OPTIMIZACION DEL CONTROL MICROBIAL DE Plutella xylostella L. EN EL CULTIVO DE REPOLLO ( Brassica oleracea var. Capitata) EN HONDURAS POR Cat~os dvnando Ramos ~után TE S 1 S PRESENTADA A LA ESCUELA AGRICOLA PANAMERICANA PARA OPTAR AL TITULO DE INGENIERO AGRONOMO ... : ...•. ::. ~ ;· .. r ~·· ~ .. . . :• ESCUELA AGRICOLA PANAMERICANA EL ZAMORANO, HONDURAS 1 9 9 2 ii OPTIMIZACION DEL CONTROL MICROBIAL DE Plutella xylostella L. EN EL CULTIVO DE REPOLLO (Brassica oleracea var. Capitata) EN HONDURAS Por Carlos Armando Ramos Durán El autor concede a la Escuela Agricola Panamericana permiso para reproducir y distribuir copias de este trabajo para los usos que considere necesarios. Para otras personas y otros fines, se reservan los derechos de autor. Agosto - 1992 iii DEDICATORIA A Dios por darme sabiduría, y fuerzas y por su compañia a través de las imnumerables jornadas. A mi padre Carlos Ramos Martínez (Q. D. D. G) , por su ejemplo de lucha, humildad y amor a Dios. A mi madre Esther Durán de Ramos, por su sacrificio y amor infinitos. A mis hermanos osear Ramón, Esther Antonia, Patricia y Ana. A mis abuelos Osear {Q.D.D.G), Pola, Ramón y Cristina (Q.D.D.G). iv AGRADECIMIENTOS A la Escuela Agricola Panamericana, al Departamento de Protección Vegetal y al Programa de MIP-Crucíferas. A mi comite de asesores, por la asesoría prestada, y el tiempo invertido en la realización de esta tesis. A Reynaldo Sánchez y Marvín Mora, por el tiempo y esfuerzos invertidos en la realización de esta tesis. A Isabel, por su apoyo invaluable durante estos ültimos dos años del programa de Ing. Agr. A mí compañero de cuarto, Ange 1 Rodríguez, por su amistad, su apoyo y su valiosa colaboración en la realización de esta tesis. A Rodolfo y Angel Perez, por su compañerismo; a Napoleón Avíla, Elvin Peréz y Ruben Lagos, por su valioso apoyo en todos los trabajos realizados. A Lourdes Gaitan, y a todo el personal del DPV, por el compañerismo y colaboración prestados en todas las tareas realizadas. V INDICE GENERAL PAGINA PORTADA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i DERECHOS DE AUTOR. . . . . • • • • . . . . . . . • • • • . . . . • . . . • • • • . . . . . ii DEDICATORIA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . • • . • . . . i i i AGRADECIMIENTOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i v INDICE GENERAL. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v INDI CE DE CUADROS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . vi i i INDICE DE FIGURAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x I. INTRODUCCION. . . . . . . . . . . • • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 II. REVISION DE LITERATURA........................... 3 A. El Cultivo de Repollo ......................... 3 B. La Palomilla Dorso de Diamante (Plutella xylostella) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 1} Origen y Distribución .................... 5 2) Descripción de la Plaga y su Daño ........ 6 c. Control Microbial de larvas de PDD ............ 9 1) Bacillus thuringiensis Berliner var. Kurstaki (Bt) . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . • • . . . . 10 a) Antecedentes .................•...... 10 b) Clasificación y Descripción ......... 11 e) Modo de Acción y Síntomas .......•... 12 d) Susceptibilidad de la PDD a Bt ...... 13 e) Formulaciones Comerciales ........... 14 f) Utilización de Bt para el Control de PDD. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 g) Resistencia a Bt ....... . ............ 19 2) Virus de la Polihedrosis Nuclear de Autographa californica (VPNAc) ........... 21 a) Antecedentes ........................ 21 b) Clasificación y Descripción ......... 22 e) Modo de Acción y Síntomas ••......... 23 d) Utilización de VPN en el Control de PDD y principales Formulaciones Comercia les. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . 2 5 3) Utilización de Epocas o Criter ios de Aplicación ............•.................. 26 vi III. FASE DE LABORATORIO.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • • . . . . . 30 A. Sistemas de Producción Masiva de Larvas de PDD . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 O 1) Introduce ión. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 o 2) Objetivo ......... .... ........ .... ........ 30 3) Materiales y Métodos ..................... 31 a) Sistema Caja-PlAntula Individual .... 31 b) Sistema Jaula de Tela Metálica­ Plántula individual .•............••. 32 e) Sistema Botella de oviposición- Plántulas Chorro Corrido ............ 34 d) Sistema caja-Botella de oviposición- Plántulas Chorro Corrido ........... . 36 e) Sistema Caja-Botella de Oviposición- P lántu 1 a In dividua l. . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 1.- Materiales y métodos .......... 38 2. - Resultados y discusión ... ... .. 39 3 .- Conclusiones y recomendaciones 43 B. Concentraciones Letales de Ocho Insecticidas Microbiales a Base de Bacillus thuringiensis Berliner var. Kurstaki (Bt) Sobre Dos Poblaciones de PDO ... . .......... ..... ........ 44 1) Introducción .... . ...... ..... .... ... . . . . .. 44 2) Objetivos . ....... .... ......... .. .... . . ... 44 3) Materiales y Métodos ..................... 45 a) Descripción de las Zonas en Estudio. 45 b) Pruebas de Concentración Letal (CL) . 46 4) Resultados y Discusión ....... • .......... . 51 5) Conclusiones ............................. 69 6) Recomendaciones .....................•.... 71 IV • FAS E DE CAMPO . . • . . . . . . . . . . . . . . . . • • . . . . . . . . . . • • . . . 7 3 A. Evaluación de la Eficacia de siete Insecticidas Microbiales a Base de Bt para el Control de PDD y otros Lepidópteros en Repollo ....... ... . 73 1) Introducción .... . .......... .. ........ .... 73 2) Objetivos ................................ 73 3) Materiales y Métodos .............. . . .. ... 73 a) Fecha y Localización del Ensayo .... . 73 b) Cultivar y Prácticas Agronómicas .. . . 74 e) Diseño Experimental y Tratamientos .. 75 d) Toma de Datos y Análisis ......... .. . 76 4) Resultados y Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B o a) Control de PDO. . • • . . . . . . . . . . . . . . . . . • 80 b) Calidad y Rendimiento .. ... ........•. 90 e) Control de Otros Lepidópteros ..... .. 94 5) Conclusiones .......................•... .. 99 6) Recomendaciones .....•.................... 101 vii B. Evaluación de la Eficacia de 12 Tratamientos para el control de Plutella xylostella y su Efecto sobre la Depredación y el Parasitismo de esta Plaga en el Campo ......... o o ..... o .... 102 1) Introducción ............................. 1 O 2 2) Objetivos ........ o o ..................... o 102 3) Materiales y Métodos •.................... 102 a) Fecha y Localización del Ensayo ..... 103 b) Diseño Experimental y Tratamientos .. lOJ e) Toma de Datos y Análisis .........••. 103 d) Resultados y Discusión ... o ...•••.... 105 a) Control de PDD ................. 105 b) Calidad y Rendimiento .......... 118 e) Control de Otros Lepidópteros.ol22 4) Conclusiones .........•••........••••. o .•. 126 5) Recomendaciones ..................••••.... 128 V. CONCLUSIONES GENERALES ........................... 130 VI. RECOMENDACIONES GENERALES ......................•• l34 VII. RESUMEN .......................•...........• o ••••• 13 5 VIII. BIBLIOGRAFIA ..................................... 13 8 viii INDICE DE CUADROS PAGINA cuadro 1. Producción promedio de huevos de PDD obtenida de 10 botellas de oviposiciónjpoblación de PDD, con el sistema de producción masiva de larvas denominado caja-botella de oviposición plántula individual .. 40 cuadro 2. Descripción de los tratamientos a base de Bt evaluados en las pruebas de concentración letal a nivel de laboratorio .........................••.. 49 cuadro 3. Concentraciones letales y pendientes de respuesta de ocho insecticidas roicrobiales a base de Bt a las 72 horas después de la exposición de las larvas de PDD, para la población del Valle del Zamorano .... 53 Cuadro 4. Concentraciones letales y pendientes de respuesta de ocho insecticidas roicrobiales a base de Bt a las 72 horas después de la exposición de las larvas de PDD,para la población de San Juan del Rancho ..... 54 cuadro S. comparación entre la concentración recomendada por el fabricante y la CL-90 requerida a las 72 horas después de la exposición de las larvas de PDD, para ocho formulaciones de Bt evaluadas sobre la población de PDD del Valle del Zamorano ........................... 62 cuadro 6. Comparación entre la concentración recomendada por el fabricante y la CL-90 a las 72 horas después de la exposición de las larvas de PDD, para ocho formulaciones de Bt evaluadas sobre la población de PDD de San Juan del Rancho ....................... 63 cuadro 7. Comparación de la susceptibilidad de dos poblaciones de PDD (Valle del Zamorano y San Juan del Rancho) a siete formulaciones comerciales a base de Bt .........•...............••............ 67 cuadro 8. Descripción de los tratamientos evaluados para el control de PDD en el primer ensayo de campo en la Escuela Agrícola Panamericana .................... 77 cuadro 9. Número promedio de larvas de PDD/planta en ocho tratamientos, antes del inicio de las aplicaciones (día cero), y promedio total a los 2, 4 y 7 dias después de las cinco aplicaciones realizadas en el ensayo de campo en la EAP ..........•......•...... 81 ix cuadro 10. Número promedio de larvas de PDD/plantafdia en cinco aplicaciones realizadas durante el ciclo de cultivo, y promedio de las cinco aplicaciones, presentadas por ocho tratamientos evaluados para el control de PDD en la EAP ......................... 87 cuadro 11. Incidencia promedio total de larvas de cuatro especies de lepidópteros adicionales a la PDD, en ocho tratamientos evaluados en la EAP (1) ........ 96 cuadro 12. Descripción de los tratamientos evaluados para el control de PDD en el ensayo de campo realizado en la comunidad de San Juan del Rancho .............. 104 cuadro 13. Incidencia promedio de larvas de PDD/planta, en 12 tratamientos, antes del inicio de las aplicaciones (día cero) y promedio total a los 2, 4 y 7 días después de las tres aplicaciones realizadas en el ensayo de campo de SJR • ................................................... . 107 cuadro 14. Número de larvas de PDD/plantajdía en tres aplicaciones realizadas durante el ciclo de cultivo, y promedio de las tres aplicaciones, presentados por 12 tratamientos evaluados para el control de PPD en la localidad de SJR .......••.... 112 cuadro 15. Incidencia promedio total de larvas de tres especies de lepidópteros adicionales a la PDD, en 12 tratamientos evaluados en la localidad de SJR .. 123 X INDICE DE FIGURAS PAGINA Figura 1. curvas promedio de producción de huevosjjaula normal y acumulada, obtenidas de 10 jaulas en cada una de las dos poblaciones de PDD evaluadas (VZ y SJR) ................................................ 41 Figura 2. concentraciones letales y lineas de respuesta de ocho formulaciones a base de Bt obtenidas sobre la población de PDD del VZ a las 72 hdel ............ 56 Figura 3. Concentraciones letales y lineas de respuesta de ocho formulaciones a base de Bt 1 obtenidas sobre la población de PDD de SJR a las 72 hdel ••••••...••• 57 Figura 4. Potencia relativa, con respecto a Dipel, de siete formulaciones a base de Bt, sobre dos poblaciones de PDD: VZ y SJR. (72 hdel) ...............••••••. 60 Figura 5. Concentraciones letales y lineas de respuesta observadas y estimadas para la formulación Dipel sobre dos poblaciones de PDD: VZ y SJR ..........• 68 Pigura 6. Dinámica poblacional de PDD en ocho tratamientos para su control evaluados en la EAP .............. 84 Figura 7. Porcentaje total de eficacia en el control de PDD de siete formulaciones de Bt evaludas en la EAP .. 89 Figura 8. Correlación entre la incidencia total de PDD y la calidad de repollo obtenida en ocho tratamientos evaluados en la EAP... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 Figura 9. Correlación entre la incidencia total de PDD y el rendimiento comercial de repollo obtenido en ocho tratamientos evaluados en la EAP ••••••••••••••••. 93 Figura 10. Porcentaje total de eficacia en el control de ~· ni de siete formulaciones de Bt evaluadas en la EAP • • • • • .. . .. . . . • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • .. • • • • • • • 9 8 Figura 11. Dinámica poblacional de PDD en 12 tratamientos evaluados para su control en la localidad de SJR.113 Figura 12. Porcentaje total de eficacia en el control de PDD de 12 tratamientos evaluados en la localidad de SJR . .............................................. 114 xi Figura 13. correlación entre la incidencia total de PDD y la calidad de repollo obtenida en 12 tratamientos evaluados en la localidad de SJR ..............•.•.......... 119 Figura 14. Correlación entre la incidencia total de PDD y el rendimiento de repollo comercial obtenido en 12 tratamientos evaluados en la localidad de SJR . . .. 121 I. INTRODUCCION El repollo (Brassica oleracea var. Capitata) constituye una de las principales hortalizas de consumo fresco en Centroámerica y la segunda hortaliza en volumen de producción y área cultivada en Honduras, donde sólo es superada por el tomate (Herrera 1988). La palomilla dorso de diamante {PDD) (Plutella xylostella L.) (Lepidoptera: Plutellidae) es el principal problema entomológico limitante de la producción de repollo en Honduras (Secaira y Andrews 1 1987) y el mundo (Harcourt 1 1957 y Salinas, 1977). En Honduras, su importancia es mayor durante la época seca debido a que las condiciones ambientales son más favorables para su desarrollo y reproducción {Secaira y Andrews 1987; Ruiz 1988; Cordero 1989 1 Mora 1990). Las larvas de esta plaga se alimentan principalmente del mesófilo de las hojas tiernas del repollo, causando perforaciones irregulares que reducen el rendimiento y valor comercial del producto y facilitan además la penetración de organismos patógenos (Mora 1990}. El control de la PDD 1 en Honduras 1 se ha basado en el uso intensivo de productos químicos (Herrera, 1988), que ha conducido al desarrollo de resistencia de la PDD a por lo menos tres grupos de insecticidas químicos: organofosforados, carbamatos y piretroides (Ovalle 1989) . Este enfoque unilateral de control ha tenido 1 además 1 múltiples consecuencias colaterales negativas tales como el -2- daño a la salud humana, el deterioro del medio ambiente, el surgimiento de nuevas plagas y la eliminación de enemigos naturales de las mismas (cordero 1989). Los insecticidas microbiales son una alternativa potencial para el control de la PDD debido a su compatibilidad con otras tácticas de control, particularmente control biológico, lo que podria generar un manejo sostenible y ecologicarnente compatible de esta plaga en el campo. Los insecticidas microbiales provocan consecuencias colaterales negativas minimas debido a su baja o nula toxicidad para humanos, animales de sangre caliente y enemigos naturales. Actualmente, existen muchas formulaciones comerciales, en Honduras, cuya eficacia en el control de PDD no ha sido evaluada bajo nuestras condiciones. Existen, además, otros factores importantes relacionados con el uso de estos insecticidas, tales como la susceptibilidad de poblaciones, que tampoco han sido estudiados. El objetivo de la presente tesis fue evaluar, a nivel de laboratorio y de campo, la eficacia de las principales formulaciones comerciales de insecticidas microbiales, particularmente de insecticidas a base de la bacteria Bacillus thuringiensis Berliner var Kurstaki (Bt) , en el control de la PDD. Adicionalmente, se desarrolló un sistema práctico y sencillo de producción masiva de larvas, ideal para producir altas cantidades de larvas de una edad uniforme. II. REVISION DE LITERATURA A. El CUltivo de Repollo El repollo (Brassica oleracea var. Capitata L.) es el miembro más importante del género Brassica cultivado en el trópico. Este género, a su vez, es el de mayor importancia económica de la familia cruciferae, debido a que agrupa varias especies de hortalizas ampliamente cultivadas a nivel mundial tales como brócoli (~. oleracea var. Italica L.), coliflor(~. oleracea var. Botrytis L.), col de bruselas (~. oleracea var. Gemrnifera L.) y colinabo (ª. oleracea var. Gongyloides L.) (Fersini, 1976). Estutervant ( 1919) citado por Mora ( 1990) , úbica el centro de origen del repollo en el Asia menor, sin embargo, la mayor parte de los autores lo ubican en la zona oeste de Europa (Montes, 1990 y Fersini, 1976). El repollo es una planta dicotiledonea, puede ser cultivada como anual, cuando el herbácea, que destino de la producción es para consumo fresco, o como bianual, cuando se le cultiva para la producción de semilla (Montes, 1990). Posee un sistema radicular pivotante y la parte áerea está constituida por un meristemo apical, alrededor del cual las hojas se agrupan para formar una pelota o cabeza, que es la parte comercial de la planta para consumo fresco (Fersini, 197 6) . El valor nutricional del cultivo es bajo, ya que -4- aproximadamente el 85 a 90% de sus hojas están constituidas por agua, sin embargo, su contenido de vitamina e es bastante alto, lo mismo que su contenido de fibra. Otros componentes importantes de la planta son: proteinas (1.7 gr/100 gr de peso vivo) y carbohidratos (6.1 gr/100 gr de peso vivo) (Montes, 1987) . El repollo es un cultivo de invierno, y su rango óptimo de temperatura está entre 15-20 °c (Montes, 1990) , aunque en el trópico ha sido cultivado con éxito en un rango de temperatura de 14-28 °c (Mora, 1990). En Honduras, el repollo se produce principalmente en zonas altas ubicadas sobre los 1, 000 msnm (Tatumbla (1400 msnm), Siguatepeque {1600 msnm), La Esperanza (1800 msnm) y Ocotepeque (1800 msnm)), debido a que en ellas se dan las condiciones óptimas para el desarrollo del cultivo y una menor incidencia de plagas insectiles (Montes, 1982). Sin embargo, este cultivo ha sido desarrollado con éxito en zonas ubicadas desde los 300 msnm (Secaira y Andrews, 1987). El área cultivada de repollo, en Honduras, asciende a 4,600 ha anuales aproximadamente, obteniéndose una producción de 57,000 TM que generan un ingreso aproximado de 8 millones de dólares (Mora, 1990). La mayor parte de esta producción se destina para consumo fresco en comidas como enchiladas, tacos, ensaladas y otros, existiendo, sin embargo, una pequeña parte de la producción destinada a la industria (Sauerkraut) y otra para consumo cocido (sopas, hojas de repollo rellenas, etc). B. La Palomilla Dorso de Diamante (PDD) (Plutella xylostella L.) 1) origen y Distribución de la Plaga Hardy (1938), citado por Ooi (1986), determinó que la PDD es una plaga originaria del Mediterraneo, debido al complejo de enemigos naturales existentes en la región y el efectivo control natural de la plaga reportado en estas tierras. Otras razones que confirman lo anterior son: a) el centro de origen del género Brassica se ubica en la zona del mediterraneo, y b) la existencia de una sola especie del género Plutella fuera del mediterraneo (Ho, 1965, citado por Mora, 1990). La PDD es una de las especies de insecto con mayor diseminación mundial y con una gran adaptabilidad a diferentes condiciones climáticas, lo que la han hecho reconocida como una de las mayores plagas en regiones templadas y tropicales. Los primeros registros de la plaga en América fueron establecidos en Illinois, E.U, desde el año de 1855. En sur América, la presencia de la PDD fue registrada en Brasil, entre los años 1892-1896 por el Commonwealth Institute of Entomology de London (Salinas, 1977). Ooi (1986) afirma que la PDD ha sido registrada desde regiones ubicadas a 60° de latitud Norte (Islandia), hasta regiones trópica les, pasando por zonas templadas. Hardy (1938), citado por Ooi (1986), determinó que la PDD prefiere -6- climas cálidos para su desarrollo óptimo, lo cual fue respaldado por Ooi (1986), quien determinó que las poblaciones de inmaduros de PDD alcanzaban su pico más alto en la estación seca del año en las tierras altas de Camerún. Ooi (1986) también concluyó que la duración del ciclo de vida de la PDD era en promedio 14 días más corta en las tierras bajas de camerún (13 días) , que en en las tierras altas (27 días) . Conclusiones similares sostiene Mora (l990) quien después de evaluar los resultados de 14 tablas de vida en Honduras concluyó que las poblaciones de PDD eran más altas en la época seca, debido al efecto combinado de una mayor temperatura y una menor precipitación, dos. factores muy ligados a la incidencia de PDD en el campo. secaira y Andrews (1987) reportan que la PDD se encuentra causando daño en todos los lugares donde se siembra repollo en Honduras, en un rango que va desde 300 hasta 2,050 msnm, y entre los 12 y 35 °C. 2) Descripci6n de la Plaga y su Daño Los adultos de la PDD son palomillas pequeñas y finas de color gris o pardo, que miden de 10-15 nun de longitud (Hernández, 1988). Brethes (sf) indica que cuando los adultos de la PDD están en descanso, tienen las alas pegadas al cuerpo y sobre ellas se puede observar una linea longitudinal que va desde la cabeza hasta casi la parte final de las alas presentando ciertas expansiones en forma de diamante. Las -7- alas traseras del adulto son de color café pálido y presentan un fleco de pelos largos (King y Saunders, 1984) La hembra generalmente es de color más claro que el macho (Hernández, 1988) y puede ovipositar un número variable de huevos. Ooi (1986) reporta que las hembras pueden ovipositar un promedio de 288 huevos durante su vida. Harcourt (1986) reportó que la oviposición es afectada por el fotoperiodo, encontrando una reducción de un 49% en la fecundidad total, cuando la duración de horas luz se redujó de 16 horas, en junio, a 12 horas en septiembre. Harcourt (1963), citado por Hernández (1988) describe los huevos de la PDD como ovales, estriados y algo aplanados, de color verde claro o amarillo. su largo promedio es de o. 44 mm y su ancho de o. 26 mm. Bartell (1966}, citado por Salinas (1977} , describe los huevos en forma similar. Este autor sin embargo, reporta un largo promedio de los huevos de 0.51 mm {rango de 0.49-0.52 mm} y un ancho promedio de 0.27 mm (rango de 0.26-0.28 mm}. Poco antes de la eclosión, los huevos se oscurecen y las larvas jóvenes pueden ser vistas a través del corion, el cual se rompe al emerger las larvas (Hernández, 1988). Las larvas son subcilíndricas y relativamente sin vellos, con cinco pares de pseudopatas. Presentan cuatro instares y conforme crecen, su cuerpo se ensancha hacia el centro del abdomen y se adelgaza hacia los extremos. (Harcourt, 1956, citado por Salinas, 1977}. Abraham y Padmanaban (1968}, citados por Salinas (1977}, -s- reportan que el tamaño de la larva recién eclosionada es de aproximadamente 10 mm cuando está totalmente extendida. La larva recién eclosionada carece de pigmentación, pero conforme crecen, su cuerpo se vuelve color verde debido a la acumulación de partículas de alimentos en el intestino (Hernández, 1988). Las larvas de la PDD son las causantes del daño en el cultivo, por alimentarse del mesófilo de las hojas, particularmente de las hojas tiernas, causando perforaciones irregulares que reducen el rendimiento y la calidad del cultivo. Cuando las infestaciones son muy severas, el resultado es un producto de baja calidad muy difícil de comercializar. La PDD se considera una plaga primaria debido a que ataca el cultivo desde la etapa de .semillero hasta la cosecha (Vásquez, 1988; Mora 1990¡ y Secaira y Andrews, 1987). Vásquez (1988), determinó que la PDD no era un factor de mortalidad en el cultivo de repollo, pero que las larvas de esta plaga causaban defoliaciones importantes y daños al cogollo de las plantas, causando junto con Mycosphaerella brassisicola un 75% de pérdidas del rendimiento total. Este autor encontró larvas de todos los instares de la plaga durante todo el tiempo del cultivo en el campo. Resultados similares reporta Ruiz ( 1988) , quien determinó un 98% de pérdidas económicas debido a la PDD en un lote de repollo sin aplicaciones durante la época seca. Durante la -9- época lluviosa, la PDD no causó problemas serios en el cultivo, en el lote sin aplicaciones, y no constituyó un factor limitante para la producción del mismo debido al efecto de la lluvia y los enemigos naturales sobre la plaga. Ruiz (1988") también encontró una mayor densidad de larvas de PDD durante la época lluviosa en un lote de repollo aplicado con insecticidas, comparado con un lote no aplicado, debido a la alteración frecuente del ecosistema y la mortalidad de los enemigos naturales. Sastrodihardjo (1986) determinó la presencia de inmaduros de PDD durante todo el tiempo del cultivo después del trasplante. Este autor reporta también la existencia de dos generaciones por ciclo de cultivo y un considerable traslape de generaciones. c. control Microbial de larvas de PDD Control microbial es el uso inteligente de microorganismos entomopatógenos, que pueden ser bacterias, virus, hongos, nemátodos, protozoarios o rickettsias, para para reducir o regular las poblaciones insectiles (Bustillo, l989). Los principales microorganismos utilizados para el control de la PDD son, en orden de importancia, las bacterias y los virus. Según Bustillo (1989), las bacterias constituyen el grupo de microorganismos más numeroso y el más estudiado dentro de los microorganismos asociados con insectos. 1) Bacillus thurinqiensis var. Kurstaki Berliner (Bt) a) Antecedentes La bacteria ~- thuringiensis fue descubierta por primera vez en 1902 por el japones Ishiwata, quien realizó pruebas preliminares demostrando su alta capacidad insecticida. Esta bacteria fue nombrada, sin embargo, hasta el año de 1915 por el alemán Berliner, quien aisló este microorganismo de larvas de la polilla de los graneros, Anagasta kuheniella (Flores, 19 9 o) . Desde entonces, este patógeno ha sido aislado de numerosos insectos en di versos lugares del mundo. Actualmente se conocen 19 variedades, correspondientes a 14 serotipos diferentes siendo las más importantes la Kurstaki, Israelensis, Tenebrionis y Aizawai. Cada variedad o subespecie ataca diferentes tipos de insectos. La var. Kurstaki ataca solamente lepidópteros, la var. Aizawai ataca a Gallería sp. (polilla de la cera), lavar. Tenebrionis ataca solamente coleopteros y la var. Israelensis ataca dipteros (Flores, 1990) En 1969, se aisló la raza HD-1 de cultivos en el laboratorio de Bt var. Kurstaki perteneciente al serotipo III, la cual demostró ser de 10-100 veces más potente que las utilizadas comercialmente en aquella época. Desde entonces, han aparecido numerosas formulaciones comerciales, todas basadas en los serotipos I, III, IV o V 1 siendo el más importante el serotipo III por su alta virulencia a -11- lepidópteros (Bustillo, 1989}. La aparición de las formulaciones comerciales promovió un incremento significativo en la adopción de los insecticidas microbiales a base de Bt a nivel mundial, tal como reporta Lim (1987}, quien afirma que hubo un incremento significativo en el uso de Bt en Malasia, a partir de 1979, debido a la introducción de la formulación Dipel que produjó buenos resultados en el control de larvas de PDD en el campo. En Honduras, se registró un marcado incremento en la utilización de Bt, a partir de 1987, siendo utilizado por los agricultores solo o mezclado con otros insecticidas (Sánchez, 1990). b) Clasificación y Descripción En forma general, los entomófagos bacteriales se clasifican en cuatro grupos: a) cristaliferas formadoras de esporas, b) patógenos obligados, e) patógenos facultativos y d) patógenos potenciales (Bustillo, 1989) Bacillus thuringiensis se clasifica en el grupo de las bacterias aeróbicas, cristaliferas que forman esporas. Este grupo de bacterias comprende dos especies importantes pertenecientes a la familia Bacillaceae: Bacillus popilliae y ~- thuringiensis (Wilding, 1986). Bacillus thurinqiensis es una bacteria caracterizada por la producción de cristales proteicos, en su fase de esporulación, dentro de los cuales la delta-endotoxina es la -l2- toxina más tóxica para larvas de lepidópteros y larvas acuáticas de ciertos dipteros, incluyendo mosquitos y moscas negras, pero totalmente inócua para todos los demás organismos, incluyendo el hombre (Wilding, l986). e) Modo de Acción y síntomas El rango de acción de Bt está limitado específicamente a las larvas del orden lepidóptera, actuando sobre más de 200 especies. Esta bacteria actúa como insecticida estomacal, ya que su acción se produce únicamente al ser ingerida por las larvas (Flores, 1990). Aunque se han aislado cinco toxinas producidas por Bt, el cristal tóxico (delta endotoxina) es el principal causante de toxicidad en las larvas de lepidópteros (Cremlyn, 1985; citado por Herrera 1988) . Heimpel (1974), citado por Barrios (1976), afirma que este cristal tóxico está compuesto por una serie de aminoácidos, variando el porcentaje de los mismos de acuerdo a la variedad de Bt. Los aminoácidos más importantes son el ácido aspártico y el ácido glutámico, que constituyen el 25% de los aminoácidos presentes. La delta endotoxina actúa como veneno especifico del tracto intestinal de las larvas atacando las paredes del intestino medio y causando alteraciones en el balance osmótico, abrasión en la pared estomacal y parálisis de la misma (Abbott, 1986). Lo anterior es respaldado y ampliado por Flores (1990), -13- quien afirma que después que la larva ingiere el cristal y la espora, el cristal comienza a ser solubilizado por los jugos digestivos y el alto pH del estómago (pH mayor que 9), sufriendo una digestión proteolítica por las enzimas del estómago para formar toxinas activas. La toxina activa (delta-endotoxina) tiene gran especificidad para acoplarse a un componente glicoprotéico de la membrana de las células epiteliales, comunmente llamado receptor, y el cual lo tienen las células susceptibles. Esta unión desequilibra la estructura de la membrana ocasionando un desbalance iónico en ella, lo mismo que una desintegración de las células epiteliales que la rodean. La desintegración de la membrana permite el paso de las esporas de Bt ya germinadas hacia el hemocelo donde se mezclan con la hemolinfa de la larva, causando una septicemia en la misma y finalmente la muerte. La delta-endotoxina interfiere, además, con el sistema de transporte del epitelio del intestino medio y la transmisión sináptica de impulsos nerviosos (Casida, 1974; citado por Chávez 1989). d) Susceptibilidad de la PDD a Bt chen y Yen (1980) observaron en laboratorio que larvas jóvenes (primer y segundo estadio) eran más susceptibles que larvas viejas (cuarto estadio y prepupa), y que las hembras eran más susceptibles que los machos. Resultados similares reportan Brunner y Stevens (1985) quienes observaron que las -14- larvas son más susceptibles cuando están recién eclosionadas o entre el primer y el tercer estadía larval. Legotai (1980) reporta que la mortalidad producida por Bt se reduce con las temperaturas bajas, reportando, además, que los individuos que sobreviven al tratamiento son menos capaces de desarrollarse y que los que logran desarrollarse son menos fértiles. Metalnikow (1973), citado por Barrios (1976), notó un progresivo decrecimiento en la viabilidad y virulencia de Bt después de prolongadas exposiciones de la bacteria sobre hojas de algodón expuestas a la luz directa del sol en Egipto, a temperaturas de 14 a 56 °c. Chang (1972) evaluó la efectividad de Thuricide 90 PS (Bt) a diferentes diluciones en agua (1:500; 1:1000; 1:1500 partes de Thuricide 90 PS y agua, respectivamente), para el control de PDD bajo condiciones de laboratorio. que dió un mejor control de PDD fue de 1:500. e) Formulaciones Comerciales Los insecticidas a base de Bt se La dilución diferencian principalmente por la cepa de la bacteria utilizada, por la potencia (concentración de cristales tóxicos y esporas) y por la formulación o presentación comercial del producto (Flores, 1990) . En la actualidad exis.ten numerosos insecticidas comerciales a base de Bt a nivel mundial y continuan surgiendo -15- nuevos en el mercado. La mayor parte de estos insecticidas son a base de la raza HD-1 perteneciente al serotipo III de Bt, aunque existen otras cepas, como la SA-11, que también son importantes (Fernández, (1991)). Los factores más importantes que deben tomarse en cuenta para determinar la efectividad de un insecticida comercial a base de Bt son: número de cuerpos cristales proteicos por espora, variedad de Bt, pH del agua de aplicación, dosis y frecuencia de aplicación, tipo de insecto y estadios larvales (se ha demostrado que los estadios próximos a empupar son menos susceptibles) (Barrios, 1976). Otros factores que deben considerarse son: tiempo de almacenamiento y condiciones donde estuvo el insecticida, tipo de material inerte utilizado, cantidad de horas luz a las que estará expuesto el producto después de su aplicación, temperatura, distribución y cantidad de lluvia durante el año, rentabilidad de aplicación y otros (Barrios, 1976). Las emulsiones estabilizadas liquidas de espora-cristal de esta bacteria son preparaciones muy efectivas, aunque no tan estables como las preparaciones en polvo seco, las cuales pueden ser almacenadas por 10 años sin reducir su virulencia (Heimpel, 1974 citado por Barrios, 1976). En la actualidad, existe una formulación microencapsulada de Bt (MVP) , con mejores caracteristicas para tolerar la degradación por factores ambientales. En esta formulación (MVP) , los cristales tóxicos de Bt son encapsulados por -16- células de la bacteria Pseudornonas fluorescens, las cuales protegen a los cristales de la degradación ambiental, asegurando un efecto más prolongado del insecticida en el campo (Mycogeri Corporation, 1992). En Honduras existen actualmente aproximadamente seis formulaciones comerciales a base de Bt: Dipel ES, Dipel X, Thuricide HP, Javelin WG, Bactospeine HP, Nqvo Biobit HP y están cercanas a ingresar al mercado un minimo de dos formulaciones más: Bactec Bernam Bt III y MVP. Estas formulaciones no han sido evaluadas sistematicamente a nivel de campo para determinar su eficacia en el control de la PDD, existiendo, sin embargo, numerosos estudios en los que se han evaluado individualmente formulaciones comerciales de Bt comparadas con insecticidas quimicos y jo diferentes rotaciones de insecticidas microbiales y quimicos (Herrera, 1989; Chavez, 1989 y Mora, 1990). f) Utilización de Bt en el Control de la PDD La utilización de Bt para el control de PDD ha sido ampliamente evaluada y documentada a nivel mundial (Hernández, 1988; Vare1a y Guharay, 1987; Kennedy y Oatman, 1976; Herrera, 1989 y Mora, 1990). Rajamohan y Jayaraj (1978), citados por Hernández (1988), evaluaron la eficacia, de Bt y otros insecticidas para el control de PDD en el campo. Estos autores reportan que el tratamiento de Bt fue el más efectivo para reducir la -17- población larval durante el periodo inicial después del tratamiento, pero que su persistencia fue baja después de los 10 dias, debido a la acción de luz solar, lluvia y viento. Varela y Guharay (1987) reportan que el insecticida Bt (Dipel) fue el mejor tratamiento para el control de la PDD en Nicaragua comparado con tres insecticidas deltametrina, metamidofós y atribuyeron la baja efica-cia metomil. Estos de los insecticidas quimicos: autores quimicos evaluados al desarrollo de resistencia a los mismos por parte de la plaga. Tanada (1956), citado por Hernández (1988), reportó un adecuado control de la PDD a una concentración de 0.5 gr de esporasjgalón. Este autor encontró que a una concentración de 0.25 esporasjgalón el control no habia sido adecuado. Cerna y Donaire (1986), citados por Hernández (1988) evaluaron el efecto de varios insecticidas para el control de PDD en Honduras. Los insecticidas evaluados fueron cipermetrina, deltametrina, permetrina, ciflutrina, mevinfós, metamidofós, diazinón, metomil y Bt (Dipel). El tratamiento con Dipel (Bt), a una dosis de 375 gr/ha, y, en aplicaciones semanales fue el que mejor resultado dió para el control de la PDO. Estos autores encontraron además una alta resistencia de la PDD a piretroides. Kennedy y oatman (1976), evaluaron la combinación de Dipel (Bt) + pirimicarb comparados con la aplicación de metomil, en el control del complejo de lepidópteros en brócoli -18- (Trichoplusia ni (Hubner), Pieris rapae (L.) y PDD) y su efecto sobre el parasitismo. Durante la etapa de preformación de cabeza el tratamiento de 1.0 lb de Dipel + 0.25 lb de pirimicarbjacre controló significativamente el complejo lepidóptero, igual sucedió con el metomil (O. 45 lbjacre). El efecto de los tratamientos sobre el parasitismo de T. ni y PDD era mínimo a los 14 di as después de la aplicación, sin embargo, a los 6 y 7 días postratamiento, Dipel + pirimicarb interfirieron menos que el metomil en el parasitismo de estas plagas. Hernández (1988), no encontró diferencias significativas en el parasitismo de PDD por ~- insulare entre lotes tratados con Bt (Dipel PM 3.2%) (0.016 kg i.ajha) y lotes tratados con acefato (0.75 kg i.ajha), deltametrina (0.0125 kg i.ajha) y permetrina (0.125 kg i.ajha). Varios autores han observado un buen control de la PDD al mezclar insecticidas a base de Bt con insecticidas convencionales (Calderón, 1987; Krishnai y Mohan, 1983; Yen y Hsiao, 1977; citados por Herrera, 1989). Estos autores observaron efectos positivos al realizar mezclas, principalmente con insecticidas a los cuales la PDD ha desarrollado resistencia, tales como los piretroides. Calderón (1987) evaluó nueve tratamientos para el control de PDD que incluían las mezclas de permetrina+Dipel (Bt), permetrina+Thuricide (Bt) , deltametrina+Dipel y deltametrina+Thuricide y la aplicación de estos insecticidas -19- solos. El tratamiento que mostró el mejor control de la PDD fue permetrina+Dipel, aunque también fueron efectivos los tratamientos de permetrina+Thuricide y permetrina solo. El uso de mezclas, sin embargo, es ampliamente cuestionado, debido a que las mismas pueden acelerar y complicar el desarrollo de resistencia (Ning, 1987). Conclusiones similares sostiene Tabashnik {1986) quien afirma que las mezclas irrumpen la acción del control biológico, promueven la resistencia de plagas secundarias e intensifican la selección para resistencia cruzada. g) Resistencia a Bt Hasta hace poco se consideraba que el desarrollo de resistencia a Bt, bajo condiciones agricolas normales, era sumamente improbable (SANDOZ, 1985), sin embargo en 1986 se reportó el primer caso de resistencia leve en Hawaii (Gibbons, sf), reportándose, después de 1990, niveles altos de resistencia (Georghiu, 1989 citado por Tabashnik et al., l99l) . Tabashnik et al. (1991), determinaron que el desarrollo de resistencia a Bt por parte de la PDD era más acelerado en el laboratorio, que en el campo, debido a una mayor intensidad de selección en laboratorio. Ellos también determinaron, que la resistencia de la PDD en el campo decrece muy lentamente en la ausencia de presión de selección y que por lo tanto las rotaciones de Bt con insecticidas sintéticos no es una medida -20- efecti va para reducir el desarrollo de resistencia en el campo. Lo anterior es respaldado por Gibbons (sf) , quien afirma que la principal causa del desarrollo de resistencia, reportado en Hawaii, fue el uso intensivo de Bt en dosis muy altas por parte de los agricultores, quienes realizaban hasta 15 aplicaciones por ciclo de cultivo durante 1989, lo que resultó en una en una presión de selección muy alta sobre la PDD. Van Rie et al. (1990), afirman que la resistencia a Bt, por parte de larvas de lepidópteros, se encuentra altamente relacionada con una reducción en la afinidad del receptor de la membrana intestinal,hacia los cristales de proteína de la bacteria. Ellos encontraron una reducción de hasta 50 veces en la afinidad de estos receptores en larvas de la polilla de India de la harina (Plodia interpunctella). Varios autores sugieren que el desarrollo de resistencia a Bt se podria prevenir o reducir mediante una utilización más juiciosa que permita un mayor espaciamiento de las aplicaciones (Mora, 1990; Lim, (1987) y Tabashnik, 1983). Una alternativa viable es la de integrar el control microbial en un programa de MIP que incluya la utilización de variedades resistentes, prácticas culturales como cultivos intercalados, policultivos y rotación de cultivos, y preservación del control biológico existente (Gibbons, sf). -------·------ 2) Virus de la Polihedrosis Nuclear (VPN) Los virus son parasitos intracelulares obligados que se caracterizan por: a) la presencia de partículas virales (viriones) que contienen un solo tipo de ácido nucleico (ADN o ARN), b} la síntesis de proteínas especificas utilizando los ribosomas del hospedero y e} su multiplicación se realiza principalmente por la síntesis de sus partes componentes, que son ensambladas para producir la progenie del virus, más que por crecimiento y división celular (Kalmakoff, 1980). Las unidades infecciosas de los virus son los viriones, los cuales en algunos casos pueden ser la partícula viral completa, o algún componente de la partícula viral que es infecciosa bajo condiciones naturales (Kalmakoff, 1980). a) Antecedentes Las primeras referencias del reconocimiento del origen viral de enfermedades causadas por baculovirus datan del año 1909, cuando Wahl (1909) identificó como virus al agente causal de una enfermedad en Limantria monacha L. (Evans, 1985). Vail et al. (1972), aislaron el virus de la polihedrosis nuclear (VPN) de larvas de Autographa californica (A e) (Speyer) (Lepidóptera: Noctuidae) con el fin de evaluar la efectividad de este virus en el control de ¿. ni (Hubner) (Lepidóptera: Noctuidae) en el campo. Ellos recobraron subsecuentemente, de una de las parcelas, una larva de PDD infectada por VPN. -22- Pruebas posteriores de laboratorio confirmaron que el VPN de Ac era virulento para larvas de PDD cuando éstas eran alimentadas con una dosis de 104 cuerpos de inclusión polihédricos (CIP)jmm2 (Vain et al., 1972). b) Clasificación y Descripción del VPN La clasificación genérica más aceptada es la propuesta por Wildy (1971), citado por Bustillo (1989) la cual divide los virus en dos grandes grupos de acuerdo a la composición de su ácido nucleico (ADN o ARN). Para fines prácticos, Bustillo (1989), divide los virus en 5 grupos: 1) baculovirus, 2) virus citoplasmáticos, 3) entomopoxivirus, 4) virus densonucleados y 5) virus iridiscentes. El virus de la polihedrosis nuclear {VPN) pertenece al grupo de los baculovirus (grupo 1), siendo en la actualidad uno de los entomovirus más usados en programas de MIP (Bustillo, 1989). El VPN pertenece a la familia Baculoviridae, cuyas caracterlsticas principales son: a) la presencia de un cuerpo de inclusión (CI) de forma polihédrica, el cual es una matriz de protelna de aproximadamente 50 x 250 nm, y b) la presencia de viriones encapsulados conteniendo un doble ramal de ADN viral, en un arreglo helicoidal, cuyo rango va desde 50-100 millones de Daltons. Estos viriones se encuentran, a su vez, encerrados dentro del CI (Bilimoria, 1985). Dentro de la familia Baculoviridae el género Baculovirus -23- es el más descrito. Este género se divide en dos subgrupos aceptados de virus: a) virus de la polihedrosis nuclear (VPN) y b) virus granulados o virus de la granulosis (VG). Existen, además, otros dos subgrupos propuestos de virus no nucleados. Los VG se caracterizan por presentar solamente un virión encapsulado (nucleósido) por cada CI, a diferencia de los VPN, que se caracterizan por presentar varios nucleósidos encerrados dentro del CI (Federici, 1985). Los VPN se dividen a su vez en dos grupos morfológicos: a) los nucleósidos simples VPN (NSVPN) (especies tipo Bombix mori NSVPN) , en los que solamente es encontrado un nucleósido por envoltura y b) los multinucleósidos VPN (MVPN) (especies tipo Autographa californica MVPN), en los que existen varios nucleósidos (1-17) empacados por envoltura (Granados, 1980). e) Modo de Acción y síntomas del VPN El modo de acción del VPN es por ingestión. su principal lugar de entrada es a través del epitelio del intestino medio. Los cuerpos de inclusión (CI) de los VPN son disueltos en el lumen del intestino medio, liberándose los viriones, los cuales pasan a través de la membrana peritrófica y entran en contacto con los microvellos de las células columnares. Una vez en contacto con los microvellos, los viriones se replican para posteriormente entrar al hemocelo e infectar otros tejidos (Granados, 1980) _ -24- Harrap (1970), citado por Granados (1980), sugiere que los nucleósidos envueltos (viriones) son absorbidos por la membrana plasmática de los microvellos. La subsecuente fusión de la envoltura del virus y la membrana plasmática permite la liberación de los nucleósidos en el interior de los microvellos y eventualmente en el interior de las células del citoplasma. La absorción, fusión y entrada del virus usualmente demora aproximádamente 1-4 horas después de la ingestión (Wilding, 1986). Los viriones pueden ser liberados en el cuerpo del hospedero o pueden permanecer dentro de los cuerpos de inclusión (CI). Los viriones liberados se replican en el núcleo de las células infectadas del hemocelo, principiando aqui, la lisis y desintegración de las células en los tejidos de las larvas (Agricola el Sol, (1990)). La muerte de las larvas de PDD ocurre generalmente entre los 3-4 dias después de la ingestión. Antes disminuye. in tegumento de morir, las larvas se hinchan y su actividad Al morir, las larvas se tornan flácidas y el se rompe, provocándo que la larva adopte una coloración oscura. Las larvas afectadas por el virus suben y se acumulan en las partes altas de las plantas. Esto permite la liberación de los cuerpos virales de inclusión protéica (viriones) , que se han replicado dentro de las larvas muertas, y que pueden continuar infectando más larvas en el campo (Agricola 11 El Sol", (1990)) _ -25- Los VPN también pueden ser trasmitidos a través de generaciones, existiendo dos posibles formas de trasmisión: 1) trasmisión a través de la superficie de huevos contaminados, la cual es llamada transovum y 2) trasmisión en el interior del huevo, la cual es llamada transovarial veeresh, 1989). (Padmavathamrna y d) Utilización de VPN en el Control de PDD y Principales Formulaciones comerciales Wilding (1986), afirma que los VPN son los principales entomovirus en el control de la PDO. Burgerjon (1977}, citado por Wilding (1986), evaluó la infectividad de dos aislamientos de VPN para el control de larvas de lepidópteros incluyendo PDO. Uno de los aislamientos era de Autographa californica (Speyer) y el otro era de Gallería mellonella (L.}. El aislamiento de Q. mellonella fue ligeramente más virulento que el de ~- californica, matando el 86% de las larvas probadas. La concentración requerida para PDD fue muy alta, sin embargo, este virus mostró ser muy virulento para ciertas de las otras especies evaluadas. Otro VPN aislado de PDD también presentó una CL-50 bastante alta (1.5 x 104 virionesjmm2) para larvas de tercer estadio de PDD, comparada con la CL-50 para larvas de~- ni y Spodoptera ornithogalli (Guenee) (Lepidóptera: Noctuidae), tratadas con el mismo virus (menos de 1 viriónjmm2) (Wilding, 1986). -26- Un VPN aislado de PDD para determinar su control sobre la PDD, produjo un 42% de mortalidad después de siete dias (Wilding, 1986). Vail et al. (1972), determinaron que el VPN aislado de PDD era el mismo virus aislado de ¿. ni y que este virus podia, potencialmente, infectar ambas familias, Noctuidae y Plutellidae. Pruebas de laboratorio indican que los virus pueden tener potencial para el control de la PDD. Sin embargo, actualmente, existen muy pocas formulaciones comerciales a base de virus (Wilding, 1986). En Centroámerica existen dos formulaciones comerciales a base de VPN: 1) VPN-80 a base del VPN de Autoqrapha califoYnica (VPN de Ac) y 2) el VPN-82 a base del VPN de Spodoptera sunia. En Honduras, la eficacia de estas formulaciones a nivel de laboratorio y campo no ha sido evaluada. En el presente estudio se evaluó la eficacia del VPN-80 en el control de PDD. D. utilización de Epocas o Criterios de Aplicación Una de las principales medidas para vencer el desarrollo de resistencia a los insecticidas microbiales es la utilización de criterios de aplicación, como medida complementaria en un programa de MIP basado en la preservación del control natural (Lim, (1987)). Una de las estrategias para reducir el número de aplicaciones es el uso de umbrales de acción, que consiste en ------- -27- la utilización de la información de la infestación de la plaga para decidir el momento óptimo de la aplicación del producto (Carballo et al., 1989). Lo anterior fue respaldado por Morisak et al. (1984) quienes determinaron que el número de aplicaciones realizadas durante las etapas de preformación y formación de cabeza, se podía reducir utilizando niveles de acción o porcentaje de plantas infectadas. La evaluación de diferentes criterios de aplicación para el control de la PDD ha sido estudiada por numerosos autores {Carballo et al., 1989¡ Carballo y Hurska, 1989; Shelton et al., 1983; Sears et al., 1983; Morisak et al., 1984 y Hoy et al., 1985). Chalfant et al. (1979), utilizaron el criterio de 1-2 hoyos nuevos por planta, examinando la cabeza más cuatro hojas envolventes, para realizar las aplicaciones. Ellos lograron una reducción de 4-12 aplicaciones sin pérdida significativa de repollo comercializable y afirman que este criterio de decisión requiere menor tiempo que los conteos larvales. También demostraron que las aplicaciones pueden iniciarse cuando se inicia la formación de cabeza. Kirby y Slosser {1984) evaluaron niveles criticas entre 0.1 y 0.5 larvas de PDD, ~- rapae y¿. ni por planta, después de iniciada la formación de cabeza y sin aplicar insecticidas en las etapas previas. Los rendimientos fueron superiores al 80% cuando se utilizaron los niveles desde 0.1 a 0.5 larvas durante todo el ciclo, por lo que se concluyó que un nivel de -28- 0.3 larvas por planta era adecuado para obtener buenos rendimientos. Similares resultados reporta Sears et al. (1985), quienes obtuvieron rendimientos superiores al 95% utilizando diferentes criterios de decisión, entre ellos, el de 0.5 larvas por planta. Ellos realizaron solamente una aplicación en las etapas previas a la formación de cabeza y muestrearon en la cabeza más 10 hojas envolventes. Carballo et al. (1989) determinaron que un 10% de daño nuevo, en las cabezas del repollo, era al mejor criterio de aplicación, al precio promedio del repollo durante 1988 en costa Rica. Esta recomendación conduce a que se reduzcan siete aplicaciones de insecticidas con respecto al criterio de aplicación calendarizada. Además de los niveles críticos, es importante considerar la etapa o periodo crítico del cultivo y la época o estación del año (verano versus invierno), al momento de decidir las aplicaciones. Carballo et al. (1989), afirman que la infestación de la PDD es baja durante el invierno debido a que la lluvia reduce la oviposición y actua como un factor de mortalidad directa sobre las larvas pequeñas de la PDO. En el verano la infestación de la plaga alcanza niveles intolerables, principalmente durante la etapa de formación de cabeza, debido a la ausencia de lluvias. Carballo y Hruska (1989) determinaron que la infestación de PDD durante la etapa de preformación de cabeza era muy -29- baja, por lo que concluyen que los niveles de infestación en la primera etapa no son criticas para obtener buenos rendimientos en repollo y que, por lo tanto, se pueden omitir las aplicaciones de insecticidas durante esa etapa. Estos autores encontraron que la etapa más crítica de aplicación de insecticidas era el inicio de formación de cabeza (etapa III) (7-12 semanas después del trasplante), existiendo una alta relación (r= 0.76) entre el número de larvas de PDD, en esta etapa, y el rendimiento comercial de repollo. III. FASE DE LABORATORIO A. Sistemas de Producción Masiva de Larvas de PDD 1) Introducción Para lograr una mayor precisión en las pruebas de CL, se requiere de la utilización de un gran número de larvas de PDD de edad uniforme, que permitan reducir al máximo el error experimental. La utilización de un método eficiente y factible de producción masiva de larvas es, por lo tanto, indispensable para lograr llevar a cabo pruebas de CL precisas y confiables en un periodo de tiempo razonable. Un método de producción de larvas, para ser eficiente y factible, debe reunir varios requisitos fundamentales: a) permitir producir una gran cantidad de larvas de edad uniforme, b) ser fácil de implementar y manejar, y e) ser económico y emplear materiales disponibles en el medio o fáciles de hacer o conseguir. 2) Objetivo a) Desarrollar un sistema eficiente y factible de producción masiva de larvas de PDO de edad uniforme que permitiera realizar pruebas de CL confiables y en un corto período de tiempo. 3) Materiales y Métodos Se avaluaron secuencialmente, a través del tiempo, un total de cinco sistemas de produción masiva de larvas de PDD, los cuales se detallan a continuación: a) sistema caja-Plántula Individual: Fue el primer sistema evaluado y es muy similar al utilizado por el centro de Control Biológico para centro América (CCBCA) de la Escuela Agrícola Panamericana. En este sistema, las pupas de PDD recolectadas en el campo fueron colocadas en cajas de madera de 70 X 35 x 35 cm, con cubierta de vidrio, en cuyo interior se colocaron plántulas de repollo en maceteros individuales que sirvieron de hospederas para la oviposición de las hembras. Las plántulas de repollo fueron retiradas después de la eclosión de los huevos de PDD, cuando la mayoría de las larvas habían alcanzado el segundo estadio, aproximadamente a los 8 a 12 días después de colocadas en las cajas. Las hojas de es~as plántulas fueron cortadas en pedazos, los cuales fueron colocados sobre otras plántulas de repollo, para que las larvas pasaran a la nueva plántula hospedera y alcanzaran el tamaño deseado (tercer estadio) . Este sistema no dio resultado por tres razones: a) las plántulas de repollo no duraban lo suficiente en el interior de las cajas, debido principalmente a la dificultad para regarlas, b) la pérdida de pupas en el interior de las cajas -32- por pupas parasitadas o enfermas provenientes del campo, y e) el dificil control sobre la edad de los adultos en las cajas, que dificultaba el cálculo de adultos activos sexualmente en el interior de las mismas. Al acortar el tiempo de permanencia de las plántulas en el interior de las cajas, se presentaron problemas por excesiva pérdida de larvas debido a la caída de las larvas pequeñas de PDD al mover las plántulas de repollo. b) sistema Jaula de Tela Metálica-Plántula Individual: Fue el segundo sistema de producción de larvas de PDD evaluado y surgió como una posible alternativa para reducir los problemas de mantenimiento y pérdida excesiva de larvas por manipulación del sistema anterior. En este sistema, las pupas de PDD fueron colocadas en grupos de 50 en vasos plásticos pequeños (2.5 cm de alto y l. 7 5 cm de diámetro) . cada vaso conteniendo 5o pupas fue colocado, a su vez, en el interior de jaulas cilíndricas (45 cm de alto y 30 cm de diámetro) hechas de dos capas de tela metálica: a) una capa exterior de tela metálica gruesa que servía para darle consistencia a la estructura de la jaula y b) una capa interior de tela metálica fina que servía para evitar la fuga de los adultos por los agujeros de la tela metálica gruesa. La parte superior de las jaulas era cubierta con una capa de malla fina (40 x 40 cm), sujeta con un elástico rodeando la -33- circunsferencia externa de la misma, la cual servía para evitar la fuga de los adultos de PDD. En el interior de cada jaula cilíndrica fueron colocadas, además de los vasos conteniendo las pupas: a) cuatro plántulas de repollo del híbrido Izalco (Northrup King) , en maceteros individuales, para que sirvieran de hospederas para la oviposición de las hembras, y b) dos vasos conteniendo mechas de algodón humedecidas con una solución de agua y azúcar al 20%. Este sistema ofrecía dos ventajas con respecto al anterior: a) permitía un mejor mantenimiento de las plántulas debido a que era posible regar las mismas en su interior y b) facilitaba el sacado de las mismas cuando habian sido ovipositadas. A pesar de las ventajas ofrecidas, este sistema no fue exitoso para la producción masiva de larvas de PDD debido principalmente a cuatro razones: a) excesiva falta de luz en el interior de las jaulas que ocasionaba un rápido deterioro de las plántulas de repollo, b) excesiva pérdida de adultos por escape al momento de regar o sacar las plántulas de repollo de las jaulas, c) mortalidad excesiva de adultos que al tratar de escapar quedaban con las patas atrapadas en las capas de tela metálica o en la capa de malla fina de la parte superior, y d) falta de control sobre las pupas colocadas en el interior de las jaulas, las cuales muchas veces estaban parasitadas o no emergían por estar muertas debido -34- posiblemente a aplicaciones de insecticidas realizadas por los agricultores en el campo, o a patógenos existentes en el mismo. e) sistema Botella Plástica-Plántulas Chorro Corrido: Fue el tercer sistema evaluado y surgió como una alternativa a la poca durabilidad de las plántulas y a la excesiva pérdida de adultos de PDD del sistema anterior. Este sistema es muy similar al utilizado en la universidad de Cornell (New York, E.U) y fue sugerido por el Ing. Marvín Mora (comunicación personal}. En este sistema, las pupas de PDD fueron colocadas en el interior de vasos plásticos pequeños (2.5 cm de alto x 1.75 cm de diámetro) los cuales a su vez fueron colocados en el interior de botellas plásticas trasparentes (21 cm de alto x 11 cm de diámetro). La parte superior de las botellas plásticas estaba cubierta con dos capas de malla fina de 15 cm x 15 cm sujetas por un elástico que rodeaba la circunferencia externa de la parte superior de la jaula. La capa inferior de malla fina servía para sostener una mecha de papel aluminio arrugado (6 x 20 cm), la cual era impregnada con jugo de hojas de repollo trituradas en agua potable, y la capa superior servía para sellar la jaula y evitar la fuga de los adultos. En el fondo de las botellas se abrió un pequeño agujero (1 cm de diámetro), para permitir la introducción de una mecha -35- de algodón humedecida con agua y azúcar al 20%. El número de pupas colocadas inicialmente en cada jaula fue 15, pero debido a la escasa oviposición, este número se incrementó gradualmente hasta llegar a 50 adultosjjaula, cuando se logró una alta oviposición. Los huevos ovipositados sobre las mechas de papel aluminio fueron colocados en plántulas de repollo del hibrido Izalco sembradas a chorro corrido en palanganas plásticas (45 cm ancho X 45 largo x 20 cm de altura) . Este sistema permitió solucionar los problemas de mantenimiento de plántulas y pérdida excesiva de larvas yjo adultos de PDD de los dos sistemas anteriores, sin embargo no resultó exitoso principalmente por cuatro razones: a} alta mortalidad de pupas en el interior de las botellas plásticas durante la emergencia debido al amontonamiento de pupas yjo sus capullos, además de la presencia de pupas parasitadas o enfermas provenientes del campo, las cuales eran muy difíciles de detectar, reduciendose significativamente la cantidad de adultos potenciales por jaula, b) poca durabilidad de la plántulas en los maceteros lo que hacia muy dificil coordinar la produción de huevos con la disponibilidad de hospederos para los mismos, y e) alta pérdida de huevos debido a que muchos eran oviposi tados sobre las paredes de las botellas plásticas de oviposición en lugar de ser ovipositados sobre las mechas de papel aluminio colocadas para ese proposito. --------------- d) Sistema Caja-Botella de Oviposición-Plántulas Chorro Corrido: Este sistema es una variante del sistema anterior que surgió por la necesidad de solucionar las deficiencias en la producción de larvas de PDD observados en el mismo. La principal modificación en este sistema fue la combinación de las cajas de madera (70 X 35 x 35 cm), de las utilizadas en la primer sistema, con el uso de botellas plásticas de oviposición (21 cm de altura x 11 cm de diámetro} para los adultos recién emergidos. Esta modificación permitió tener un control seguro sobre el número de adultos colocados por jaula y por lo tanto eliminó el problema de pérdida de adultos en las jaulas por pupas parasitadas o enfermas provenientes del campo y por pupas que no pudieron emerger de los vasitos plásticos por barreras flsicas. Para solucionar el problema de la alta oviposición sobre las paredes de las botellas plásticas de oviposición se probó, con éxito, frotar fuertemente hojas de repollo sobre las mechas de papel aluminio arrugadas, en lugar de sumergir éstas sobre el jugo de hojas de repollo con agua como se hacia anteriormente. El éxito de esta práctica se debió a que las mechas de papel aluminio quedaron impregnadas con un olor a repollo más fuerte y duradero que incrementó la atracción de las hembras para ovipositar sobre las mismas. Este sistema, sin embargo, tampoco fue exitoso debido principalmente a tres razones: 1.- Poca durabilidad de las plántulas de repollo sembradas a ·---------·-·---- -37- chorro corrido en los maceteros, que hacia imposible coordinar la producción de huevos con la disponibilidad de plántulas huéspedes. La corta duración de las plántulas era debida principalmente a problemas de drenaje del agua de riego y a una excesiva mortalidad por la incidencia de mal del talluelo causada por Pythium spp. Para solucionar el problema de drenaje se evaluaron diferentes medios de crecimiento en los cuales se incrementó paulatinamente la proporción de arenajtierra, hasta llegar a una proporción de 4/1. Para solucionar el problema de mal del talluelo se desinfestó el medio de crecimiento utilizando ethazol (Truban) ( 4. 5 g de i. ajrn3) . A pesar de las medidas tomadas, la durabilidad de las plántulas de repollo sembradas a chorro corrido continuó siendo bastante baja debido posiblemente a un excesivo calor en las raices generado por la palangana plástica y a la alta densidad de plántulas de repollo en las mismas. 2.- Pérdida excesiva de larvas pequeñas de PDD. Las larvas de PDD generalmente tenian que ser retiradas temprano (primero y segundo estadio) de las plántulas de repollo sembradas a chorro corrido debido a la poca duración de las mismas. Estos causaba la pérdida de muchas larvas pequeñas que se arrojaban al suelo al agitar o mover las plántulas, y 3.- Alta mortalidad de larvas pequéñas de PDD, debido principalmente a la fragilidad de las mismas y a su poca -38- habilidad para pasar de las hojas de repollo de las plántulas a chorro corrido a las hojas de las plántulas en maceteros individuales que les eran proveidas. e) sistema caja-Botella de Oviposición- Plántula Individual: Fue el último de los sistemas desarrollados y el único que perroi tió obtener una gran cantidad de larvas de tercer estadio de edad uniforme. Es una variante del sistema anterior cuya principal diferencia es la utilización de plántulas de repollo en maceteros individuales, en lugar de las plántulas a chorro corrido en palanganas. con esta modificación se eliminaron los problemas de baja durabilidad de las plántulas a chorro corrido y de alta mortalidad de larvas pequeñas de PDO. 1.- Materiales y métodos La mayor parte de los huevos fueron ovipositados sobre las mechas de papel aluminio. Estas mechas, conteniendo huevos, fueron retiradas de las jaulas cada dos dias, realizándose un conteo visual del número de huevos ovipositados en las mismas. se registró la producción de huevos de 10 jaulas para cada una de las dos poblaciones de PDD en estudio: Valle del Zamorano (VZ) y San Juan del Rancho (SJR), haciendo un total de 20 jaulas cuya producción fue registrada. ----------- -39- Después del conteo visual de huevos, las mechas fueron cortadas en pedazos de 12 cm2 (2 x 6 cm), y adheridas sobre el haz de hojas de plántulas de repollo del híbrido Izalco (Northrup King) de 25-35 días de edad, sembradas en maceteros individuales. Las larvas de tercer instar de la primera generación (Fl) obtenidas de los huevos, fueron las utilizadas en los estudios para determinar las diferentes concentraciones letales (CL). 2.- Resultados y discusión La producción promedio de huevosjjaula obtenida de 10 jaulas para cada una de las dos poblaciones de PDD en estudio (VZ y SJR), a los 2, 4, 6, a y 10 días después de la emergencia de los adultos (dde), se encuentran resumidas en el Cuadro 1. No se encontraron diferencias estadisticas significativas (P< O. 10) en la producción de huevos de PDD/j aula entre poblaciones de PDD, en ninguna de las cinco fechas en que se registró la producción de huevos, ni en el número total de huevosjjaula. El pico de producción huevosjjaula para ambas poblaciones {VZ y SJR) fue alcanzado a los 2 dde {Gráfico a, Figura 1), registrándose un promedio de 898 huevosjjaula (cuadro 1) Después de los 2 dde de PDD, la produción de huevos fue declinando hasta llegar a cero a los 12 dde en todas las CUADRO 1. Di as ( 2) 2 4 6 8 10 TOTAL ------·-·· -·--. ··---· -40- Producción promedio de huevos de PDD obtenida de 10 botellas de oviposiciónsjpoblación de PDD, con el sistema de produccion masiva de larvas denominado caja-botella de oviposición-plántula ( 1) . PRODUCCION PROMEDIO DE HUEVOS/JAULA (3) 898.0 643.0 49l. 2 17l. 5 72.3 2277.2 (1) Producción promedio de huevos obtenida de 10 jaulas para cada una de las dos poblaciones de PDD, para un total de 20 jaulas cuya producción fue registrada. (2) O{as después de la emergencia de los adultos (3) Cada jaula evaluada contenía un total de 50 adultos de PDO. 41 - r.lo. Promedio de huevos/jauta 1000 800 600 400 200 2 4 6 DI AS 8 Valle del Zamorano San Juan del Rancho 10 Grtlflco a. Curva normal de producción de huevos!)aula obtenida de dos poblac!ones de PDD: VZ y SJR. 12 tlo, de huevos acumulado/jaula zsoo,C~~~~~~~~~~------------------------~ 2000 1500 --- ' -1000 ' 500 o 2 FIGURA 1. --- --- --- ,~ 4 6 --------- OlAS --- ••••• -·· ,,4•••• •••••••••••• -----· Valle del Zamorano -+- San Juan del Rancho 8 10 12 Gráfico b, Producción acumulada de huevos/jaula obtenida de dos poblaciones de PDD: VZ y SJR. Curvas promedio de producción de huevos/jaula normal y acumulada obtenidas de 10 jaulas en cada una de las dos poblaciones de PDD: VZ y SJR -42- jaulas evaluadas (Gráfico a, Figura 1) La producción total de huevos de PDDjjaula fue en promedio de 2,227 huevos, el 39% de los cuales (898 huevos) fue ovipositado a los 2 dde, y el 68% (1,541 huevos) en los primeros 4 dde. Esta concentración en la oviposición es muy ventajosa cuando se quiere obtener un gran número de larvas de PDD de edad uniforme (Gráfico b, Figura 1) . No se registró la produción de larvas de PDDjjaula obtenida en este sistema debido a la dificultad para contar las larvas recien eclosionadas; sin embargo, se estimó la pérdida del 90 a 95% de los huevos ovipositadosjjaula, entre el número de huevos producidos y el número de larvas de PDD utilizables para las pruebas de CL. La alta pérdida de huevos de PDD/jaula fue debida principalmente a cuatro factores: a) infertilidad de los huevos, b) dano mecánico de los huevos por manipulación, e) pérdida de larvas huevosjplántula de pequeñas repollo, por excesiva que ocasionaba carga de una rápida defoliación de las plantulas cuando los huevos eclosionaban, y d) pérdida de larvas por la edad desuniforme de algunas. Observaciones realizadas en el laboratorio muestran que tres jaulas (50 adultosjjaula) montadas al mismo tiempo, proporcionaron de 280 a 350 larvas de PDD de tercer estadio, las cuales eran suficientes para montar una prueba de concentración letal, en un período de tiempo de 15 a 17 días después de montadas las jaulas, tomando en cuenta el tiempo ------------ -43- que tardaron los huevos en eclosionar y las larvas en desarrollarse hasta llegar al tercer estadio. 3.- Conclusiones y Recomendaciones a) El sistema más eficiente y factible para la producción masiva de larvas de PDD fue el denominado caja-botella de oviposición-plántula individual. b) La produción total de huevos de PDOjjaula con este sistema fue en promedio de 2,277 huevos, un 68% de los cuales fue oviposi tado durante los primeros cuatro días después de la emergencia de los adultos. e) Se observó una alta pérdida de larvas pequeñas de PDD debido principalmente a la colocación de un número excesivo de huevos por plántula de repollo. d) Se recomienda realizar pruebas para determinar un rango apropiado del número de huevos de PDD a colocar por plántula de repollo, con el objetivo de reducir la pérdida de larvas debida a una carga excesiva de larvasjplántula. -----·------------ A. Concentraciones Letales de Ocho Insecticidas Microbiales a Base de Bacillus thurinqiensis Berliner var. Kurstaki (Bt) sobre Dos Poblaciones de PDD. 1) Introducción La determinación de las diferentes concentraciones letales para insecticidas microbiales es de gran utilidad para determinar la infectividad de los mismos sobre los estadios susceptibles de la plaga. Las concentraciones letales pueden utilizarse también para determinar la virulencia, y por ende, el potencial de control de diferentes microorganismos o diferentes cepas de microorganismos. La CL-50, particularmente, puede ser utilizada para determinar la presencia de resistencia o para mantener un monitoreo continuo de la susceptibilidad de poblaciones de PDD sometidas a condiciones particulares de manejo. 2) Objetivos a) Determinar, bajo condiciones de laboratorio, la CL-10, CL-50 y CL-90 de ocho insecticidas microbiales a base de Bt, para dos poblaciones de PDD sometidas a diferente manejo, a las 48, 72 y 96 horas después de la exposición de las larvas (hdel) . b) Determinar los niveles de susceptibilidad de dos poblaciones de PDD, sometidas a diferente manejo y factores ambientales, a diferentes formulaciones microbiales. e) Comparar la potencia relativa de formulaciones microbiales con respecto a la formulación Dipel utilizada como formulación -45- base. d) comparar la concentración de cada formulación a la dosis media recomendada por el fabricante con la CL-90 a las 72 hdel. 3) Materiales y Métodos a) Descripción de las Zonas en Estudio se estudiaron dos poblaciones de PDD provenientes de dos zonas productoras de repollo con diferentes condiciones climáticas y de manejo de esta plaga en el campo: 1.- Valle del zamorano (VZ): 800 msnm. Zonas alrededor de la EAP recientemente cultivadas con cruciferas (brócoli y repollo) (1991)' donde se utilizan insecticidas convencionales, principalmente deltametrina) , organofosforados carbamatos (metomil) . Las piretroides (fenvalerato y (malathion y metamidofós) y recolecciones se realizaron únicamente en lotes ubicados fuera de la EAP, recolectándose las pupas de PDD de lotes de repollo y brócoli ubicados en el mismo valle (valle del Zamorano o valle de Yeguare). 2.- San Juan del Rancho (SJR): 1,200 msnm. Zona donde se ha cultivado intensivamente repollo durante más de 7 años y donde se comenzaron a utilizar insecticidas microbiales a base de Bt desde 1987. Estos insecticidas microbiales (Bt) han sido -46- utilizados en forma poco intensiva, principalmente mezclados o en rotación con otros insecticidas piretroides, organofosforados yjo carbamatos. de los grupos La pupas de PDD fueron recolectadas de lotes de repollo únicamente. b) Pruebas de Concentración Letal (CL) 1.- Localización y fecha de las pruebas Las pruebas se realizaron en el laboratorio de entomología de la Escuela Agrícola Panamericana "El Zamorano" (EAP) (800 msnm) de octubre de 1991 a abril de 1992, bajo condiciones ambientales de temperatura y humedad relativa. 2.- Diseño experimental y tratamientos Para la determinación de las concentraciones letales se utilizó la metodología descrita por Tabashnik et al. (1987), la cual se basa en la utilización de seis concentraciones para cada insecticida por separado, distribuidas en un diseño experimental completamente aleatorio (DCA) , con cuatro repeticiones para cada una de las seis concentraciones. Las seis concentraciones evaluadas fueron: a. 10X= dosis 10 veces mayor que la dosis media de campo recomendada por el fabricante b. X= dosis media de campo recomendada por el fabricante c. 0.1X= dosis 10 veces menor que la dosis media de campo -47- d. 0.01X= dosis 100 veces menor que la dosis media de campo e. o.001X= dosis 1000 veces menor que la dosis media de campo, y f. ox= testigo sin Menteno (Nu Film 17 destilada. insecticida (agua + adherente DI-1- p 96%)) al O. 06% del volumen de agua La solución 10X (solución madre) era la base para la preparación de las demás concentraciones, las cuales se obtenian mediante diluciones sucesivas con agua destilada (pH 5.80 a 5.85). Después de obtenidas las seis concentraciones, se sumergian cuatro pedazos, circulares (6 a 7 cm de diámetro), de hojas tiernas de repollo (centro de la cabeza) por cada concentración. El tiempo de inmersión fue de cinco segundos, después de los cuales, las hojas eran dejadas secando al aire durante una hora antes de ser usadas. Para el secado, la hojas fueron adheridas con un alfiler sobre cintas adhesivas colgando al aire, evitándose al máximo el contacto entre las hojas y las cintas. Después del secado, las hojas fueron transferidas a platos petri (9 y lO cm de diámetro del plato y la tapadera, respectivamente) previamente lavados con agua destilada y esterilizados en un autoclave (115 °C, 15 PSI) durante 20 minutos. Se colocó una hoja de repollo por cada plato petri sobre una hoja de papel filtro (9 cm de diámetro) humedecida con -48- agua destilada y colocada en el fondo del plato petri. El objetivo de la hoja de papel filtro humedecida era mantener una alta humedad relativa en el interior del plato petri, para evitar la deshidratación prematura de las hojas de repollo y prolongar asi la duración de las mismas. El lavado de los platos petri con agua destilada y su posterior esterilización fueron dos factores muy importantes para reducir la mortalidad en el testigo y por ende el error experimental en las pruebas. Inicialmente, se lavaban los platos petri con hipoclorito de sodio (2%) para después ser enjuagados con agua destilada y posteriormente esterilizados. Un estudio para evaluar la mortalidad causada por seis tipos de testigo demostró que el lavado con hipoclorito de sodio, previa esterilización, causaba una alta mortalidad de larvas de PDD debido, posiblemente, a una alta susceptibilidad de las mismas al cloro. El lavado de los platos petri con agua destilada también mostró ser mejor que el lavado con agua potable (corriente). Después de colocadas las hojas de repollo en los platos petri se procedió a colocar 10 larvas de PDD de tercer estadio en cada plato petri. Estas larvas eran de la primera generación (Fl) obtenida de las pupas recolectadas en el campo y producidas mediante la metodología previamente descrita en las páginas de la 44 a 49. Las formulaciones comerciales de Bt y las dosis y las dosis y concentraciones evaluadas se describen en el Cuadro 2. -49- CUADRO 2. Descripción de los tratamientos a base de Bt evaluados en las pruebas de concentración letal a nivel de laboratorio. Formulación Dosis ( 1) mgjml (2) SJR--VZ (3) Dipel ES BOO ml 1.887 mg + + Bt. Nicaragüense 800 ml 2.363 mg + + MVP 800 ml 2.223 mg + + Bactospeine PS 800 g 2.286 mg + + Thuricide HP 800 g 2.286 mg + + Javelin WG 300 g 0.86 mg + + Bactec 750 g 2.145 mg + + Novo Biobit HP 800 g 2.285 mg + nsr BST 800 ml 2.223 mg nsr + (1} Dosis de producto comercial/ha. Se utit Lz:ó la dosis media de carrpo recomerdada por el fabricante o estimada. (2) Concentración en mg de producto comercial/m[ de agua destilada. Fue calculada en base a un volumen de 350 l de agua/hectarea. (3) SJR= San Juan del Rancho. VZ= Valle del Zamorano. += se evaluó. nsr= no se realizó. -50- Se evaluaron un total de ocho insecticidas sobre dos poblaciones de PDD de dos localidades, totalizándo 16 pruebas de CL. se contó el número de larvas de PDD muertas en cada plato petri, a las 24, 48, 72 y 96 hdel. Se determinó las CL (CL- 10, CL-50 y CL-90} y la pendiente de respuesta logarítmica para las diferentes formulaciones a las 48, 72 y 96 hdel, utilizando el procedimiento de análisis estadistico PROBIT (Finney, 1971), con el programa POLO-PC de análisis estadísticos (Leora Sofware, 1987). Solamente se utilizaron lineas de regresión con índices de significancia para la estimación de potencia (g) menores que 0.10 y una probabilidad (P) menor que 0.05. Se determinó la potencia relativa de todas las formulaciones evaluadas con respecto a Dipel, para ambas poblaciones de PDD (VZ y SJR) a las 72 hdel. Se utilizó Dipel como formulación base para las comparaciones debido a que es la formulación más conocida y más utilizada actualmente en Honduras. Se comparó la concentración recomendada por el fabricante (C.F) (mg de producto comercialjml de agua destilada) con la CL-90 obtenida a las 72 hdel de PDD para cada formulación en cada población (VZ y SJR) por separado, determinándose la tasa (Tasa= C.F/CL-90) de la relación entre la C.F y la CL-90 obtenida a las 72 hdel. Se comparó la respuesta obtenida para una misma -51- formulación sobre las dos poblaciones de PDD a las 72 hdel, con el objetivo de determinar diferencias en la susceptibilidad de ambas poblaciones de PDD para cada formulación por separado. Los parámetros utilizados para realizar las comparaciones y determinar si la respuesta en ambas poblaciones era similar o diferente fueron: a) los valores de las CL y b) las pendientes de las lineas de respuesta logaritmica, determinandose también la potencia relativa de cada formulación en una población de PDD con respecto a la otra. 4) Resultados y discusión Concentraciones letales y pendientes de respuesta logarítmica El resumen de los resultados de las CL y las pendientes de la lineas de respuesta de las ocho formulaciones de Bt sobre las dos poblaciones de PDD a las 72 hdel se encuentran resumidos en los Cuadros 3 y 4. Los resultados para estos mismos parámetros obtenidos a las 48 y 96 hdel se encuentran resumidos en los apendices del 1 al 4. Otros parámetros presentados en los cuadros 3 y 4 son los valores del factor de heterogenidad (H) y el indice de significancia para la estimación de potencia {g) . El H es el principal parámetro para medir el ajuste de la mortalidad, observada en las pruebas, al modelo de regresión lineal utilizado para determinar las CL. Valores de H mayores que -52- uno indican un ajuste pobre de los datos al modelo de regresión utilizado (Finney, 1977 citado por Polo-Pe , 1987), y por lo tanto los resultados obtenidos deben utilizarse con precacución (Pereira y Rueda, (1989)). El g es el valor estadístico utilizado para calcular los limites de confidencia a tres niveles: 0.90, 0.95 y 0.99. Valores de g mayores que uno indican que los valores de las CL calculados podrían estar fuera de los límites establecidos por el análisis, y por lo tanto los resultados deben interpretarse con precaución (Finney, 1971). Las pendientes de la línea de respuesta y los valores de las CL son dos parámetros muy importantes para estimar la virulencia de formulaciones microbiales. A más bajos sean los valores de las CL, menor concentración de insecticida se requerirá para matar una determinada cantidad de individuos de la plaga y, por ende, más infectivo será el insecticida. Por otro lado, a mayor sea la pendiente de la línea de respuesta, menor será el incremento en la cantidad o concentración de insecticida necesario para matar un mayor número de individuos de la plaga. Se encontraron diferencias significativas (P~ 0.05) a las 72 hdel en los valores de las CL y en las pendientes de las líneas de respuesta, entre las formulaciones de Bt en ambas poblaciones de PDD, lo que demuestra que existen diferencias en la virulencia de las formulaciones hacia PDD. Las formulaciones que mostraron la mayor virulencia a las 1 1 CUADRO 3. Concentraciones letales y pendientes de respuesta de horas después de la exposición de las larvas de PDD 1 ocho insecticidas microbia~es a! base de Bt para la población del Valie del\ Zamorano. a las 72 L. (1) Insecticida CL-10 VZ Dipel 0.0004 vz vz vz vz vz vz vz (0.00006-0.00121 B.t. Nica 0.01513 (0.00136-0.053501 MVP 0.00189 (0.00055-0.003921 Bactospeine 0.00045 (0.0000-0.003361 Javelin 0.00084 Bactec Thuricide BST (0.0002-0.001811 0.00009 (0.00001-0.000351 0.00210 (0.0005-0.004591 0.31933 (0.06768-0.753171 CL-50 0.00639 (0.00267-0.012091 0.33492 (0.11788-0.670601 0.01459 (0.0082-0.2311 0.01326 (0.00112-0.047681 0.00523 (0.00267-0.008511 0.00248 (0.00075-0.005251 0.01394 (0.00712-0.022691 7.53627 (4.16573-15.335611 CL-90 0.10006 (0.05076-0.273041 7.41279 (3.54124-24.281211 0.11264 (0.06652-0.249231 0.39285 (0.10986-4.421691 0.0326 (0.01939-0.073021 0.07209 (0.03474-0.225951 0.09229 (0.05467-0.207321 177.86 (62.294-1285.21 ,, Pend. ± ES ( 2 1/¡ 1.073 11 (± 0.1981 .· 0.953 (± 0.1971 l. 444 (± 0.2571 0.871 (± 0.1691 l. 613 (± 6731 0.876 (± 0.1791 l. 561 (± 0.6571 o. 933 (± 0.1051 " ¡: 1 ' 1 li ' 1' 1 1 1' 1 1 H. (3 1 1 o·1. 53 ' o¡. 32 1 Or35 l. 23* 1 0 1.03 ' o'. 62 0 1• DO ' oi. 74 ' g ( 41 0.131** 0.162** 0.122** 0.470* 0.163** 0.161** 0.157** 0.161** (1) L.== Localidad: VZ"" Valle del Zrunornno. (2) Pend.+ ES= Pendiente + en'OI' standard. (3) H.= Factor de Heterogenidad== Chi cuadrad0/3 (grados de libertad). Valores de H. mayores que 1.00 van acompañados de un asterisco que indica un pobre njuste de los dntos al modelo de regresión utilizado (Finney', 1987)., (4) g= Indice de significancia para la estimación de potencia. Valores de g acompañn.dos de 2 asteriscos("'*) indican que los que los límites de Confidencia fueron calculados hasta una Probabilidad de 0.99. Valores de g acompañados de 1 asterisco("') indican que los límites de confidencia sólo pudieron ser calculados hasta' una probabilidad de 0.95. 1 ' r ~ w " " ro , "' o " ro m ~- ~- , O• p. , ~- o " • rt , ~-... ~- " N , • p. • o u. " "' m ~- rt 5 ro ro 'd '< o tJ' f-' " 1 "' ro "' _, "' _, p. 1 ro o ~- rt 1-' • o p. m o 'd p. o • " " o 'U m o ... • o 1 1-' 'U () a o p. f-' ro "' 1-' "' o _, p. ro -, 1: ,, ' CUADRO 4. Concentraciones letales y pendientes de respuesta de ocho insecticidas microbiales a base de Bt a las 72 horas después de la exposición de las larvas de PDD, para la población de San Juan del Rancho. L. (1) Insecticida CL-10 SJR Dipel 0.0134 SJR B.t. Nica. 0.0095 (0.0014-0.030561 SJR MVP 0.00229 (0.00034-0.005031 SJR Bactospeine 0.00053 (0.00002-0.00225) SJR Javelin 0.00051 (0.00007-0.001371 SJR Bactec 0.00018 (0.00002-0.000511 SJR Thuricide 0.00119 SJR Novo Biobit 0.00038 (0.00007-0.000901 CL-50 0.0193 0.35212 (0.15023-0.696791 0.01020 (0.0044-0.016211 0.01551 (0.00447-0.040061 0.00455 (0.00183-0.008281 0.00187 (0.00071-0.00331 0.01155 0.00295 (0.00142-0.00482) CL-90 0.0278 13.03374 (5.73381-44.413751 0.04537 (0.02851-0.104891 0.45399 (0.14717-3.994401 0.04077 (0.02221-0.104581 0.01985 (0.01113-0.053921 0.11227 0.2298 (0.01333-0.057781 1 Pend. ± ES(2) 8.117 0.817 (± 0.135\ l. 976 (± 0.5371 0.873 (± 0.1181 l. 345 (± 0.2931 l. 248 (± 0.2921 l. 297 '! l. 437 (± 0.3151 H. (3 1 0.80 0.84 0.08 l. 64* 0.20 0.10 7.57* 0.06 g ( 4 1 689.484 X 10) 0.181** 0.489** 0.301* 0.315** 0.364** l. 013 0.319** (1) L.= U:Jcalidad: SJR, San Juan del Rancho. (2) Pend.± ES= Pendiente+ error standard, (3) H.= Factor de Heterogenidnd= Chi cuadrado/3 (grados de libertad). Valores de H. mayores que 1.00 van acompañados de un asterisco que indica un pobre ajuste de los datos al modelo de regresión utilizado (Finney, 1987). (4) g= Indice de significancia para la estimación de potencia. Valores de g mayores que 1 indican que los valores calculados podrian estar fuera de lúnite. Valores de g acompañados de 2 asteriscos(*"') indican que los que los límites de confidencia fueron calculados hasta una probabilidad de 0.99. Valores de g acompañados de 1 asterisco(*) indican que los límites de confidencia sólo pudieron ser calculados hasta una probabilidad de 0.95. Valores de g Sin ningún asterisco indican que los límites de confidencia no pudieron ser estimados bajo ningunn probabilidad por un ajuste pobre de los resultados al modelo de regresión utilizado (Finney, 1987). e ' -55- 7 2 hdel de PDD para la población del VZ fueron en orden descendiente: Bactec Bernam, Javelin, Dipel, Thuricide y MVP. Estas cinco formulaciones presentaron una virulencia significativamente mayor (P~ 0.05) que la presentada por las formulaciones Bt Nicaragüense y BST (Cuadro 3}. Las cinco formulaciones más virulentas para la población de PDD del vz se caracterizaron por no presentar diferencias en los valores de CL, los cuales fueron valores bién bajos (Cuadro 3). La similaridad de las CL de estas formulaciones más virulentas, se demuestra en el hecho de que la diferencia nunca sobrepaso las seis veces, entre el valor de la CL-50 de la formulación más potente (Bactec Bernam) sobre el valor de la CL-50 de la menos potente (MVP) (Cuadro 3). Aunque las diferencias en los valores de las CL fueron estrechas, para las cinco formulaciones más virulentas sobre la población de PDD del vz, las diferencias en las pendientes de sus lineas de respuesta fueron significativas (P~ 0.05), lo cual se evidencia gráficamente por el traslape existente entre las lineas (Figura 2). Las formulaciones que presentaron la mayores pendientes de respuesta sobre la población de PDD del VZ fueron: Javelin, Thuricide, MVP y Dipel (Cuadro 3) . El efecto más significativo de una mayor pendiente en la linea de respuesta, fue el del Javelin, cuya CL-90 fue menor que la del Bactec Bernam, a pesar que esta última formulación habia presentado valores más bajos de CL-10 y CL-50 (Figura 2). % M o r t a 100,---------~---------------------------------. " p * 80 60 "' 1 40 i d a d 20 -j! o 1 1 11111111 1 111111!! 1 11111111 1! 1111111 1 1 !111111 1 ¡ !111111 1 1 !111111 1 !IIIIIII tOOOE- OOE- OOE-03 0.01 0.1 1 10 100 1000 Log. de la concentración (mg/ml) Dipel --+-- Bt. Niea. '' MVP ··D·· Bactospeine ----ft-----. Javelin -+- Saetee -b-- Thurieide ....;;¡..... BST FIGURA 2. Concentraciones letales y lineas de respuesta de ocho formulaciones a base de Bl obtenidas sobre la población de PDD del VZ a las 72 hdel. "' "' % M o r t a 1 i d a d iOO 80 60 40 20 ,• /e ,' ,' ~'-;·-~··· ¿_¡._·~ ,• 77 ;( D *ÁEJ' / ~ OL_~~~~~~li_~LU~L_~~ ~~_u~lli__LLU~ tOOOE-04 tOOOE-03 O.Oi O.i Log, de la Concentración 1 (mg/ml) iü Dipel --+- Bt Ni ,, MVP --O·· Bactos ----7f- J ave ~ Bactec -A-- Thuri ----;;-- Biobit FIGURA 3. Concentraciones letales y lineas de respuesta de ocho formulaciones a base de Bt, obtenidas sobre la población de PDD de SJR a las 72 hdel. 100 "' _, -58- Lo anterior nos indica que cualquier incremento en la dosis utilizada de Javelin se traducirá en un mayor incremento en el control de PDD en el VZ, en comparación con el incremento en el control de esta plaga obtenido como respuesta a un incremento en la dosis de cualquiera de las otras formulaciones. Las cinco formulaciones más virulentas sobre la población de PDD del vz (Bactec Bernam, Javelin, Dipel, Thuricide y MVP), y la formulación Novo Biobit fueron las formulaciones de Bt más virulentas sobre la población de PDD de SJR (Cuadro 4) . En las lineas de respuesta para la población de PDD de SJR se presentaron tres grupos bien diferenciados de formulaciones: 1) un primer grupo conformado por las tres formulaciones más virulentas (Bactec Bernam, Novo Biobit y Javelin) , 2) un segundo grupo conformado por cuatro formulaciones de virulencia intermedia (Bactospeine, Thuricide, MVP y Dipel) entre las cuales existió bastante traslape en las lineas de respuesta debido a diferencias en pendiente, y 3) un tercer grupo conformado únicamente por el Bt Nicaragüense que mostró una virulencia menor (Figura 3). Potencia relativa de las formulaciones con respecto a Dipel Los dos gráficos de la Figura 4 (Gráfico a y b) muestran la potencia relativa de siete formulaciones de Bt con respecto a Dipel a las 72 hdel, sobre las poblaciones de PDD del VZ y -59- SJR, respectivamente. valores de potencia relativa mayores que uno indican formulaciones que fueron más potentes que Dipel en esa proporción. solamente las formulaciones Bactec Bernam y Javelin mostraron una mayor potencia relativa con respecto a Dipel sobre la población de PDD del VZ, existiendo, por ende, cinco formulaciones que presentaron una potencia relativa menor que Dipel: Thuricide, MVP, Bactospeine, Bt Nicaragüense y BST (Gráfico a, Figura 4). cinco formulaciones mostraron una mayor potencia relativa con respecto a Dipel sobre la población de PDD de SJR: Bactec Bernam, Novo Biobit, Javelin, MVP y Thuricide (Gráfico b, Figura 4). La potencia relativa de las formulaciones MVP y Thuricide probablemente es igual a la potencia relativa de Dipel, ya que aunque estas dos formulaciones fueron ligeramente mas potentes sobre la población de PDD de SJR, su potencia relativa fue ligeramente menor sobre la población del VZ (Gráfico a y b, Figura 4). Las únicas dos formulaciones que mostraron consistentemente una mayor potencia relativa con respecto a Dipel sobre las dos poblaciones de PDD evaluadas fueron: Bactec Bernam y Javelin. En el otro extremo dos formulaciones presentaron consistentemente una menor potencia relativa que Dipel: Bactospeine y Bt Nicaragüense (Gráficos a y b, Figura 4) • p o t ' n e ¡ a R ' l a t ¡ V a p o t ' n e i a R ' ¡· a t i V a 2.5 2 1.5 1 0.5 o 10 8 6 4 2 o 1.91 BACTEC - 60 - 0.02 0.001 JAVE THURI M\'P BACTOS Bt NI BST TRATAMIENTOS Grll.llco a, Potencie. relativa de alele Jormulaclones de Bt con respecto a Dlpel, sobre la población de POD del VZ., 0,029 BACTEC BIOBIT lAVE MVP THURI BACTOS Bt NI TRATAMIENTOS Grii.Jlco b. Potencia relativa de alele formulaciones de Bt con respecto a Dipel, sobre la población de PDD de SJR, FIGURA 4. Potencia relativa, con respecto a Oipel, de siete formulaciones a base de Bt, sobre dos poblaciones de PDD: VZ Y SJR. (72 hdel). ------- •· --- -- -- Comparaciones entre las concentraciones recomendadas por los fabricantes {C.F) y las CL-90 obtenidas para cada formulación a las 72 hdel de PDD Los cuadros 5 y 6 muestran los resultados de las comparaciones entre las concentraciones recomendadas por los fabricantes para cada formulación (C.F) y las CL-90 obtenidas a las 72 hdel de PDD sobre las poblaciones del VZ y SJR, respectivamente. Para objetivizar las comparaciones se determinó la tasa tasa de la relación entre la C.F y la CL-90 (Tasa ~ C.FfCL- 90), en donde tasas mayores que uno indican formulaciones cuyas C.F fueron más altas que la CL-90 (Cuadros 5 y 6). Cinco formulaciones de Bt (Bactec Bernam, Javelin, Dipel, Thuricide, MVP y Batospeine) presentaron tasas mayores que uno sobre la población de PDD del VZ, encontrándose solamente dos formulaciones (Bt Nicaragüense y BST) que presentaron tasas menores que uno sobre esta población (Cuadro 5) . Dentro de las cinco formulaciones que presentaron tasas mayores que uno sobre la población de PDD del vz se distinguen tres grupos de formulaciones: a) tres formulaciones con tasas mayores que 20: Bactec Bernam, Javelin y Thuricide, b) dos formulaciones con tasas entre 10 y 20: Dipel y MVP, y e) una formulación con una tasa entre 1 y 10: Bactospeine (Cuadro 5). Siete formulaciones de Bt presentaron tasas mayores que uno sobre la población de PDD de SJR: Bactec Bernam, Novo CUADRO 5. Corrparadón entre la concentrac¡on recomendada por el fabricante y la CL·90 requerida a las 72 horas después de la e~posición de las larvas de POO, para ocho formulaciones de Bt evaluadas sobre la población de POO del Valle del Zamorano. fORMULACJO!< OOSJS{ha (1) c. F (mg/ml) {2) CL·90 (mg/ml J TASA (3) COOIGO (4) l. Saetee Bernam 750 g 2. 1~5 0.072 29.75 ' ... 2. Javel in 300 g 0.860 0.033 26.38 ... 3. Dipel 800 ml 1.887 0.100 18.83 .. ~. Thuricide 800 g 2.286 0.092 2~ .85 ... S. MVP 800 ml 2.223 o. 113 19.67 .. 6. s~ctospdne 800 g 2.286 0.393 S .82 • 7. Bt. ! o • • ·- ~ - ~ o -- N ~ - • • • • • • ' o ~ o ~ o - ~ ~ o ~ ~ o ~ o ~ n o " o o o ~ - ~ ~ ~ N • ~ N N ~ N N N ~ E E • o o o o o o • • • • " e • " •o e m ·~ " • o o ·-• z " o > • . • • • "' ~ " • o - ~ n ~ ~ ~ N o o ~ • N N E o o o • :¡; o ·-• o > o z • " • • • ¡ " ¡ ¡ •• e: "' " ~::;:::~ ·-~ Ji N ·~ • -64- Biobit, Dipel, MVP, Javelin, Thuricide y Bactospeine. La única formulación que presentó una tasa menor que uno sobre la población de PDD de SJR fue Bt Nicaragüense (Cuadro 6), siendo, además, la única formulación que presentó tasas menores que uno sobre ambas poblaciones de PDD, lo que evidencia la necesidad de incrementar significativamente la dosis de esta formulación en el campo. Tres formulaciones de Bt (Bactec Bernam, Dipel y Javelin) presentaron tasas mayores sobre la población de PDD de SJR con respecto a la población del VZ (Cuadros 5 y 6) , lo que podria indicar una mayor susceptibilidad a concentraciones altas de Bt (CL-90) por parte de la población de PDD de SJR. Lo anterior no es del todo seguro, debido a la alta variabilidad de los valores de las CL-90, por el tipo de análisis utilizado (Portillo, comunicación personal). En general, seis formulaciones presentaron tasas mayores que uno sobre las dos poblaciones de PDD (VZ y SJR) : Bacte·c Bernam, Dipel, Javelin, MVP, Thuricide y Bactospeine, en orden descendiente, respectivamente¡ existiendo una formulación que presentó tasas menores que uno sobre ambas poblaciones de PDD: Bt Nicaragüense. La formulación Novo Biobit mostró una tasa considerablemente mayor que uno (99) sobre la única población de PDD en que fue evaluado (SJR), existiendo en el otro extremo el BST, que presentó una tasa menor que uno sobre la población del VZ. comparación (resistencia) de la susceptibilidad entre poblaciones El cuadro 7 resume los resultados de las comparaciones estadisticas realizadas para determinar diferencias en la susceptibilidad de las dos poblaciones de PDD evaluadas {VZ y SJR) hacia cada una de las siete formulaciones de Bt comunes a ambas poblaciones (Dipel, Bt Nicaragüense, Bactec Bernam, MVP, Thuricide, Javelin y Bactospeine). Solamente se encontraron diferencias estadisticas (P.:; 0.05) en las pendientes de las lineas de respuesta y en los valores de las CL para la formulación Dipel, entre las dos poblaciones de PDD evaluadas (VZ y SJR) (Cuadro 7). La diferencia en la s