 72 horas. Uso de preservadores químicos. La conservación de las muestras con productos químicos es un procedimiento que se utiliza con cierta frecuencia en el laboratorio. El Comité de Aditivos de la Organización para laAgricultura y la Alimentación (FAO) y la Organización Mundial de la Salud (WHO) definen a los aditivos como "sustancias sin valor nutritivo, adicionadas a los alimentos para mejorar su apariencia, sabor,olor,texturay resistenciaalalmacenaje". Estadefiniciónno.consideraaquellas sustancias adicionadas con valor nutritivo, como son las vitaminas y minerales. Para la conservación de los alimentos que van a ser analizados pueden utilizarse los preservadores aceptados para alimentos y algunos otros que no lo son, siempre y cuando no afecten el análisis que se va a realizar. Los preservadores para laconservación de muestras de alimentos para animales pueden clasificarse en ácidos minerales y orgánicos, así como en sales y compuestos orgánicos diferentes. Las concentraciones que se aplican en el caso de los aditivos permitidos son: 1.- Acidos minerales: HC1, HN03, H3P04 y H2S04. Solución al 5%. Agregar en laproporción de 1:101asolución ácida a la muestra. 2.- Acidos orgánicos: Acido benzoico, ácido sórbico, ácido caprílico, ácido acético, ácido cítrico, ácido fosfórico. (Solución al 0.1%). 3.- Sales derivadas de ácidos: Propionate de calcio y sodio, sqrbatos de calcio y sodio, benzoato de sodio, bisulfito y metabisulfito de sodio. Estas sales generalmente se usan al 0.1%. 4.- Antioxidantes: Hidroxianisolbutilado(BHA).EntreO.Ol y0.02%. Hidroxitolueno burilado (BHT) no más de 0.01% de la grasa contenida. 23 5.- Dióxido de azufre o sulfito: de 200 a 300 partes por millón (ppm). El S02 no debe usarse en muestras en las que se va a determinar vitamina B2 (tiamina), porque la destruye. 6.- Tocoferol no mas de 0.3% de la grasa. Hay que tener presente que para laconservación correcta de las muestras, éstas deberán colocarse en el envase apropiado para el tipo de muestra, el análisis que se va a realizar, el tiempo que se va a conservar y elmedio de transporte que se va a emplear. Los envases usados con mayor frecuencia son los frascos de vidrio, plástico o nalgeno con tapones de corcho, látex, plástico o baquelita a presión o de rosca, bolsas de papel o polietileno. IDENTIFICACION DE MUESTRAS. La identificación apropiada de las muestras es un factor muy importante para los resultados del análisis. La identificación debe ser clara y precisa y contener todos los datos que ayuden a su clasificación. Debe estar visible y escrita de manera legible sobre un material que sea resistente a la humedad. Hayque utilizar tintas indelebles,no solubles en agua para que no se borren durante el manejo y/o almacenaje. Los datos que se anoten deben incluir: 1.- Nombre de la muestra o claves de identificación. 2.- Nombre del responsable de la muestra. 3.- Procedencia. 4.- Determinaciones solicitadas. 5.- Fecha de la toma de muestra. TECNICAS DE MUESTREO Y ENVIO DE MUESTRAS. El envío de la muestra debe realizarse también de manera que la muestra llegue en perfecta condición al laboratorio. Este envío puede hacerse utilizando diferentes medios de transporte, por lo que el método de conservación y el envase deberán ser congruentes entre sí. Preparacióny envío de alimentos balanceados, suplementos e ingredientes alimenticios sólidos. Tratándose de sófidos con menos del 10%de humedad, pueden envasarse en frascos de bocaancha de cualquiermaterial, con untapón apropiado. Espreferible que sea de roscaporque 24 es más seguro. Los frascos deben estar bien limpios y secos. Cuando van a realizarse análisis de minerales es mejor que el envase sea de nalgeno. Pueden utilizarse también bolsas de polietileno limpiasy bien cerradas. De ser posible use dos bolsas, cerrando cada una por separado. Dado que la muestra es muy estable en las condiciones en las que está, no es necesario aplicar otro método de conservación. Enel caso de que elcontenido de agua sea mayor a 10% podría se útil la deshidratación en estufa (60°C/8 horas) o secada al sol. Para concentrados líquidos, ya que se trata de productos con alto contenido de agua, el envasado deberá hacerse en frascos con tapón de baquelita de roscay la tapa interior apropiada para que no se deshaga con lamuestra.Elmétodo de conservación en términos generales puede ser congelación, refrigeración, deshidratación o con preservadores. Preparación y envío de forrajes. El contenido de agua de los forrajes frescos permite que se sigan llevando acabo procesos enzimáticos que deterioran lamuestra, por lo que si es posible,hay que deshidratarlos en estufa de aire forzado (60°C/72 horas) o secarlos al sol. Cuando la muestra va a ser enviada al laboratorio y no se puede secar antes del envío, colóquela en bolsas de papel grueso o de tela bien cerradas para impedir que se salga la muestra. Si se desea conocer el contenido de agua del material fresco, se puede pesar la bolsay el contenido al momento de enviarla. Luego se hace llegar este dato para que en el laboratorio se acabe de deshidratar y se pueda calcular la humedad déla muestrafresca. Deotramanera,en ellaboratorio únicamentese podrádeterminar la humedad de la muestra recibida. Nunca envíe al laboratorio muestras de forraje fresco en bolsas de polietileno ni en frascos, ya que se deteriorarán. No olvide anotar el dato de humedad cuando seque la muestra. Cuando se trate de forrajes henificados con un contenido de humedad menor de 10%, podrán envasarse en frascos o bolsas de polietileno. Los ensilajes deben ponerse en dos o tres bolsas juntas de polietileno grueso, bien cerradas o en frascos limpios, bien tapados con tapones de rosca. Deben congelarse inmediatamente después que se tomó lamuestra. Hay que recordar que al congelar la muestra, ésta aumentará de volumen, por lo que se debe dejar el espacio apropiado. Al enviarse las muestras de ensilaje, deberán mantenerse congeladas hasta su arribo al laboratorio. Preparación y envío de material biológico. Elanálisis de orinade animales es frecuentementerealizado en ellaboratorio denutrición, por loque lamuestra deberáconservarse apropiadamente. Cuando elanálisis que se vaarealizar en la orina es de nitrógeno, la muestra puede conservarse acidificándola o agregándole 25 preservador, refrigerándola o congelándolahasta que elanálisis se realice. Lamuestra se coloca en un frasco limpio con tappn 'de rosca. Agregue por litro de orina 5 mi de cualquiera de los siguientes reactivos: HC1al 50%, H2S04 al 10%; o solución que contiene 17.5 g de K2Cr207, 6.25 g de HgCl y agua para 100 mi. Lamuestra de orina se conserva bien almacenada en refriferación por varios días; si se desea almacenar por más tiempo es preferible congelarla. No olvide indicar al laboratorio la cantidad de preservador empleado. En cuanto a las heces, dependiendo del tipo de análisis que se va a realizar, la muestra puede deshidratarse en estufa a 60°C/4$ hpras, liofílizarse o acidificarse conH2S04. Elmétodo más común es ladeshidratación. Las muestras deshiq|ratadas deben conservarse en frascos bien tapados o en bolsas de polietileno bien cerradas, a temperatura ambiente. Cuando no se puede deshidratarla muestrade heces, hay que congelarlas entre -10 a - 15°Cparasu almacenamiento. Bibliografía Blaedel, W.J. and V.W. Meloche. 1966. Elementary quantitative analysis theory and practice. (2ndEd). Harper and Row, New York, U.S.A. Cooks, L.V. and Van Rede. 1976. Laboratory handbook for oil and fat analysis. (3ndEd). Academic Press, London and New York. Duckworth, J. and A.A. Woodham. 1961. Leaf protein concentrates effect of source of raw material and methodcof drying on protein value for chicks and rats. J. Sci. Fd. Agrie., 12:5. Goering,H.K.,C.H. Gordon,R.W. Hemken,D.R. Waldo, P.J. Van Soest andL.W. Smith. 1972. Analytical estimates of nitrogen digestibility in heat demaged forages. J. Dairy Sci., 55(9):1275. Georing, H.K., P.J. Van Soest and R.W. Hemken. 1973. Relative susceptibility of forages to heat damage as affected by moisture, temperature and pH. J. Dairy Sci., 56(1):137. N.R.C. 1962. Basic problems and techniques in range research. A reporter of a Joint Comities of the American Society of Range Management and the Agricultural Board, National Academy of Sciences. National Research Council, Washington, D.C. Publication No. 890. Porter, J.W.G. and B.A.Rolls. 1973. Proteins in humannutrition. Academic Press, NewYork. U.S.A. Van Soest P.J. 1965. Use of detergens in the analysis of fibrous feeds. IV Determination of plan cell wall constituents. J. Ass. Off. Agr. Chem. 48:785. 26 I ANALISIS PROXIMO Elanálisis de los alimentoshasido practicado porelhombredesde tiempos inmemoriales, los que podrían llamarse análisis organolépticos. Posteriormente los hebreos, cristianos y mahometanos introdujeron reglas con respecto al consumo de ciertos alimentos, basados principalmente en la experimentación con ellos (Jacobs, 1965). El análisis cuantitativo de los componentes de unalimento, sin embargo, probablemente se inició hasta 1775¡,en Inglaterra,cuando Pearsondeterminó las proporcionesde agua,almidón, materia fibrosa, majteria extractiva y cenizas en las papas. Reconoció también la presencia de grasas, ácidos y azucares. Entre 1840 y 1865 diferentes investigadores iniciaron los primeros estudios sistemáticojs de alimentosparahumanos y animales por métodosmás o menos similares a los empleados actualmente (Pearson, 1970). Un gran avance tuvo lugar en 1859-1861. Hennebergy sus colaboradores en la estación agrícola de Weendé, Alemania, elaboraron los métodos para el análisis próximo o proximal de un alimento. Un análisis próximo se distingue de un último en que no determina un elemento o compuesto particular, sino que es una estimación de un cierto tipo de componentes "materia volátil" "humedad"! "cenizas", materia nitrogenada, etc. (Jacobs, 1965). i Podría definirse el análisis próximo como un "esquema de análisis químico mediante el cual se determina la composición de un alimento en término de sus principales grupos de nutrientes". En otras palabras, evalúa la calidad de un alimento en función de grupos de compuestos con calracterísticas físico-químicas semejantes, pero con diferente valor nutritivo. i A pesar de las limitaciones que tiene el análisis proximal, éste ha sido por más de un siglo el punto departida en laevaluaciónde unalimento,yaunque los métodos de análisis hayan cambiado, el fundamento permanece intacto. El análisis próximo consta de las siguientes determinaciones: humedad, proteína cruda, materia mineral o cenizas; grasa cruda o extracto etéreo, fibra cruda ¡y por diferencia a 100, extracto libre de nitrógeno. En laaplicación de los métodos para el análisis próximo debe tenerse cuidado en seguir el método lo más fielmente que se pueda a lo sugerido, ya que algunos de ellos, como la fibra cruda, son empíricos y cualquier cambio en laconcentración de los reactivos o en eltiempo de digestión, va a alterár los resultados. Unincremento en latemperatura de igniciónde lamuestra para la determinación de cenizas o material mineral (se sugiere 550-600°C) puede provocar volatilizaciones de 'sales minerales y dar resultados erróneos. i ¡PARA HACER CAMBIOS O MODIFICACIONES EN LOS METODOS, ESTOS DEBEN SER RACIONALES Y TOMAR EN CUENTA EL EFECTO DE TAL MODIFICACION!, 27 Humedad El agua es un nutriente esencial que el animal necesita en cantidades relativamente grandes. Sin embargo, el agua no contribuye al valor nutritivo de un alimento, excepto en condiciones especiales de aridez. Por el contrario, diluye el contenido de nutrientes sólidos y los hace más susceptibles de sufrir fenómenos de descomposición por enzimas tisulares, bacterianas o de hongos. Proteína cruda Dado que el elemento característico de las proteínas es el nitrógeno, los métodos de cuantificación de proteínas se basan esencialmente en la determinación del contenido de nitrógeno, suponiendo que todo el nitrógeno está en forma de proteína. Cuando la muestra contiene nitrógeno de otras fuentes como urea, frecuentemente adicionada en raciones para rumiantes, o aminas y amidas provenientes de la descomposición de proteína, el método de Kjeldahl sobreestimará el contenido de proteína. Extracto etéreo o grasa Los aceites y grasas presentes en la muestra seca se extraen para cuantifícarse con un disolvente orgánico, éter etílico o de petróleo. Por este método se extraen también otras substancias solubles en estos disolventes como ceras y pigmentos. En el caso de forrajes verdes ricos en clorofila y pigmentos, el método descrito sobreestima el contenido de grasa. Material mineral Es el residuo de lacalcinación de lamuestra, o sea, laeliminaciónde lamateriaorgánica. Nutricionalmenteestafracción es demasiado crudaycarecede importancia,yaque no indicaqué minerales la componen y en qué proporciónse encuentran. Sin embargo, es el punto de partida en la determinación de minerales específicos y además es necesariaparael cálculo de lamateria orgánica de un alimento. Fibra cruda Esunamezclaheterogénea de glúcidos (celulosayhemicelulosa)y otros materiales como lignina, esencialmente indigeribles por animales de estómago simple. Los métodos de análisis establecidos sugieren undoble digestión, con ácido sulfúrico e hidróxido de sodio, sin embargo se ha probado que la combinación de las dos digestiones disuelve hasta el 80% de la hemicelulosa, del 20-50% de la celulosa y del 50-90% de la lignina presente en la muestra, lo que subestima el contenido de la fibra cruda (Adenskóg, 1977). 28 Extracto libre de nitrógeno Este valor sé estima por diferencia restando de 100 los porcentajes de humedad, proteína cruda, extracto etéreo, fibra cruda y materia mineral. Está constituido por almidones, azúcares solubles,pectinas,ácidosorgánicos,mucílagosytambiénincluyecantidades variables decelulosa y lignina. Esta forma de calcular los glúcidos aprovechables, como puede apreciarse, es sumamente deficiente ya que adiciona las deficiencias de los otros métodos de análisis, como - demostraron Hennébergy Stohman (1869). Ellos revelaron que únicamente del 39 al 67% del extracto libre de nitrógeno era digerido o no recobrado, mientras Maynard (1940) apunta que ningún grupo de nutrientes que comprende hasta el 80% de los nutrientes totales en alimentos para animales debe ser determinado por diferencia, Enlafigurad se presentaunesquema del diagrama de flujo del ANALISIS PROXIMAL. Losmétodos que sé describen a continuaciónson los "Oficiales" sugeridos por elA.O.A.C. para el análisis, con algunas modificaciones. La forma de recolección de los resultados del análisis es diferente en cada laboratorio. Se puede usar una hoja de registro para cada muestra que al mismo tiempo, que sirve para anotar los datos durante el análisis, también se usapara llevar unarchivo de resultados.Unejemplo de una hoja de trabajó para el análisis, donde se tiene el registro de la muestra y al mismo tiempo de anotan los dato? durante la ejecución del análisis y los resultados del mismo, se presentaen la figura 7. i I I 29 FIGURA 6. ESQUEMA DE FLUJO DEL ANALISIS PROXIMO O PROXIMAL. MUESTRA SECADA AL AIRE Secada a 105°C ÿ MUESTRA LIBRE DE HUMEDAD Kjeldahl PROTEINA CRUDA Extracción con éter (— ÿ- Extracto etéreo ÿ_I_ RESIDUO LIBRE DE GRASA Hervido en ácido I T Hervido en álcalis -ÿ- FIBRA CRUDA + CENIZAS Incinerado a 580°C CENIZAS FIBRA CRUDA 30 FIGURA 7 . HOJAS DE REGISTRO DE ANALISIS Muestra # 1 Nombre: Seca ( ) Origen Húmeda ( ) Entregado por: Tipo de análisis : Solicitado por: Fecha: Analista responsable: DETERMINACIONES: Rept.1|Rept.2 Humedad No. de crisol Base húmeda* Peso de crisol Peso de crisol + muestra Peso de crisol + muestra seca Humedad, % Proteina No . del papel Peso del papel Base seca ¡ Peso del papel+muestra seca Base húmeda mi de HCl | Normalidad del ácido 1 Proteina, % ! No. del crisol Cenizas Peso del crisol Base seca 1 Peso del crisol+muestra Base húmeda ¡ Peso del crisól+cenizas | Cenizas , % 1 No .del papel ! Peso del papel Grasa cruda Peso del papel+muestra Base seca Peso de vasb Base húmeda ! Peso de vaso+grasa Grasa/ % Fibra cruda No. del crisol Base seca Peso de crisol+muestra seca Base húmeda Peso del crisol+cenizas Fibra cruda, % E.L.N. i Base seca Base húmeda * Base húmeda o tal como recibida. 31 Bibliografía Adenskog, G. 1977. Which methods of fibre analysis "in Focus". June Tecator - Hoganas, Sweden. A.O.A.C. 1990. Officialmethodsofanalysis oftheAssociation ofOfficialAnalytical Chemists, (15th Ed.). Arlington, U.S.A. Bateman,J.V. 1970. Nutriciónanimal. Manualde métodosanalíticos.HerreraHnos.Sucesores, S.A., México. Herrera, R.S. 1980. Una modificación de la técnica para la determinación de fibra cruda en pastos, Rev. Cubana Ciec. Agrie., 14:61. Jacobs, M.B. 1965. The chemical analysisoffood andfood products, (SÿEd.ÿD. VanNostrand Company, Toronto, Canada. Maynard, L.A. 1940. Nitrogen-free extract in animal nutrition. J. Ass. Offic. Agr. Chem., 23:156. Pearson, D. 1970. The chemical analysis of foods. ChemicalPublishing Company Inc.,New York. Van Es, A.J.H. and J.M. Van derMeer. 1980. Methods of analysis for predictingthe energy andproteinvalue of feeds forfarmanimals.EuropeanAssociation forAnimalProduction. Munich, Federal Republic of Germany. 32 DETERMINACION DE AGUA O HUMEDAD i A.O.A.C. 1990. Official methods ofanalysis ofthe Association ofOfficialAnalytical Chemists (15th Ed.), |Arlington, U.S.A. Estos métodos determinan el agua contenida en los alimentos. Método 1: ! Seque en cápsulas de aluminio aproximadamente 2 gde muestras (hastaunpeso constante) a 95-100°C en unhomo, cuyapresión interiorno exceda de 100 mm Hg. Laoperación requiere unas 5 horas. Considere como humedad la pérdida de peso. Elmaterial seco puede utilizarse para la determinación de grasa cruda. Para alimentos ricos en melaza, la presión interior del homo no debe seif superior a 70 mm. Método 2: ¡ ! Es similar al ijnétodo 1, pero es calentado a 100-105°C en homo a presión atmosférica durante 18 horas. : El residuo también puede usarse para la determinación de grasa cruda. t Método 3: ¡ ! Es similar al método 2, pero es calentado a 135°C± 2°C, durante exactamente 2 horas. El material seco no debe usarse para la determinación de grasa erada. Nota: LaAsociaciónEuropea paraProducciónAnimal (VanEs-Van der Meer, 1980) sugiere que el contenido de agua de alimentos secos al aire se realice por secado en estufa a 103 ± 1°C durante 4 horas, y'que aquellas muestras ricas en azúcares o grasas deben secarse al vacío a 80 ±2°Cdurante 4 horas. Enambos casos podría sernecesario prolongar eltiempo de secado por una hora más, para asegurar que el secado fue completo. ¡Evite errores, nó sobrecargue la estufa de secado !. Para la determinación de humedad, también se usan otros métodos como los siguientes: i ! 1.- Destilación volumétrica usando TOLUENO. ! 2.- Método electrónico usando CONDUCTIVIDAD. 33 Cálculos para determinar el porcentaje de humedad por dos métodos. Método A: Crisol + Crisol + Muestra - Muestra Húmeda Seca -X 100 = % Humedad. Peso de Muestra Húmeda Método B: Crisol + Crisol Muestra - Vacío Seca -X 100 = % Materia Seca. Peso de Muestra Húmeda 100 - % de Materia Seca = % Humedad. 100 - % de Humedad = % de Materia Seca (MS) DETERMINACION DE HUMEDAD APARENTE Para forrajes frescos, ensilajes, hecesy alimentos con más de 10% de humedadse deben seguir los siguientes pasos: 1 Enbandejas de aluminio o en bolsas de papel o tela, coloque la muestra pesada después de haber tarado el recipiente. 2.- Coloque las muestras al horno a una temperatura NO MAYOR DE 60°C por aproximadamente 48 a 72 horas. 3.- Permita que la muestra, al salir del horno, entre en equilibrio con la humedad ambiente poruñas 4-6 horas. Pésela, calcule laHUMEDAD PARCTALyregistre este dato (ES MUY IMPORTANTE). 4.- Muela la muestra en un molino de cuchillas o de martillos provisto de una zaranda de 20 Mesh, colóquela la en una bolsa de polietileno, regístrela e identifíquela con su respectivo número. Las muestras de concentrados, pastos, ensilajes y heces así obtenidas, se conocerán de aquí en adelante como "MUESTRA HUMEDA". 34 FORMAS DE EXPjRESAR EL CONTENIDO DE MATERIA SECA DE LOS ALIMENTOS La composición de los alimentos puede estar expresada en una o más de las tres formas de materia seca. ¡ 1.- COlvjlO ALIMENTO. También llamado como "BASEFRESCA". El contenido de niateria seca de diferentes alimentos puede oscilar de 0 a 100%. 2.- SECADO ALAIRE. Puede ser la base actual o un "CONTENIDO ASUMIDO DE MATERIA SECA" como es el 90%. Esta base se usa para comparar la composicióndealimentos quetienendiferentes contenidosdehumedad. Muchos alimentos, pero no todos, son usados en un estado de "SECADO AL AIRE". 3.- SECADO AL HORNO. Se basa en el estado de 100% (MS) o sea, libre de humedad. También se emplea para comparar alimentos a diferente contenido de humedad. Las diferentes bases se ilustran a continuación: Como alimento Secado al aire Secado al homo % de agua j % variable 10% 0% i i % proteína cmda. % extracto etéreo. % fibra cmda % E. libre de nitrógeno. % de cenizaís. Los datos siempre se dan como: materia seca. Esto es: 100 - % de agua 90% 100% 35 " 1 Los componente de un alimento expresados en unabase puedenser convertidos a otra, mediante el empleo de una simple relación: % de un componente de % del componente en el un alimento en una base alimento en otra base % de MS del alimento % de MS del alimento sobre la misma base en otra base por ejemplo: Si elalimento contiene 4% de proteínacruda enbase fresca(75 %de agua), elporcentaje de proteína cruda sobre la base secado al aire (90%), se calcula de la siguiente forma: 100% - 75% = 25% de MS en base fresca. 4 X 25 90 25X = 360 X = 14.4 (% de proteína cruda del alimento sobre la base secado al aire). La deteiminación de la materia seca no siempre es tan fácil, ya que la mayoría de los tejidos vegetales frescos contienen algunos compuestos volátiles. Algunas plantas contienen grandes cantidades de aceites indispensables, terpenos, etc., que pueden perderse durante el secado,y por consiguiente, proporcionarunarespuesta errónea con los procedimientosusuales. Losensilajes y otrosproductos fermentados puedencontener grandes cantidades de compuestos que se evaporan fácilmente, como ácidos grasos volátiles (acético, propíonico, butírico) y amoníaco. Además, algunos azúcares se descomponen y muchas proteínas se pueden volver parcialmente insolubles. La temperatura de secado no debe exceder de 60°C. 36 DETERMINARONDEMATERIA INORGANICA(CENIZAS) Y MATERIA ORGANICA | A.O.A.C. 1990. Official methods of analysis ofthe Association ofOfficial Analytical Chemists (15* Ed.) [Arlington,-U.S.A. i ¡ Este método cuantifica la materia inorgánica total de los alimentos. 1.- Pese aproximadamente2 gde muestraen uncrisol deporcelanay calcine durante3 horas en mufla pjrecalentada a 550-600 °C. 2.- Enfrie el cifisol en un desecador y pese rápidamente calculando elporcentaje de cenizas hasta la prjimera cifra decimal. Nota: j LaAsociación Europea para ProducciónAnimal (Van Es Van-der Meer, 1980) sugiere que la calcinación se realice a 550°C por 3 horas, aumentando una hora más si no se han eliminado todas lás partículas de carbón. Evite sobrecargar lamuflay no laabra durante las 3 horas de ignición de lamuestra,para evitar pérdidas de la misma. Cálculos | Peso del I Crisol + Cjenizas Peso Muestra ( en gramos) Materia cjrgánica de la muestra húmeda ¡ ¡ Materia Orgánica en base Materia Seca ¡ i ¡ 37 I Peso del Crisol vacío _ X 100 = % de Cenizas = 100 - % de Cenizas % de Cenizas = 100 - _ % de MS de la muestra DETERMINACION DE PROTEINA CRUDA Método de Kjeldahl A.O.A.C. 1990. Officialmethods of analysis ofthe Association ofOfficialAnalytical Chemists (15fc Ed.) Arlington, U.S.A. Este método determina el nitrógeno total en forma de amonio de los alimentos, sin diferenciar si proviene de proteínas, aminoácidos, aminas, amidas, glucósidos nitrogenados, glucolípidos, vitaminas del complejo "B" y ácidos nucléicos. En las condiciones en que se realiza la prueba no determina el contenido de nitrógeno en forma de nitratos o nitritos. Reactivos 1.- Acido sulfúrico concentrado (93-95 %), Q.P. 2.- Catalizador; mezcla de K2S04 o NaÿCÿ anhidro con CuS04 5H20 en proporción 9:1. 3.- Solución de hidróxido de sodio aproximadamente ál 40% (4.0 kgNaOH en 10 litros de H20). La densidad de la solución debe ser de 1.36. 4.- Zinc en granulos o piedritas de cuarzo. 5.- Solución de ácido bórico ql 4% ( 40 g de H3B03 en un litro de H20). 6.- Solución 0.1 Nde HC1o H2S04, titulada conNaÿCÿ,anhidro, usando naranja de metilo como indicador. 7.- Solución indicadora de rojo de metilo-verde de bromocresol. Mezcle 1parte de una solución alcohólica de rojo de metilo al 0.2% con 5 partes de una solución alcohólica de verde de bromocesol al 0.2%. Digestión 1.- Pese exactamente 1.0 a 2.0 g de muestra sobre una hoja de papel filtro, doble cuidadosamenteelpápele introduzcael conjunto en unmatrazKjeldahlde 500 u800mi. 2.- Añada, aproximadamente, 6 g de catalizador. 3.- Añada 20 mi de H2SQ4 concentrado. 38 4.- Lleve elmatraz de Kjeldahlal digestor, y caliente primeramente a temperatura moderada hasta que la formación de espuma cese y después a modo de mantener una ebullición activahastá que lasolución se clarifique. Continuar por 15-20minutos más, después de alcanzar éste punto. 5.- Dejar enfilar el matraz de Kjeldahl. Puede suspenderse en este punto, dejado los matraces debidamente tapados con tapón de hule. Reacciones químicas! R-NH, + H,SO. Destilación 1.- so2 + so3 + (NH4)2S04 2.- 3.- 4.- 5.- 6.- 7.- Coloque 5p mi de solución de ácido bórico en un matraz Erlenmeyer de bocaancha de 500 mimarcado a 225 mi. Asegúrese de que lapuntadelcondensador seencuentre bajo la superficie del líquido en el Erlenmeyer. Introduzca, unas 8 o 10 piedritas de cuarzo al matraz Kjeldahl. Adicione 300 mi de agua destilada al matraz de Kjeldahl. Sosteniendo elmatrazKjeldahlenposicióninclinada,añadacuidadosamente unamezcla de 100 mi dos capas. de solución deNaOHal 40%, a modo que resbale por las paredesy se formen Conecte inmediatamente el matraz de Kjeldahl al destilador, y mezcle su contenido mediante agitación rotatoria caliente hasta que todo elNH3 haya sido destilado (200 mi de destilado son generalmente suficientes). Baje elmatraz Erlenmeyer de manera que el extremo del condensador quede fuera de la solución de ácido bórico y apague el sistema de calentamiento. Enjuague con agua ÿ a punta del condensador. prueba en blanco con todos los reactivos y el papel, pero sin muestra por lo destilada Haga una menos una vez al día y cuandp se cambien reactivos. Reacciones químicas. + H20 + NaOH(NH4)2SO NH3 + H, NH3 + H20 + Na2S04 O + h3bo3 nh4h2bo3 39 Titulación L- Titule con la solución 0.1 N de ácido clorhídrico o sulfúrico, el contenido del matraz Erlenmeyer, hasta el cambio de color del indicador. 2.- Substraiga de esta cifra el volumen de ácido estándar necesario para neutralizar elNH3 producido poruña determinación en "blanco", en la cual se usan todos los reactivos en igual cantidad y como muestra una hoja del mismo papel filtro. Reacciones químicas. NH4H2B03 + HC1 -- H3BO3 + NH4C1 Cálculos mi ácido x N del ácido x MeqN(0.014) x 100 % N =-:- peso de la muestra (en gramos) Proteína cruda = % Nx 6.25 Proteína cruda en base Materia Seca: % de proteína cruda de la muestra secada al aire % de Materia Seca de la muestra secada al aire Notas: 1.- La cantidad de H2S04 necesaria para obtener una digestión completa de la muestra es variable y depende de la composición de lamisma. Un gramo de grasa consume 12 mi y un gramo de carbohidratos 6 mi de H2S04 durante la digestión. 2.- Para análisis de nitrógeno en orina: Tome alícuotas de 5 - 25 mi de orina. Agregue 2 mi de H2S04 concentrado y evapore hasta que quede una cuarta parte de la solución. Agregue 18 mimás ácido y el catalizador. Siga laprueba como ya se indicó. No olvide, al hacer los cálculos, tener en cuenta la dilución que sufrió la muestra por la adición de los preservantes. 3.- LaAsociaciónEuropeadeProducciónAnimal(1980) sugiere como catalizador elsulfato de cobre. Sostienen que el Hgy Se son muy contaminantes. 40 4.- Si se quiere determinar también nitrógeno de nitratos, deberá adicionarse un reductor durante la digestión como tiosulfato de sodio o polvo de cinc. Consulte la técnica específica. 5.- Cuando se usa ácido bórico durante la destilación, hay que titular los matraces inmediatamente, ya que a temperaturas superiores a 25°C suele haber pérdidas de nitrógeno. 41 DETERMINACION DE EXTRACTO ETEREO O GRASA CRUDA A.O.A.C. 1990. Officialmethods of analysis ofthe Association ofOfficialAnalytical Chemists (15* Ed.) Arlington, U.S.A. Reactivos Eter etílico anhidro, éter de petróleo o hexano. Procedimiento 1.- Extraiga en un aparato soxhlet o goldfisch aproximadamente un gramo de muestra "Secada al aire", con 30 mi de éter etílico anhidro, en un dedal de papel filtro que permita el paso rápido del disolvente. 2.- El tiempo de extracción puede variar desde 4 horas avelocidad de condensación de 5 a 6 gotas por segundo, hasta 16 horas, 2 a 3 gotas por segundo. 3.- Elmétodo del A.O.A.C. recomienda extraer por 6 horas a una velocidad de 3 a 4 gotas por segundo. 4.- Recupere el éter y evapore el éter residual sobre baño maría en un lugar bien ventilado; seque el vaso con todo y el residuo a 100 - 105°C durante 6 horas, enfríe y pese. Notas: 1.- Grandes cantidades de componentes solubles en agua como carbohidratos, urea, ácido láctico, glicerina y otros pueden interferir con la extracción de grasa; si ése es el caso, extraiga 2 g de muestra sobre un papel filtro en un embudo pon cinco porciones de 20 mi de agua antes de secar la muestra para determinar el extracto etéreo. 2.- Si va a determinar la grasa a heces o dietas que contienen sales de Ca o Mg probablemente haya formación de jabones, los cuales no son solubles en los mismos solventes. En tal caso, es necesario hacer una hidrólisis ácida de la muestra antes de la extracción. Debido a que la hidrólisis ácida extrae también fosfolípidos, glucolípidos y lipoproteínas, se podría hacer una primera extracción, hidrolizar y volver a extraer. 3.- Muestras ricas en grasa en ocasiones requieren una extracción antes de secado y una segunda extracción después. 42 4- LaAsociación Europea de ProducciónAnimal (Van Es y Van-der Meer, 1980) sugiere el uso de éter de petróleo o de hexano, arguyendo que el éter etílico extrae otras substancias aparte de la grasa como azúcares y pigmentos. Además, lo recomienda por razones de seguridad, ya que el punto de ebullición del éter etílico es 35°C y el del éter de petróleo y hexano es de 55 a 65°C, aunque para realizar la extracción con estos solventes se requiere mayor temperatura. Cálculos (vaso + grasa - vaso vacío) X 100 % de Extracto etéreo =- peso de muestra en (g) % de Extracto etéreo en lamuestra secada al aire % de Extracto etéreo en base M.S, =-- % de Materia Seca de la muestra secada al aire 43 DETERMINACION DE FIBRA CRUDA A.O.A.C. 1990. Officialmethods of analysis oftheAssociation ofOfficialAnalytical Chemists (15th Ed.) Arlington, U.S.A. Este método cuantifíca las substancias resistentes a la digestión acida y alcalina de la muestra. Reactivos 1.- Solución 0.255 N de H2S04 (1.25 g de H2S04/100 mi de agua). 2.- Solución 0.313 N de NaOH (1.25 g de NaOH/lOO mi de agua libre de carbonatos). 3.- Alcohol metílico o etílico. Digestión ácida 1 Pese alrededor de un gramo de muestra, extráigala con éter etílico y transfiérala aunvaso de precipitado de 600 mi. Si la muestra original contiene menos de 1% de grasa, la extracción se puede omitir. 2- Añada, 200 mi de solución sulfúrica hirviente. Coloque inmediatamente el vaso en el digestor precalentado y hierva exactamente por 30 minutos. 3.- Filtre el contenido del vaso a través de un embudo que tenga tela de algodón resistente y lave con cuatro porciones de agua hirviente de 50 mi, cada uno,hastaque se neutralice elpHácido (use papeltornasol azul). Elfiltrado tambiénpuederealizarsesobre embudos tipo Buchner cubiertos con un círculo de tela de alambre de malla del No. 200. Los embudos tipo Oklahoma (Labconco Corp.) o California (Nalge Co.) son adecuados. Digestión alcalina 4.- Transfiera el residuo de la filtración anterior al mismo vaso de precipitado. Añada 200 mi de solución de NaOH hirviente y herva exactamente por 30 minutos. 5.- Filtre el contenido del vaso como quedó indicado en el inciso (3) de la digestión ácida, lavando con una porción de 25 mi de solución sulfúrica caliente, seguida de porciones de 50 mi c/u de agua hirviente hasta netraulizar el pH alcalino (use papel tornasol rojo) y finalmente, con 25 mide alcohol. En este paso se puede filtrar sobre papel filtro, libre de cenizas de retentividad media. 44 Secado y calcinación 6.- Seque el crisol con su contenido a 100 - 105°C durante 12 horas, enfríe en desecador y pesar. 7.- Calcine a 580°C por 3 horas, enfrie en desecador y pese nuevamente. Cálculos (crisol + residuo seco) - (crisol + cenizas) X 100 %de fibra cruda -- peso de muestra (g) Nota: 1.- En la literatura existen trabajos en los que se han hecho modificaciones al método de fibra cruda como son el método dp Herrera (1980), que utiliza soluciones más concentradas peroconmenortiempo de digestión. Elanalistadebe decidirelmétodoque seguirá, y siempre debe informar el tipo de modificaciones. EXTRACTO UBRE DE NITROGENO (ELN) % ELN = 100 - (% H+ % M.M. + % P.C. + % E.E. + % F.C.) % H =% Humedad % M.M. = % Material mineral o cenizas % P.C. = % Proteína cruda % E.E. = % Extracto etéreo % F.C. — % Fibra cruda 45 DETERMINACION DE LA ENERGIA GRUESA O BRUTA AST1VL 1974. Standards for bomb calorimetry and combustion methods. American Society for Testing and Materials. Philadelphia, Pa., U.S.A. Con este método se determina el calor de combustión total de alimentos. Lacombustíón- se realiza bajo una atmósfera rica en oxígeno. El calor producido se mide como la diferencia en la temperatura antes y después de realizar la combustión. Aparatos y Reactivos 1 Calorímetro conbombade oxígeno,tipo adiabático (CalorimeterOxigenBomb,Adiabatic type, automatic temperature control with Double Valve Bomb Parr Serial 1241, Parr Instrument Co. o equivalente). 2.- Calentador de agua para el calorímetro (Parr Serial 1541 - Parr Instrument Co. o equivalente). 3.- Prensa para pastillado (Parr Serial 2811 - Parr Instrument Co. o equivalente). 4.- Un tanque de oxígeno. 5.- Carbonato de sodio 0.072N (disuelva 3.84 de NasCCÿ, previamente deshidratado a 100°C/2 hrs., en un litro de agua recientemente hervida y fría). 6.- Solución indicadora de naranja de metilo o rojo de metilo, al 0.1% en agua. 7.- Acido benzoico RA, estándar para calorimetría. 8,- Alambre de fusión de cromo-níquel (Parr 145C10 o equivalente). Preparación de la muestra Muelalamuestraen unmolino de cuchillas con criba de 1mm. Eltamaño de lamuestra debe ser tal que no contenga más de 7,000 calorías. Generalmente la muestra es de más o menos un gramo. Haga una pastilla del alimento o de las heces y colóquela en una de las cápsulas del aparato pesadas previamente;pese lapastilla. Maneje siempre lacápsula conpinzas, nuncacon las míanos. 46 Ponga la cápsula dentro de la bomba sobre el soporte y coloque un mi de agua en el fondo de la bomba. Instaleel alambre de fusión en posicióncorrecta en los electrodos. Cierre la bomba y pásele de 25 a 35 atmósferas de oxígeno. Sitúe la bomba dentro de la cubeta que contendrá exactamente 2 kg± 0.5 g de agua (pese la cubeta y agregue 2 kgde agua destilada). Ubique la cubeta en su posición en el baño de agua. Encienda el aparato para que trabajen los agitadores. Ajuste la temperatura del baño a la de la cubeta que contiene la bomba, por comparación de los termómetros respectivos. Si el calorímetro es de tipo automático, el ajuste se hace con facilidad, ya que está controlado eléctricamente. Una vez establecida la temperatura ± 0.01°C en la cubeta y en el baño, accione el mecanismo de igniciónpor lomenos durante 4minutos. Lacombustiónde lamuestraprovocará un aumento en la temperatura del agua de la cubeta que contiene labomba, aproximadamente 20 segundos después de la ignición. Elincremento en latemperatura será rápido al principio y más lento a medida que se empieza a estabilizar. Si se usa el calorímetro automático, el incremento en la temperatura de la cubeta es compensado inmediatamente por mecanismos eléctricos. Si el calorímetro es manual, eloperador debe aumentar la temperatura delbaño para igualar los termómetros. Los termómetros deben ser ajustados paraevitar en lo posible errores por separación de las columnas de mercurio (el aparato automático tiene unvibrador parabajar las columnas). Después de que la temperatura de la cubeta se ha estabilizado por lo menos durante 2 minutos, lea y registre la temperatura final a un décimo de la división más pequeña en que estén graduados los termómetros (Tf). El método en estas condiciones se reduce a los siguientes pasos: 1.- Acople el calorímetro y encienda elaparato para que empiecen a trabajarlos agitadores de la cubeta y del baño. Ajustar la temperatura del baño a la del agua de la cubeta. 2.- Si el calorímetro es automático, permita que el aparato haga el ajuste fino de la temperatura. Pongaelmarcador de tiempo tan pronto como se igualen los termómetros. 3 .- A los 4 minutos,baje lacolumna demercurio de lostermómetros con elvibrador, registre latemperatura de lacubeta (ti)y accione launidad de igniciónparainiciar lacombustión de la muestra. 4.- A los 13 minutos (exactamente 9 minutos después de iniciarla ignición),ponga otra vez el vibrador a los termómetros y tome la lectura final de la temperatura (Tf). No es necesario esperar más tiempo. 5.- Purgue el baño de agua, abra elcalorímetro, saque la cubeta, abra labombay realice las determinaciones para efectuar las correcciones correspondientes. La energía bruta de una muestra es igual a la cantidad de calor liberado cuando la muestra se quema completamente enlapresenciade oxígeno. Enestas condiciones,elnitrógeno y el azufre son liberados como óxidos gaseosos. Bajó las condiciones que se emplean en el 47 calorímetro, la oxidación continúay forma productos muy oxidados que sondisueltos en el agua que existe en labomba. Por lo tanto, es pecesariohacer unacorrecciónpara lasdiferencias entre los calores de formación en ambos casos y para el calor de la solución (Bateman, 1970). 1.- Titulación del ácido. Lave con un chorro de agua destilada el interior de la bomba y la cápsula que contenía la muestra. Recoja en un vaso de precipitado de 250 mi los líquidos de lavado y agregúele unas gotas de indicador de naranjado o rojo de metilo. Titule con la solución de carbonato de sodio 0.0725N. 2.- Meda el alambre de fusión que no se quemó y que debe estar aún unido a los electrodos de la cápsula de la muestra. . Registre los centímetros de alambre residual. Esta corrección se puede evitar si se usa alambre de platino para fusión. 3.- Corregir por azufre. Si el contenido de azufre de lamuestra es superior a 0.1%, hayque determinarlo gravimétrica, volumétrica o nefelométricamente. Estandarización del calorímetro Elcalorímetro se estandarizaconácido benzoico (elcualesproporcionadoconelaparato) o con 2,2,4 trimetilpentano (isoctano). El ácido benzoico para estandarizar calorímetros generalmente se adquiere en forma de tabletas, porque son más fáciles de manejary se queman más lentamente que el polvo, con lo que se reducen los errores de combustión incompleta. Eltérmino estandarización se usa aquí para conocer larespuesta del calorímetro con una muestra conocida, de lacual puede ser determinado el equivalente en energía o la capacidad de calor efectivo del sistema. El equivalente en energía (W) del calorímetro es la energía necesaria para incrementar la temperatura un grado expresado como calorías, bien sea por grado Celsius o por grado Fahrenheit. Para estandarizar el aparato se sigue un procedimiento semejante al descrito para la prueba. Use una tableta de ácido benzoico, la cual debe pesar no menos de 0.9 gy no más de 1.25 g. Siga el procedimiento descrito para la muestra, registrando la temperatura inicial, temperatura final, los mililitros de Na2C03 empleados en la titulación y los cm del alambre residual. Calcule el equivalente en energía siguiendo la fórmula: Hm + e1 + e2 W =- t 48 W = Equivalente energía del calorímetro en calorías por grado centígrado o calorías por grado Fahrenheit. H= Calor de combustión de la muestra de ácido benzoico en calorías por gramo. Generalmente es considerado como 6 318 Cal/g. m = gramos de ácido benzoico usados en la prueba. t = Diferencia en grados centígrados o fahrenheit entre la temperatura final e inicial. e1= Corrección por calor de formación de ácido nítrico en calorías. ParaNaÿCÿ 0.0725N es generalmente considerado como 1 cal/ml. e2= Corrección por calor de combustión del alambre de fusión en calorías: El alambre de cromo-níquel es equivalente a 2.3 cal/cm. Cálculos del calor de combustión de la muestra Los siguientes datos deben obtenerse para el cálculo: Ti = Temperatura inicial de la cubeta corregida de acuerdo al factor de corrección de los termómetros (éste dato es proporcionado por el fabricante con cada termómetro). Tf = Temperaturamáxima, corregida de acuerdo al factor de corrección alcanzada después de iniciar la ignición. C1 = Equivalente en calorías por formación de HN03 (mi de NaÿOg 0.072 N= una cal.) C2 = Equivalente en calorías por formación de H2S04 (14 x %de azufre en la muestrax gramo de muestra). ÿ C3 = Equivalente en calorías por el calor de combustión del alambre de fusión usado (centímetro de alambre consumido =2.3 cal si se usó el alambre de cromo-níquel. Si se usó alambre de platino muy fino, la corrección es cero calorías. W = Equivalente en energía del calorímetro en calorías por grado centígrado o fahrenheit m = Peso de la muestra en gramos. Tf - Ti H =- m H= Calor de combustión de la muestra. 49 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD INHIBIDORA DE TRIPSINA AOCS. 1980. Official and tentative methods ofthe American OilChemists Society, Champaign 111, USA. Este método determina los inhibidores de tripsina total y residual en harina de soya, ailados de proteína de soya, harina de soya integral y mezcla de maíz-soya. Reactivos 1.- Solución amortiguadora tris (0.05M, pH 8.2) CaCl2 (0.02 M). Disuelva 6.05 g de tris (hidroximetilamino metano) y 2.94 g de CaCl2.2H20 en 900 mi de agua. Ajuste el pH a 8.2 y afore a 1,000 mi con agua destilada. (Sigma Chem. Co. # T-1378). Caliente a 37°C antes de usarlo. 2.- Disuelva40 mgdebenzoil-DLArginina-P-nitroanilidaclorhidrato (BAPA)enunmililitro. de dimetil sulfóxido y diluya a 100 micon el amortiguador de tris, prepárelo diariamente y manténgalo a 37°C para usarse (Sigma Chem. B-4875). 3.- Disuelva 4 mg de tripsina (cristalizada 2 x, libre de sales), en 200 mi de HC10.001 N. Esta solución puede guardarse en el refrigerador 2-3 semanas sin pérdida apreciable de actividad. (Sigma Chem. Co. # T-8253). 4.- Solución de ácido acético. Mezcle 30 mi de ácido acético glacial y 70 mi de agua. 5.- Solución de hidróxido de sodio 0.01 N. Preparación de la muestra Evite exponer la muestra a temperaturas superiores a 40°C. Muela la muestra tan fino como sea posible. Muestras con mas de 2% de grasa deben desengrasarse con éter de petróleo o hexano y elimine el disolvente a temperatura ambiente. Procedimiento Pese 1.0 g de muestra molida (a través de una criba de 1mm) en un matraz de 120 mi con una barra magnética para agitación. Agregue 50 mi de NaOH 0.01N. Lentamente agite durante 3 horas a temperatura ambiente. Compruebe que el pH de la suspensión esté etitre 8.4 y 10.0 (si el pH es inferior a 8.4 utilice una solución deNaOH más concentrada). Tome unmi 50 de la suspensión con una pipeta serológica y diluya con agua destilada de manera que laD.O. de unmi de la muestra sea entre 0.4 y 0.6 veces laD.O. (absorción) con "0" mipara reducir la desviación estándar relativa. Cuando no es posible estimar las UIT (Unidades Inhibidoras de Tripsina) deben de hacerse más de una dilución. El factor de dilución es el volumen final dividido entre la alícuota tomada. Prepare dos series de tubos tomando con pipeta 0.0, 0.6, 1.0, 1.4, y 1.8 mi de la suspensión diluida de la muestra; agregue agua suficiente para hacer 2 mi y mezcle bien. Adicione 2 mi de la solución de tripsina a cada tubo, mezclando bien con un agitador Vortex. Coloque los tubos en el baño de agua a 37°C. Prepare unmarcador de intervalos de tiempo para 10 minutos. Observe lamisma secuencia para empezar y parar lareacción a cada tubo. Agregue 5 mide la solución BAPA, precalentada a 37°C. Mezcle en el Vortex, regrese albaño y pare lareacción a los 10 minutos exactamente, adicionando en lamisma secuencia de intervalos 1mi de la solución de ácido acético al30% y mezcle en el Vortex. Prepare un blanco pipeteando 2 mi de la suspensión diluida en un tubo de ensaye, agregue 5 mi de la solución de BAPA y mezcle en el Vortex. Póngalo en el baño de agua por 10 minutos. Agrege un mi de la solución de ácido acético y mezcle en el Vortex. Agregue 2 mi de la solución de tripsina y mezcle. Filtre el contenido de cada tubo a través de papel filtro de alta retención (Whatmann No.3) y mida la densidad óptica a 410 nm. Cálculos La actividad inhibodora de tripsina se mide en unidades inhibidoras de tripsina por miligramos de muestra. Unaunidad inhibidorade tripsina (UIT) se define como unincremento de 0.01 unidades de absorción a 410 nm de una mezcla de reacción de 10 mimedida en las condiciones aplicadas aquí. A la lectura (D.O) del tubo "O" se le resta la lectura obtenida en cada una de las diluciones y se divide entre el peso de la muestra para esa dilución. (D.O. del tubo "0") - (D.O. del tubo x del análisis) 100 UlT/ml -- mi de la muestra diluida del tubo (x) Calcule las UIT/mlpara cada análisis. Compare estos resultados contra los mldel tubo (x) si hay una interrelación lineal extrapolar a "0" mi para obtener las UIT/ml finales. Si no es así, use el promedio de las UIT/ml obtenidas. UIT/g= UIT/ml X factor de dilución X 50 NOTA: Una unidad de tripsina se define arbitrariamente como un incremento de 0.01 en la absorción (D.O.) a 410 nm por 10 mi de la mezcla bajo las condiciones usadas aquí. 51 PROTEINA DIGESTIBLE EN PEPSINA A.O.A.C. 1984. Officialmethods of analysis ofthe Association ofOfficialAnalytical Chemists. (14th Ed.). Arlington, U.S.A. Elmétodo es aplicable a harinas de carne, pescado,pluma, sangre y otros productos de origen animaly mide los productos resistentes a ladigestión conpepsina. De ladiferencia entre la proteína total y la proteína indigestible obtenemos la proteína digestible en pepsina. Reactivos 1.- Solución de pepsina 0.2%. Disuelva pepsina (NF 1:10.000) en ácido clorhídrico 0.075 N (6.1 ml/lt de agua, en suficiente cantidad para las muestras por analizar). Prepare únicamente la solución que se va a usar ese día. 2.- Solución de pepsina al 0.0002% preparada como la anterior. Procedimiento Pese 1.000 g de muestra moliday desengrasada (extraída con éter en un Soxhlet o en el aparato Goldfisch durante 2 horas) en un frasco de polietileno de 200 mi con tapa de rosca. Agregue 150 mi de la solución de pepsina seleccionada, precalentada a 42-45°C. Tape los frascos y colóquelos en el agitador incubando a 45°C en posición vertical y agite durante 16 horas. Al cabo del tiempo de agitación, filtre a través de unpapel filtro delNo. 1(se pude usar algún ayuda filtro como celite o tierra de diatomeas), y lave tres veces con agua caliente. Transfiera el papel conteniendo el residuo húmedo a un matraz de Kjeldahl y determine el nitrógeno en la forma usual. Realice un blanco con papel filtro. Cálculos Calcule laproteína indigestible en pepsinay réstela a laproteínacruda totalpara obtener la proteína digestible en pepsina 0.2% ó 0.0002%. 52 Nota: Para harinas de pescado, la digestibilidad en pepsina 0.2% debe ser de 70-90% de la proteínacruda total, y ladigestibilidad en pepsina 0.0002% debe ser superior al30%. Se sugiere que se determine la digestibilidad en las dos soluciones, ya que se ha observado que hay cierto error al hacerlo únicamente con la 0.2% La AOAC sugiere un aparato para agitación por inversión de los frascos (D.E. Sims, 716 Forrest Ave. Quincy IL62301). El agitador se mete a unhorno para incubar las muestras. Una alternativa que es usa en el laboratorio es un baño maría con agitación. Se colocan los frascos con las muestras horizontalmente y se permite que los frascos rueden. De esta manera no se quedan partículas sólidas adheridas a las paredes del frasco, como sería si se colocaran los frascos verticalmente. 53 PROTEINA SOLUBLE A.O.A.C. 1984. Officialmethods ofanalysis ofthe Association ofOfficialAnalytical Chemists, (14th Ed.). Arlington, U.S.A. Este método es aplicable para suplementos proteicos para rumiantes. Se ha utilizado el contenido de proteína soluble como unamedida de laasimilación del nitrógeno proteico por el animal. Si la proteína es muy soluble es degradada en el rumen y no es aprovechada por el animal directamente. Reactivos SOLUCION DE SALIVA ARTIFICIAL. Agua 2.00 lt NaHC03 19.60 g K2HP04 . 3H20 14.00 g KC1 1.14 g NaCl 0.95 g MgS04 . 7H20 0.24 g Urea 1.82 g Glucosa 1.83 g Procedimiento Pese 5gde muestramolidaen unmatrazque contenga 5Omlde lasolución de saliva precalentada a 39-40°C. Incube por 4 horas con agitaciones esporádicas a esa misma temperatura. Filtre a través de un papel filtro Whatman No. 43. Lave el residuo con 20 mi de la solución de saliva y afore a 100 mi con saliva. Determine el nitrógeno por el método de Kjeldahl a una alícuota del filtrado y a la muestra original. Cálculos Proteína soluble X 100 X FD % de proteína soluble = —ÿ——---—-—————-- Proteína total FD = Factor de dilución. 54 UREASA ACTIVIDAD UREASICA Aguilera A.A. 1975. Studies on chickens seed rawand autoclaved soybean oilmeal, as the sole source ofprotein:a comparative studyonthemetionineandproteinrequirements,limiting aminoacids, and factor influencing the nutritive properties of soybean oil meal. Thesis Ph.D., University of Illinois, Urbana 111, U.S.A. Objetivo Determinar la actividad de la ureasa contenida en la pasta de soya empleada en la elaboración de alimentos balanceados. Muestreo La muestra deberá ser representativa. Para cada caso debe consultarse el rubro correspondiente. Definiciones Ureasa. Es una enzima que cataliza la hidrólisis de urea a amonio y C02. Material Vaso de precipitado de una capacidad de 250 mi pH-metro Pipeta graduada de 5 mi "Baño de agua a una temperatura de 27°C Bureta de 25 mi de capacidad Solución de HC10.1N Solución de urea (1 g en 5 mi de H20) Procedimiento Se pesa un gramo de soya y se coloca en un vaso de 250 mi, se adicionan 94 mide agua destilada, se agita 15 minutos y se determina elpH. Se adicionan 5 mi de la solución de urea1' y el vaso se coloca en el baño de agua a 27°C durante 30 minutos exactamente. Se agita ocasionalmente y se titula con el HC1hasta regresar al pH original. Informe El informe deberá indicar los mi de HC1 gastados en un gramo de soya. 55 Cálculos El criterio que se sigue en este ensayo es el siguiente: mi de HC1 0.1 N CALIDAD 0 - 5 Muy buena O1 i1 Buena 10 - 15 Regular27 15 o más Mala Cuando se van a ensayar dos o más muestras, la solución de urea debe agregarse a intervalos de 5 minutos para cada problema, en tal forma que quede tiempo suficiente para titular cada muestra. Esta soya puede usarse en laelaboración de alimentos para aves y cerdos, suplementada con metionina; nunca se usa para ganado que incluya urea en la dieta. 56 DETERMINACION DE CALCIO A.O.A.C. 1980. Oficial methods ofanalysis ofthe Association of OfficialAnalytical Chemists, (13th ed.). Washington D.C., U.S.A. Este método determina el calcio de rocas fosfóricas, harina de hueso, carbonato de calcio, etc. Reactivos 1.- Acido nítrico concentrado 2.- Acido sulfúrico concentrado 3.- Solución de HC1 en agua (1+3) 4.- Solución de NH4 en agua (1 + 1) 5.- Solución diluida de NH4OH en agua (1 + 50) 6.- Solución acuosa de oxalato de amonio, (NH4)2C204, al 4.2% 7.- Solución 0.05 o 0.10 N de KMn04 8.- Indicador de rojo de metilo al 0.5% en etanol Preparación de la muestra Pese con exactitud aproximadamente 2.5 g de muestra en