Escuela Agrícola Panamericana, Zamorano Maestría en Ciencias en Agricultura Tropical Sostenible Tesis de Grado de Maestría Caracterización in vitro y evaluación in vivo de una cepa nativa de Lactobacillus reuteri con efecto probiótico en pollos de engorde Estudiante Elvia Guadalupe Melara Valladares Asesores Yordan Martínez Aguilar, Dr.Sc Asesor Carolina Avellaneda, Ph.D. Honduras, junio 2021 Autoridades TANYA MÜLLER GARCÍA Rectora ANA M. MAIER ACOSTA Vicepresidenta y Decana Académica ARIE SANDERS Decano Asociado de Posgrado HUGO ZAVALA MEMBREÑO Secretario General i ZAMORANO MAESTRÍA EN CIENCIAS EN AGRICULTURA TROPICAL SOSTENIBLE Caracterización in vitro y evaluación in vivo de una cepa nativa de Lactobacillus reuteri con efecto probiótico en pollos de engorde Tesis de graduación presentada como requisito parcial para optar al título de Maestría en Ciencias en Agricultura Tropical Sostenible Presentado por: Elvia Guadalupe Melara Valladares Zamorano, Honduras Julio, 2021 ii La defensa oral y el documento de tesis de Elvia Guadalupe Melara Valladares fue revisada y aprobada por el siguiente personal docente y autoridades de la Universidad Zamorano1 Yordan Martínez Aguilar, Dr.Sc. Asesor principal Carolina Avellaneda, Ph.D. Asesor Arie Sanders, Ph.D. Decano Asociado de Posgrado Juan Carlos Rosas, Ph.D. Director de Investigación- MATS Ana Margarita Maier, Ph.D. Vicepresidenta y Decana Académica 1La hoja de remisión de Visto Bueno contiene las firmas y este documento se encuentra en custodia de la Oficina de Registro. iii Las actividades de investigación y desarrollo en las que se basa gran parte de este trabajo de tesis fueron posibles en parte gracias al apoyo de la Fundación Nippon. El contenido es responsabilidad del autor y no refleja necesariamente los puntos de vista de Fundación Nippon iv Caracterización in vitro y evaluación in vivo de una cepa nativa de Lactobacillus reuteri con efecto probiótico en pollos de engorde Elvia Guadalupe Melara Valladares Resumen. El uso de los antibióticos promotores de crecimiento (APC) en el área avícola, ha promovido la productividad y la reducción de las enfermedades asociadas con enterobacterias en esta especie animal. Sin embargo, el uso indiscriminado de los APC en las dietas ha provocado resistencia microbiana, resistencia cruzada a otros microorganismos y bioacumulación en los músculos. A pesar de las restricciones del uso de los APC, todavía en Latinoamérica se usan regularmente en las dietas de los pollos de engorde, sobre todo para disminuir el crecimiento de bacterias patógenas y las enfermedades asociadas. El objetivo de este estudio fue obtener cepas bacterianas con potencial probiótico para ser utilizadas como alternativa a los APC en la producción de pollos de engorde. Se obtuvo bacterias ácido-lácticas cecales de gallos que no han sido tratados con antibióticos. Se evaluó la tolerancia a pH, sales biliares y temperatura, simulando el tracto gastrointestinal de las aves, siendo seleccionada las cepas de Lactobacillus reuteri al mostrar significancia (p<0.05) en las pruebas de tolerancia. Posteriormente, en las cepas seleccionadas se evaluaron el antagonismo con enteropatógenos y el crecimiento en diferentes antibióticos. Seguidamente, se evaluó el efecto probiótico in vivo de la cepa CLP4 aislada y caracterizada en el agua de bebida y en la dieta de pollos de engorde (0-32 días) comparado con los APC. El uso del probiótico natural incrementó la conversión alimenticia y mejoró el rendimiento cárnico y la calidad nutricional de la canal de los pollos de engorde. Palabras clave: Probióticos; bacterias acido lácticas; pollos de engorde; parámetros productivos; resistencia Antibióticos Abstract. The use of growth promoting antibiotics (APC) in the poultry area has promoted productivity and the reduction of diseases associated with enterobacteria in this animal species. However, the indiscriminate use of APC in diets has led to microbial resistance, cross-resistance to other microorganisms, and bioaccumulation in muscles. Despite the restrictions on the use of APCs, they are still used in the diets of broilers in Latin America, especially to reduce the growth of pathogenic bacteria and associated diseases. The objective of this study was to obtain bacterial strains with probiotic potential to be used as an alternative to APC in the production of broilers. Cecal lactic acid bacteria were obtained from roosters that have not been treated with antibiotics. Tolerance to pH, bile salts and temperature was evaluated, simulating the gastrointestinal tract of the birds, the Lactobacillus reuteri strains being selected by showing significance (p <0.05) in the tolerance tests. Subsequently, antagonism with entero-pathogens and growth in different antibiotics were evaluated in the selected strains. Next, the in vivo probiotic effect of the isolated and characterized CLP4 strain was evaluated in drinking water and in the diet of broilers (0-32 days) compared with APC. The use of the natural probiotic increased the feed conversion and improved the meat yield and the nutritional quality of the broiler carcass. Keywords: Probiotics; lactic acid bacteria; Broiler chicken; productive parameters; Antibiotics resistance v CONTENIDO Portadilla …………………………………………………………………………………………………………………………………… i Página de firmas ………………………………………………………………………………………………………………………… ii Resumen ……………………………………………………………………………………………………………………………………. iii Contenido …………………………………………………………………………………………………………………………………… v Índice de Cuadros, Figuras y Anexos ……………………………………………………………………………………………vi 1. INTRODUCCIÓN........................................................................................................ 1 2. MARCO TEÓRICO...................................................................................................... 3 3. MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................................................... 8 4. RESULTADOS.......................................................................................................... 12 5. DISCUSIÓN ............................................................................................................ 20 6. CONCLUSIONES...................................................................................................... 24 7. LITERATURA CITADA ............................................................................................... 25 vi ÍNDICE DE CUADROS, FIGURAS Y ANEXOS Cuadros……………………………………………………………………………………………………………. Página 1. Evaluación probiótica in vitro de la tolerancia a pH, temperatura, cloruro de sodio (NaCl) y sales biliares de cepas aisladas de gallos criollos mediante el crecimiento por conteo en placa (Log UFC/g). ......................................................................................................................... 13 2. Prueba de resistencia in vitro de la cepa CLP4 de Lactobacillus reuteri y cepas entero-patógenas en presencia de diversos antibióticos. ............................................................................... 14 3. Antagonismo entre Lactobacillus reuteri y cepas enteropatógenas de acuerdo con el diámetro del halo de inhibición de crecimiento in vitro. .................................................................... 14 4. Efecto de los tratamientos con dieta base sin (control negativo) y con antibióticos promotores de crecimiento (APC) (control negativo), e inclusión de probiótico en el agua ad libitum en el desempeño productivo de pollos de engorde (0-32 días). .................................................... 15 5. Efecto de los tratamientos con dieta base sin (control negativo) y con antibióticos promotores de crecimiento (APC) (control negativo), e inclusión de probiótico en el agua ad libitum en el rendimiento de partes comestibles en pollos engorde. ........................................................ 15 6 Resultados del análisis sensorial de pechuga de pollo de los tratamientos con dieta base sin (control negativo) y con antibióticos promotores de crecimiento (APC) (control negativo), e inclusión de probiótico en el agua ad libitum...................................................................... 16 7. Efecto de los tratamientos con dieta base sin (control negativo) y con antibióticos promotores de crecimiento (APC) (control negativo), e inclusión de probiótico en el agua ad libitum en el peso relativo de órganos productivos y vísceras de pollos de engorde. .......................................... 17 8. Recuento de bacterias acido lácticas y enterobacterias aisladas de contenido cecal de pollos de engorde y pH a los 32 días en los tratamientos con dieta base sin (control negativo) y con antibióticos promotores de crecimiento (APC) (control negativo), e inclusión de probiótico en el agua ad libitum. ............................................................................................................. 17 9. Análisis de parámetros hematológicos, bioquímicos y perfil lipídico en muestras de sangre de pollos de engorde de 32 días de los tratamientos con dieta base sin (control negativo) y con antibióticos promotores de crecimiento (APC) (control negativo), e inclusión de probiótico en el agua ad libitum. ............................................................................................................. 18 10. Análisis de ceniza, calcio y fósforo en tibias de pollos de engorde de 32 días de los tratamientos con dieta base sin (control negativo) y con antibióticos promotores de crecimiento (APC) (control negativo), e inclusión de probiótico en el agua ad libitum. ................................................... 19 11. Contenidos de humedad, nitrógeno, fósforo y amoníaco (NH3) en camas de pollos de engorde en los tratamientos con dieta base sin (control negativo) y con antibióticos promotores de crecimiento (APC) (control negativo), e inclusión de probiótico en el agua ad libitum............... 19 Figuras……………………………………………….………………………………………………………….…. Página 1. Diversificación de microorganismos en el TGI ................................................................... 4 2. Funciones de la microbiota intestinal............................................................................... 4 3. Microorganismos más utilizados como cepas con potencial probiótico Fuente: ..................... 7 1 1. INTRODUCCIÓN Durante el International Poultry Summit (IPS 2019), se revisaron los desafíos del sector avícola y el futuro de la industria con el fin de aumentar la producción de carne y huevos sin el uso de antibióticos promotores de crecimiento, debido a la alta demanda de proteína de alto valor para la seguridad alimentaria. El aumento en el consumo de carne de pollo se relaciona al ingreso económico y preferencias del consumidor, además de los beneficios en la salud y el ambiente al usar menos cantidad de agua para la producción, emitir menos gases de efecto invernadero y obtener productos enriquecidos a un menor precio que la carne de res y cerdo (Charles et al.). Se estima que en el año 2050 la población humana a nivel mundial habrá aumentado a nueve mil billones, lo que hace necesario alimentar a la población con proteína animal de alto valor biológico, se espera aumentar la producción de carne en 455 millones de toneladas anuales, en su mayoría aportadas por la industria avícola, dada la demanda de carne de pollo a nivel mundial en mercados emergentes de países en vías de desarrollo (Delgado et al., 2001). Este incremento y la crianza intensiva ha promovido el uso de antibióticos desde inicios de la década de 1940, suministrándolos en las granjas avícolas con doble propósito, buscando reducir la mortalidad causada por enfermedades entéricas y como promotores de crecimiento (Blajman et al., 2015; Castanon, 2007). Posteriormente, la adición de estos antibióticos en la dieta alimenticia en las aves de corral se convirtió en una práctica común sin pruebas rigurosas y de manera desmesurada (Dibner y Richards, 2005). El uso de antibióticos en forma indiscriminada indujo a la aparición de cepas bacterianas resistentes, proceso que se potenció por la capacidad de las bacterias de transferir resistencia, incluso entre diferentes géneros y especies (Thibodeau et al., 2008). Las terapias con antibióticos, si bien controlan los microorganismos patógenos, también afectan a muchos microorganismos benéficos, lo que origina trastornos en el equilibrio del microbiota gastrointestinal. Muchos de estos antibióticos, o sus residuos, pueden quedar en los tejidos animales destinados al consumo humano (Blajman et al., 2015). Lutful (2009) indica que estudios posteriores sobre el uso de antibióticos como promotores de crecimiento, generaron protestas públicas y gubernamentales. Por lo que, desde hace algunos años, su uso se ha restringido en ciertos países. La Unión Europea desde 2006 instauró la total prohibición del uso de antibióticos promotores de crecimiento en la alimentación animal. Esta supresión de antibióticos en la producción avícola ha alentado la búsqueda intensiva de otras alternativas (Park et al., 2016). Teniendo en cuenta las restricciones al uso indiscriminado de APC, una alternativa viable es utilizar probióticos siendo necesario realizar varios ajustes al requerimiento de probióticos funcionales para la producción avícola. Las bacterias probióticas deben poseer los siguientes rasgos deseables, 2 ser un habitante intestinal capaz de adherirse al epitelio intestinal, resistir las condiciones de alta acidez en el estómago (proventrículo y molleja) y tolerar las sales biliares en los intestinos, y competir contra otros microorganismos intestinales para la colonización en el tracto gastrointestinal (Lutful, 2009). Asimismo, (Vuong et al., 2016) mencionan que las características deseadas para la suplementación con probióticos son la alteración del ambiente intestinal para facilitar y mantener un ambiente antiinflamatorio, ayudar a los nutrientes a una mejor absorción para mejorar el rendimiento del crecimiento y establecer una respuesta inmune más fuerte y robusta contra patógenos protegiendo al animal contra la enfermedad. Existen muchos procedimientos para la obtención y posterior producción de probióticos para uso industrial en aves en los cuales se busca mejorar sobre todo el proceso de la ingesta, en la que no se pierda gran parte del contenido y las bacterias colonicen de manera eficaz que soporte los cambios internos en el tracto intestinal animal. Por este motivo, bacterias como Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. helveticus, L. lactis, L. salivarius, L. plantarum, Enterococcus faecium, E. faecalis y Bifidobacterium spp., son comúnmente utilizadas en los suplementos probióticos (Díaz- López et al., 2017). Rodríguez R. et al. (2016) mencionan que las bacterias probióticas, suelen ser aisladas del tracto gastrointestinal (contenido intestinal, siendo mejor opción los ciegos), saliva, vagina y heces fecales. Su aislamiento requiere de una adecuada selección de las cepas, identificación mediante técnicas bioquímicas y moleculares y la evaluación de su inocuidad y beneficios para la salud. La forma tentativa para la selección de probióticos como agentes de biocontrol en la industria avícola, es por medio de la conducción de muchos ensayos in vitro para la preselección de cepas probióticas (Tuomola et al., 2001). Así mismo, Dowarah et al. (2017) mencionan que no todas las cepas de diferentes especies bacterianas son efectivas para utilizarlas como probióticos, por lo que el éxito dependerá de un buen ensayo in vitro que permita predecir su comportamiento en diversos entornos. Estos entornos incluyen los cambios en pH, salinidad, temperatura, sales biliares, sensibilidad a antibióticos y antagonismo, que permiten predecir su comportamiento frente a agentes enteropatógenos en el tracto gastrointestinal (TGI) en ensayos in vivo (Sousa e Silva y Freitas, 2014). Existen resultados diversos sobre la eficacia de los probióticos al reemplazar bacterias entero- patógenas colonizadas en el TGI con bacterias benéficas, lo cual genera ciertas dudas debido a resultados inconsistentes cuando se emplea este tipo de productos (Willis y Reid, 2008). Esta variabilidad puede ser debida al lugar de donde se obtiene el probiótico como producto para consumo en la dieta, incluso de origen animal diferente al que se pretende suplementar (Kazue et al., 2012). Para mejorar los beneficios de los productos probióticos suministrados, es importante aislar cepas nativas por región e incluso especie animal a la que se desea implementar el producto, lo que mejora el equilibrio gastrointestinal y la interacción entre microorganismos residentes (Klose et al., 2010). La competitividad de las cepas seleccionadas más prometedoras se evalúa in vivo para controlar su persistencia en pollos (Tuomola et al., 2001) .Además, los probióticos deben ejercer sus efectos benéficos (p.ej. mejor nutrición y aumento de respuesta inmune) en el huésped. Finalmente, el probiótico debe ser viable en condiciones normales de almacenamiento y adecuado para procesos industriales. 3 2. MARCO TEÓRICO La domesticación de las aves de corral permitió el asentamiento y crianza selectiva según la demanda, creciendo rápidamente a partir del surgimiento de la economía a escala a través de la primera producción intensiva en 1930) aunado a los cambios de manejo y crianza después de la segunda Guerra Mundial, las aves de corral se convirtieron en la fuente más accesible de proteína animal, esto permitió que las regiones agrícolas menos prosperas aumentaran la tasa de empleos en el campo y se consolidar la cadena de producción avícola industrial que hoy conocemos (Burton, 2016). La Organización de las Naciones Unidas informó que para el año 2016 se produjeron alrededor de 23 mil millones de pollos de engorde en todo el mundo con una proyección estimada para el 2020 de 130 millones de toneladas de pollo (Blajman et al., 2015). El crecimiento exponencial en los últimos 50 años ha desarrollado genéticamente nuevas razas de aves con una tasa de crecimiento rápido (Knowles et al., 2008), y con una conversión alimenticia más eficiente entre las especies de ganado tradicional con un rango de conversión entre 1.6 y 2.0, jugando un papel fundamental en el sector avícola para satisfacer la demanda de proteína de alto valor (Diaz Carrasco et al., 2019) . Sin embargo, la selección genética junto a la cría intensiva ha sido motivo para el desarrollo de enfermedades considerándose un obstáculo para el sector avícola y la salud pública (van Asselt et al., 2018), por lo que mantener la salud intestinal de las aves es importante ya que están constantemente sujetas a diversas tensiones ambientales, como el estrés en pollos de engorde durante su adaptación al período posterior a la eclosión, el transporte, el procesamiento en la planta de incubación y las altas densidades de población. Además, antes de la matanza, se implementa la retirada de alimento en las aves para reducir el volumen intestinal, con el fin de minimizar el riesgo de contaminación del canal después de la ruptura del tracto intestinal durante el procesamiento (Park et al., 2016) Salud intestinal en aves de engorde El alimento ingerido por las aves de corral viaja más rápido por el TGI que en los mamíferos al tener una longitud menor, por lo que la interacción entre el microbiota intestinal y el huésped es estrecha, además de una alta población de microorganismos (Pan y Yu, 2014). La microbiota se puede desarrollar en los pollos recién nacidos por transmisión en el oviducto o a través de los poros en las cáscaras del huevo, al inoculándose bacterias como ser Lactobacillus, Clostridium y Propionibacterium antes de la formación de la cáscara, incluso en el sector de producción avícola, 4 pero en este caso no es siempre seguro (Olvera-García et al., 2017; Roto et al., 2016). Para la segunda semana de vida, se puede observar la presencia de grupos bacterianos diferentes a Lactobacillus en ciegos e intestino, indicando maduración del TGI debido al establecimiento de diferentes condiciones como en el pH (figura 1), anaerobiosis y presencia de metabolitos y surfactantes (Olvera-García et al., 2017). Figura 1. Diversificación de microorganismos en relación con el pH en el tracto gastrointestinal de aves de corral. El microbiota cumple diversas funciones en el mantenimiento de la salud intestinal y evitar la colonización de microorganismos patógenos al competir por nutrientes (figura 2). Estas bacterias se defienden del ataque de otros microorganismos al producir metabolitos y generar una capa de mucosa para la defensa contra infecciones en las aves (Mahmood y Guo, 2020). Adicionalmente esta capa de células que recubre el intestino conforma la mayor conexión entre el interior del huésped y el exterior contribuyendo a una relación simbiótica a través de procesos físicos y químicos (Moeser et al., 2017; Okumura, 2017). Figura 2. Funciones del microbiota en el tracto intestinal de aves (Biocodex-Microbiota Institute) 5 Por la importancia de mantener la salud intestinal, el sector avícola se enfoca en gestionar estrategias para mejorarla e incrementar el rendimiento sobre todo en los modelos de producción intensiva (Zimmermann et al., 2016), en la que se necesita una alta digestibilidad de alimento, absorción adecuada de nutrientes, recolección de energía, eficiente metabolismo e inmunidad (Mancabelli et al., 2016). La exposición a factores estresantes podría amenazar la salud de los animales al debilitar las funciones inmunes y predisponerlos a enfermedades entéricas inducidas por microorganismos patógenos, lo que representa una amenaza para la seguridad alimentaria y perjudicial para la salud humana (Freitas et al., 2003). Uso de antibióticos como promotores de crecimiento El desarrollo de antibióticos para uso avícola significó un éxito para el control de enfermedades infecciosas, así como la eficiencia alimentaria (Engberg et al., 2000). Sin embargo, investigaciones posteriores sugieren que el uso masivo de estos antibióticos promotores de crecimiento (APC) han llevado a un mayor problema de resistencia (Forgetta et al., 2012). Adicionalmente, en la presencia de residuos tanto en piensos como en el medio circundante, comprometiendo tanto la salud animal como la humana (Diarra et al., 2010; Gonzalez y Angeles, 2017) Una de la forma de suministro de los APC es en dosis sub-terapéuticas en la industria avícola para promover crecimiento y modificar el estado inmunológico de los pollos de engorde (Lee et al., 2012), al modificar el microbiota intestinal, reestructurando la diversidad de microorganismos, así como su densidad poblacional (Dibner y Richards, 2005). Ensayos realizados con antibióticos adicionados en piensos han indicado una disminución en la población de Lactobacillus, contrario a piensos sin adición de antibióticos (Danzeisen et al., 2011; Lin et al., 2013) A pesar de los beneficios en cuanto al control de enfermedades infecciosas y la mejora en el rendimiento productivo, el abuso de los APC ha provocado acumulación en la carne; antibióticos como penicilina, tetraciclina y anfenicol se han detectado en productos lo que podría repercutir en la salud humana (Kümmerer, 2009). Algunas patologías documentadas por APC en la salud humana son temblores musculares, envenenamiento, taquicardia y la posibilidad de anemia en humanos (Gassner y Wuethrich, 1994). El consumo global de APC aproximado es de 1105 a 2105 ton, liberándose también grandes cantidades en el medio ambiente, siendo los ecosistemas acuáticos los más vulnerables (Manzetti y Ghisi, 2014; Marti et al., 2014). Estudios realizados por Carvalho y Santos (2016), indican que los efectos tóxicos de antibióticos en el agua aumentan al combinarse con otros, propagando genes de resistencia, así como modificación de la microbiota del suelo (Kümmerer, 2009). Estudios sobre aislamientos de Salmonella enterica en aves de corral, indicaron que un 43% de los aislados fueron resistentes a diversos antibióticos. Por otro lado, en Italia se informó que el 86% de los aislados en la canal de pollo fueron resistentes a la tetraciclina y 30% a sulfametoxazol (Bacci et al., 2012). Se ha demostrado que la resistencia a antibióticos en granjas orgánicas es menor, por lo tanto, es indispensable buscar alternativas que disminuyan o sustituyan el uso excesivo de antibióticos, aunado a la presión de los consumidores por alimentos libres de antibióticos (Diarra y Malouin, 2014; Hegde et al., 2016). Las alternativas no terapéuticas para reducir uso de antibióticos son los probióticos, prebióticos, enzimas, ácidos orgánicos, inmunoestimulantes, bacteriocinas, bacteriófagos, nanopartículas y aceites esenciales. 6 Probióticos como alternativa a los antibióticos promotores de crecimiento (APC) Durante varias décadas se recurrió a la suplementación de APC para disminuir la mortalidad y ayudar a una adecuada salud intestinal en aves de corral, y para aumentar la producción y mejorar la eficiencia alimentaria (Gaggìa et al., 2010). Sin embargo, ha crecido la preocupación por las altas concentraciones de antibióticos administradas en las aves y sus efectos adversos a la salud humana (Díaz-López et al., 2017). Los probióticos son una estrategia confiable para controlar la colonización de bacterias entero- patógenas y mejorar el bienestar de los animales de corral (Park et al., 2016). De acuerdo con FAO/WHO, los probióticos se definen como microorganismos vivos que, administrados en dosis adecuadas, confieren beneficios a la salud del huésped (Fijan, 2014). Por lo que se buscan mediante pruebas in vitro las cepas que tengan las mejores características probióticas para poder generar productos eficientes para la industria avícola al probarlas en ensayos in vivo. Así, los probióticos han surgido como una alternativa factible para disminuir el uso de APC en la industria avícola, dado la alta incidencia de enteropatógenos resistentes, por el uso indiscriminado de estos antibióticos (Huyghebaert et al., 2011). La industria avícola ha evaluado diversos productos probióticos para mejorar el rendimiento productivo y otros parámetros de interés (Agostini et al., 2012). Estos probióticos han mostrado resultados similares a los generados por los antibióticos promotores de crecimiento en pollos de engorde, pero mejorando la salud del pollo (Franz et al., 2011). Wolfenden et al. (2007) indicaron que al administrar Lactobacillus spp. por medio de un cultivo, redujo significativamente la concentración de Salmonella enteriditis, probablemente por la estimulación del sistema inmune por la cepa administrada. A su vez se ha demostrado que los pollos de engorde tratados con productos probióticos han mostrado un aumento en la cantidad de anticuerpos (Khan et al., 2011). A su vez, (Dibner y Richards, 2005) mencionan que uno de los grandes grupos de bacterias utilizadas como probióticos es el género Lactobacillus por su capacidad de colonización y densidad poblacional en el TGI (Figura 3). También en ensayos in vitro Stern et al. (2008) utilizaron la cepa de Lactobacillus salivarius NRRL B-30514, siendo aislada del contenido en los ciegos de pollos de engorde con el fin de producir bacteriocinas. Los autores mostraron una reducción significativa de Campylobacter jejuni en el intestino. En ensayos in vitro similares se encontraron que los probióticos pueden producir sustancias como ácido láctico, acético y propiónico, los que inducen a la acidificación en todo el medio intestinal. Esto crea un entorno desfavorable para el crecimiento de enteropatógenos, debido a que estas cepas no sobreviven a pH inferior a 5.5, con una disminución de la proliferación debido a la acción probiótica (Yu et al., 2007). 7 Figura 3. Microorganismos más utilizados como cepas con potencial probiótico (Engormix, 2014). Otros estudios realizados por Jin et al. (2000), utilizando Lactobacillus acidophilus, comprobaron que la ganancia de peso y eficiencia alimenticia en pollos alimentados con probióticos respecto al tratamiento testigo fue superior. A su vez, Blajman et al. (2015) concluyeron que los pollos suplementados con probióticos aumentaron su peso y utilizaron más eficientemente el alimento, esta asociación de mayor productividad al utilizar probióticos se da por un aumento en la longitud de las vellosidades en el intestino que aumenta la capacidad de absorción y la actividad enzimática. Al momento de administrar los probióticos a las aves de corral, es importante hacerlo adecuadamente ya que determina la capacidad de colonización en el intestino por las cepas bacterianas empleadas. Unas de las vías más utilizadas según los resultados favorables, es en el agua de bebida y la incorporación en la dieta (Eckert et al., 2010). 8 3. MATERIALES Y MÉTODOS FASE I. Caracterización molecular y evaluación in vitro de cepas bacterianas nativas con potencial de efecto probiótico aisladas de los ciegos en pollos de engorde 3.1 Ubicación. La evaluación in vitro de cepas bacterianas nativas con potencial probiótico, se realizó en el Laboratorio de Fitopatología, Diagnóstico e Investigación Molecular de la Carrera de Ciencia y Producción Agropecuaria (CPA), de la Universidad Zamorano. La caracterización molecular de las muestras aisladas fue por duplicado al Centro de Biología Molecular (CBM) de la Universidad Centroamericana (UCA), Nicaragua. 3.2 Recolección y preparación de las muestras. Para este estudio se seleccionaron gallos de engorde con una edad promedio entre uno y dos años, del sector de Zamorano, Francisco Morazán, Honduras. Los gallos se encontraron en óptimas condiciones de salud, de tamaño mediano a grande, de edad intermedia y criados en un ambiente natural con alimento libre de antibióticos promotores de crecimiento. Doce horas antes del sacrificio, se les privó de alimento para realizar la necropsia; inmediatamente después de extraer los ciegos del intestino, se introdujeron en bolsas estériles y se almacenaron en un compartimiento frío, y posteriormente se trasladaron al Laboratorio. En el laboratorio, bajo un ambiente estéril en la cámara de flujo laminar, se extrajo el contenido cecal de los ciegos, raspando cuidadosamente el tejido con palillos estériles, se midió el pH y se depositó el contenido completo en un matraz con 30 mL de agua peptonada (solución madre) al 1% (p/v) y se agitó en la mesa orbital por 20 min a 150 rpm. 3.3 Aislamiento y morfología. De las muestras anteriores se realizaron diluciones seriadas en agua peptonada hasta una concentración de 107 a partir de la solución madre. De cada dilución se sembró por extensión 100 µL de solución en placas Petri en un medio de cultivo Man, Rogosa y Sharpe (MRS Liufilchem) por duplicado, y se incubaron a 37 °C por 48 h en una cámara anaeróbica BD GasPakTM EZ. De las placas que mostraron crecimiento bacteriano, se contaron las unidades formadoras de colonias (UFC) utilizando un intervalo entre 30 a 300 colonias por placa Petri. Para el aislamiento se eligieron al azar diferentes morfologías de colonias bacterianas por placa, Se sembraron por duplicado por la técnica de estriado y se incubaron a 37 °C por 48 h en cámara de anaerobiosis BD GasPakTM EZ. 3.4 Pruebas bioquímicas. Se realizaron las pruebas preliminares de oxidasa, catalasa y tinción de Gram. A las colonias que mostraron reacción negativa a las pruebas de catalasa y oxidasa, se les realizó un frotis mediante la técnica de Gram, luego se observó en un microscopio con objetivo de inmersión de 100x, verificando la característica de Lactobacillus observando tinción morada y forma característica de bastón en las células presentes en la muestra. 3.5 Identificación genómica bacteriana. A partir de placas Petri sembradas, se tomaron muestras de diferentes colonias y se sembraron por estriado en placas con agar MRS (Liufilchem). Las placas que mostraron crecimiento se enviaron por duplicado al Centro de Biología Molecular (CBM) de la Universidad Centroamericana (UCA), Nicaragua. Con las secuencias obtenidas, se realizó una comparación en la base de datos GenBank mediante el programa BLAST (del inglés “Basic Local 9 Alignment Search Tool”) disponible en el sitio web del Centro Nacional para Información Biotecnológica (NCBI, siglas en inglés) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 3.6 Tratamientos y diseño experimental. Para la evaluación de siete cepas aisladas con 14 tratamientos por triplicado y finalmente la cepa final aislada con dos tratamientos por triplicado, se utilizó un diseño completamente al azar. 3.7 Variables a evaluar in vitro. Para determinar la capacidad probiótica se realizaron diferentes pruebas a las cepas en estudio sembradas por triplicado. Tolerancia a cambio de pH. Para evaluar la resistencia y crecimiento de las cepas seleccionadas a diferentes niveles de pH, el medio MRS caldo (Acumedia) se ajustó a pH de 2, 3, 4, 5, 6 y 7, empleando ácido clorhídrico (HCI) 0.1 N e hidróxido de sodio (NaOH) 0.1 N, seguido de esterilización en autoclave por 40 min a 121° C. Las muestras en los tubos de ensayo de incubaron a 37 °C durante 24 h en condiciones anaeróbicas. Posteriormente, se realizaron diluciones seriadas de 104 a 107 de cada muestra y se sembraron en placas Petri con MRS agar (Acumedia). La sobrevivencia se determinó mediante el crecimiento en las placas y la diferencia del número de microorganismos viables del inóculo después del periodo de incubación (Gómez Zavaglia et al., 1998) expresado en Log UFC/g. Tolerancia a sales biliares. Se evaluó la tolerancia de las cepas bacterianas a diferentes concentraciones de sales biliares (0.050%, 1%, 0.15% y 0.30% p/v), ajustado a un pH de 5.6 con HCl al 5%, se inoculó en caldo MRS y se incubó a 37 °C durante 24 h en condiciones anaeróbicas. Las cepas que sobrevivieron a las diferentes concentraciones de sales biliares se cuantificaron mediante conteo en placa Petri (Monteagudo et al., 2012) Tolerancia a diferentes concentraciones de Cloruro de Sodio (NaCl). Se utilizó un medio MRS caldo a concentraciones de 2%, 4%, 7% y 10 % p/v de NaCl, después se llevó a 24 h de incubación a 37 °C en condiciones anaeróbicas (Rondón et al., 2008), posteriormente se sembraron en placas Petri con MRS agar y se cuantificaron las colonias formadas (UFC/g). Tolerancia a cambios de temperatura. Las cepas cultivadas en caldo MRS se incubaron a 37 °C en condiciones anaeróbicas, posteriormente se sembraron en placas Petri y se incubaron a 30 y 42 °C durante 24 h en condiciones anaeróbicas. La sobrevivencia y resistencia a estas temperaturas se comprobó mediante la medición de células viables (UFC/g) (Ávila J. et al., 2010). Prueba de antagonismo. La cepa bacteriana con diferencias significativas en las pruebas de tolerancia y la caracterización molecular para Lactobacillus se enfrentó a bacterias patógenas (Salmonella spp., E. coli, Campylobacter jejuni y Clostridium perfringens) comúnmente encontradas en el TGI de las aves de corral. Para el ensayo se incubó la cepa elegida en caldo de tripticasa de soya (TSB) para su activación, posteriormente, se colocó 10 µL de la cepa en el centro de la placa Petri con MRS agar y se incubó por 18 h en anaerobiosis. Pasado el tiempo, se colocó una capa de TSB conteniendo bacterias entero-patógenas a una proporción de 9 mL de TSB y 1 mL del enteropatógeno sobre la capa de MRS con la cepa probiótica, por triplicado. La acción antagónica se midió por el diámetro del halo de inhibición generado expresado en centímetros. Prueba de susceptibilidad antimicrobiana. Se determinó mediante el método de difusión de disco. La cepa bacteriana aislada y las cepas patógenas se sometieron a diferentes antibióticos 10 comúnmente empleados para tratar infecciones entéricas y respiratorias, incluyendo ciprofloxacina 5 µg, dicloxacilina 1 µg, trimetoprim y sulfametoxazol 25 µg, amoxicilina 10 µg, tetraciclina 30 µg, y doxiciclina 5 µg. La cepa seleccionada se sembró en forma masiva en una caja Petri con agar MRS y las cepas patógenas en agar Mueller-Hinton. Luego, sobre la superficie de los cultivos se esparcieron discos con cada antibiótico, se llevaron a refrigeración durante 30 min a 15 °C, y se incubaron a 37°C durante 24 h en condiciones de aerofílicas. Terminada la incubación, la lectura se hizo por la medición del diámetro de la zona de inhibición expresada en centímetros. FASE II. Prueba in vivo de la cepa con característica probiótica, adicionada al agua de bebida en pollos de engorde, a través de un biopreparado Ubicación experimental. La investigación se desarrolló en el Centro de Investigación y Enseñanza Avícola de Zamorano, posterior al proceso de caracterización y pruebas in vitro de la cepa bacteriana. Tratamientos. Se empleó un total de 1,200 pollos de engorde de la raza Ross de un día de edad, ubicando 50 pollos por corral, según un diseño en bloques completamente aleatorizados con tres tratamientos y ocho repeticiones cada uno, para un total de 24 unidades experimentales, durante 32 días. Los tratamientos fueron: 1) Control negativo constituido por dieta basal (DB) sin aditivos, 2) control positivo, DB + APC, 3) Probiótico, DB + cepa probiótica aislada (108 UFC) en el agua de bebida. Las dietas se formularon en un régimen trifásico de inicio (0-10 días), crecimiento (11-21 días) y acabado (22-32 días). Las dietas se elaboraron empleando soya, premezcla de minerales y vitaminas, sal, correctores minerales, antioxidantes y un antibiótico (en el control positivo) Variables estudiadas Desempeño productivo. Todos los animales se pesaron al inicio y final del ensayo. Se midió el consumo de alimentos, mediante la diferencia entre la pesada de la oferta y el rechazo. La ganancia media diaria, conversión alimenticia y la viabilidad se determinó a los 10, 21 y 32 días. Peso relativo de los órganos digestivos y vísceras, morfometría, pH en el tracto gastro intestinal (TGI). A los 21 y 32 días se sacrificaron 24 aves/tratamiento por el método de desangrado de la vena yugular. Antes del sacrificio, las aves se mantuvieron en ayuno, solo con agua ad libitum, para estudiar las principales transformaciones morfo-fisiológicas que acontecen en el TGI, en los órganos accesorios y hematopoyéticos. Se pesó el proventrículo, molleja, ciegos, hígado, bazo, corazón, intestino delgado, intestino grueso, bolsa de Fabricio, timo y páncreas, que se expresaron en peso absoluto (g) y peso relativo al peso vivo (g/g). También, se tomaron y refrigeraron muestras de ciego para recuento de bacterias ácido lácticas, método de siembra por extensión utilizando medio de cultivo MRS agar y diluciones seriadas en agua peptonada, a su vez se sembró en placas con medios para Salmonela (Hecktoen, Acumedia), Clostridium (Clostridium, Acumedia) y Escherichia coli (MacConkey, Acumedia). Además, se midió el pH de 10 ciegos por tratamiento. Características de las porciones comestibles y calidad sensorial. Después del sacrificio se pesaron la canal, vísceras comestibles (hígado, riñón, corazón y molleja), pechuga, pierna, contramuslo y grasa abdominal y piel. Para la calidad sensorial de la carne de pechuga, se conformó un panel de 11 degustadores cuya selección se efectuó teniendo en cuenta los criterios de Ruiz et al. (2001). Los parámetros para la calidad sensorial encuestados fueron: aroma (normal y anormal), sabor (normal y anormal), dureza (normal, dura, muy dura y blanda) y color (normal, pálido e intenso). Bioquímica sanguínea, perfil lipídico e inmunología. Al momento del desangrado se tomaron cinco muestras de sangre por tratamiento para evaluar el hemograma completo, inmunoglobulinas y perfil lipídico. Se utilizó la fórmula de (Salma et al., 2007) para calcular el índice aterogénico (LDL/HDL). Análisis estadísticos. Los datos se procesaron por análisis de varianza y separación de medias por prueba de Duncan. Previamente, se verificó la normalidad de los datos por la prueba de Kolmogorov Smirnov (1951) utilizando los paquetes estadísticos Infostat 2016 y Statistical Analysis System (SAS versión 9.1). 12 4. RESULTADOS FASE I. Caracterización molecular y evaluación in vitro de cepas bacterianas nativas con potencial efecto probiótico, aisladas a partir de los ciegos en pollos de engorde. 3.1 Aislamiento, Morfología y pruebas bioquímicas de las cepas con posible potencial probiótico. En total se aislaron nueve cepas, a las que se les realizó la prueba de catalasa con resultado negativo y para tinción Gram todas positivas. Posterior a la tinción, se observó en el microscopio la morfología de las colonias aisladas, mostrando forma de bastón y coloración morada. Una vez obtenidos los resultados fenotípicos satisfactorios para reconocer bacterias ácido-lácticas, se procedió a realizar las pruebas de tolerancia para determinar su posible capacidad probiótica, además de enviar a secuenciar cada aislamiento con el objetivo de identificar a que género y especie pertenecían. 3.2 Caracterización probiótica. La caracterización probiótica se realizó según los criterios de selección para definir el potencial probiótico de aislamientos de bacterias aisladas en los ciegos de pollo, incluyendo la tolerancia a diferentes pH (2,3,4,5,6 y 7), temperatura (30 °C y 42 °C), concentración de cloruro de sodio (2%, 4%, 7% y 10% p/v) y sales biliares (0.050%, 0.10%, 0.15% y 0.30% p/v). De las seis cepas probióticas aisladas que lograron reproducirse significativamente, tres sobrevivieron a todas las condiciones de pH y dos sobrevivieron a ambas condiciones de temperatura (Cuadro 1). La cepa CLP1 no mostró tolerancia alguna a la exposición de los tratamientos de tolerancia. Tres aislados (CLP6, CLP7, CLP8) toleraron todas las concentraciones de pH, siendo l mejor (P<0.05) la cepa CLP6. La cepa CLP4 Y CLP5 mostraron una reducción significativa en algunas concentraciones de pH por lo que sugiere que las cepas aisladas muestran diversa sensibilidad. Las temperaturas propuestas para el estudio mostraron diferencias significativas entre las cepas aisladas, siendo la cepa CLP6 la más tolerante tanto a 30 °C como a 42 °C. En el caso de la exposición a diferentes concentraciones de cloruro de sodio (NaCl), la cepa CLP6 es la que mostró un mayor mejor crecimiento (P<0.05) respecto a la cepa CLP7, los demás aislados no mostraron crecimiento alguno. Finalmente, la inclusión de sales biliares a diversas concentraciones p/v, estimuló el crecimiento de los aislados CLP6, CLP7 y CLP8, mostrando mayor significancia la cepa CLP6 con una mejor separación de medias. De las cepas aisladas con posible potencial probiótico, la cepa CLP6 fue la que mostró mayor tolerancia y con una mejor respuesta a los diferentes tratamientos, lo que indicó la viabilidad de su elección para los ensayos de susceptibilidad y antagonismo, así como la inclusión en un biopreparado para inclusión en el agua de bebida de los pollitos en el ensayo in vivo. 13 Cuadro 1 Evaluación probiótica in vitro de la tolerancia a pH, temperatura, cloruro de sodio (NaCl) y sales biliares de cepas aisladas de gallos criollos mediante el crecimiento por conteo en placa (Log UFC/g). Crecimiento (Log UFC/g) de cepas bacterianas aisladas CLP 1 CLP 2 CLP 3 CLP4 CLP5 CLP6 pH 2 0.00 7.67b 7.54c 7.87a 6.65d 7.57c 3 0.00 10.21a 8.91d 9.58b 9.65b 9.40c 4 0.00 0.00 10.2ab 10.2ab 9.24c 9.93b 5 0.00 0.00 9.94ab 10.4a 10.3b 10.2c 6 0.00 9.31d 0.00 10.8a 10.2b 10.1c 7 0.00 8.56b 7.43d 8.79a 8.54b 7.70c Temperatura (°C) 30 °C 0.00 0.00 0.00 10.4a 7.23b 0.00 42 °C 0.00 7.63c 7.26c 11.0a 8.00b 5.90d NaCl 2% 0.00 0.00 0.00 8.81a 5.77b 0.00 4% 0.00 0.00 0.00 8.93a 0.00 0.00 7% 0.00 0.00 0.00 9.82a 0.00 0.00 10% 0.00 0.00 0.00 9.87a 0.00 0.00 Sales Biliares 0.05% 0.00 0.00 0.00 11.2a 10.3b 9.88c 0.10% 0.00 0.00 0.00 10.7a 10.3b 9.85c 0.15% 0.00 0.00 0.00 9.51a 9.36b 6.78c 0.30% 0.00 0.00 0.00 9.51a 8.14b 6.78c a,b,c,d Las medias con diferente letra son significativamente diferentes a p< 0.05%, n=3 Susceptibilidad antimicrobiana. Esta característica se midió mediante el incremento de los diámetros del halo de inhibición formado entre la cepa CLP4 de Lactobacillus y las bacterias entero-patógenas en condiciones in vitro en presencia de diferentes antibióticos (Cuadro 2). La cepa CLP4 de Lactobacillus reuteri mostró resistencia a todos los antibióticos, y entre las bacterias entero- patógenas la única cepa que mostró susceptibilidad a ciprofloxacina y trimetropin fue Salmonella ATCC 14028. 14 Cuadro 2. Prueba de resistencia in vitro de la cepa CLP4 de Lactobacillus reuteri y cepas entero- patógenas en presencia de diversos antibióticos. Cepas Antibióticos Ciprofloxac ina Trimetro pin Sulfametax azol Tetracicli na Doxicicli na Dicloxacil ina Amoxicili na Lactobacillus reuteri 0 (R)z 0 (R) 0 (R) 0 (R) 0 (R) 0 (R) 0 (R) E. coli ATCC 11775 0 (R) 0 (R) 0 (R) 0 (R) 0 (R) 0 (R) 0 (R) Salmonella ATCC 14028 S S+ 0 (R) 0 (R) 0 (R) 0 (R) 0 (R) Clostridium ATCC 13124 0 (R) 0 (R) 0 (R) 0 (R) 0 (R) 0 (R) 0 (R) Campylobacter ATCC 33291 0 (R) 0 (R) 0 (R) 0 (R) 0 (R) 0 (R) 0 (R) Los valores de cero indican resistencia (R) y S susceptibilidad a los antibióticos. Antagonismo bacteriano. Las pruebas mediante la medición del diámetro del halo de inhibición indicaron que la cepa CLP4 de Lactobacillus reuteri no presentó actividad antagónica con las cepas entero-patógenas de Salmonella, Clostridium y Compylobacter (Cuadro 3). Cuadro 3. Antagonismo entre Lactobacillus reuteri y cepas enteropatógenas de acuerdo con el diámetro del halo de inhibición de crecimiento in vitro. Cepas Patógenas Halo de inhibición Lactobacillus reuteri E. coli ATCC 11775 0 Salmonella ATCC 14028 0 Clostridium ATCC 13124 0 Campylobacter ATCC 33291 0 FASE II. Prueba in vivo de la cepa CPL4 con característica probiótica adicionada al agua de bebida en pollos de engorde a través de un biopreparado. En esta fase del estudio se evaluaron tres tratamientos: 1) dieta basal (DB) sin adición de antibióticos promotores de crecimiento (APC) o control negativo; 2) DB + APC (control positivo); y 3) DB + cepa probiótica CLP4 seleccionada en la fase 1 en el agua de bebida ofrecida a los pollos de engorde. Desempeño productivo. El peso final enl desempeño productivo de pollos de engorde hasta los 32 días del control negativo DB sin APC, control positivo DB con APCy el probiótico en la en la bebida presentaron diferencias significativas (P<0.05), siendo el control positivo el de mayor ganancia de peso (Cuadro 4). Sin embargo, el mayor consumo de alimento fue para el control negativo y el menor para el probiótico (P<0.0042). En cuanto a la conversión alimenticia se 15 observaron diferencias significativas (P<0.0001), siendo el control negativo el que presentó el mayor valor. En la mortalidad no se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos. Cuadro 4. Efecto de los tratamientos con dieta base sin (control negativo) y con antibióticos promotores de crecimiento (APC) (control negativo), e inclusión de probiótico en el agua ad libitum en el desempeño productivo de pollos de engorde (0-32 días). Variables Tratamientos valor p E.E ± Control negativo Control positivo Probiótico ad libitum Peso inicial (g) 45.5b 46.9a 46.5a 0.0104 0.030 Peso final (g) 1877b 1990a 1844b 0.0042 26.70 Consumo de alimento 2847a 2393b 2193c <.0001 58.03 Conversión alimenticia 1.55a 1.23b 1.22b <.0001 0.030 Mortalidad (%) 3.00 2.75 4.25 0.3525 0.760 a,b,c Las medias con diferente letra son significativamente diferentes a p< 0.05%. Partes comestibles. En las partes comestibles del pollo de engorde incluyendo pechuga, piel pechuga, piel pierna y grasa abdominal, no se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos; sin embargo, si se observaron diferencias en canal ((p<0.048), siendo el tratamiento positivo con antibióticos el de mayor valor (Cuadro 5). También hubo diferencias significativas en la variable pierna (p<0.0003), mostrando el mayor valor en el tratamiento con el probiótico. Cuadro 5. Efecto de los tratamientos con dieta base sin (control negativo) y con antibióticos promotores de crecimiento (APC) (control negativo), e inclusión de probiótico en el agua ad libitum en el rendimiento de partes comestibles en pollos engorde. Variables Tratamientos sexo × Trt valor p E.E ± Control negativo Control positivo Probiótico ad libitum Peso Canal (%) 70.1ab 71.5a 69.2b 0.7740 0.0481 0.61 Pierna (%) 13.5b 14.1b 16.7a 0.0843 0.0003 0.50 Piel (pierna) (%) 1.26ab 1.15b 1.33a 0.3014 0.1131 0.06 Pechuga (%) 19.6 20.4 20.3 0.4139 0.4772 0.54 Piel (pechuga) (%) 1.26 1.31 1.24 0.3020 0.7805 0.07 Grasa abdominal (%) 1.70 1.65 1.57 0.2549 0.6347 0.10 a,b,c Las medias con diferente letra son significativamente diferentes a p< 0.05%; n=24 16 Análisis sensorial. Los resultados de los análisis sensoriales de la pechuga incluyendo las variables, apariencia, color, olor, sabor, dulzura, textura y aceptación general, utilizando una escala hedónica de 9 puntos, indicaron diferencias para las variables apariencia, color y aceptación general (Cuadro 6), siendo el valor más alto para el tratamiento con probiótico. Para las variables olor, sabor, dulzura y textura, no se presentaron diferencias significativas entre tratamientos. Cuadro 6 Resultados del análisis sensorial de pechuga de pollo de los tratamientos con dieta base sin (control negativo) y con antibióticos promotores de crecimiento (APC) (control negativo), e inclusión de probiótico en el agua ad libitum. Variables Tratamientos Control negativo Control positivo Probiótico ad libitum valor p E.E ± Apariencia 6.10b 6.55ab 7.15a 0.015 0.24 Color 5.95b 6.75a 7.25a 0.006 0.27 Olor 6.60 6.70 6.90 0.685 0.25 Sabor 6.30 6.90 7.10 0.109 0.27 Dulzura 6.00 6.20 6.35 0.676 0.28 Textura 6.45 6.70 7.15 0.178 0.26 Aceptacion General 6.05b 6.40b 7.65a <0.0001 0.22 a,b,c Las medias con diferente letra son significativamente diferentes a p< 0.05%; n=20 Peso relativo de órganos y vísceras Las mediciones de los pesos del intestino delgado, bazo, timo, hígado, corazón y páncreas, mostraron diferencias significativas entre los tratamientos, siendo el valor más alto del probiótico en el intestino, para el control negativo el timo, y en las variables restantes por los tratamientos del control positivo (antibióticos) y el probiótico (Cuadro 7). Para la interacción sexo × tratamiento se presentaron diferencias significativas en los pesos de intestino delgado, bolsa de Fabricio y en el corazón Recuento de bacterias acido lácticas y entero patógenas y pH en contenido cecal. Para el recuento de baterías y medición de pH se recolectaron los contenidos cecales de los ciegos, en los que no se encontraron diferencias significativas en el recuento de enterobacterias (Cuadro 8). Sin embargo, en la interacción sexo × tratamiento, se encontró diferencias en el aislamiento de E. coli. Para el recuento de bacterias ácido-lácticas se observaron diferencias significativas entre los tratamientos (p=0.0025), siendo el probiótico el que mostró el mayor recuento. Para el pH, el probiótico presentó el menor valor en las diferencias significativas entre tratamientos (p= 0.0404). 17 Cuadro 7. Efecto de los tratamientos con dieta base sin (control negativo) y con antibióticos promotores de crecimiento (APC) (control negativo), e inclusión de probiótico en el agua ad libitum en el peso relativo de órganos productivos y vísceras de pollos de engorde. Variables Tratamientos Sexo × TRT valor p E.E ± Control negativo Control positivo Probiótico ad libitum Proventrículo 9.72 9.59 9.19 0.0826 0.5069 0.33 Molleja 38.7 38.7 42.0 0.5454 0.1695 1.37 Int. delgado 54.2b 51.6b 59.5 a 0.8052 0.0026 1.39 Int. grueso 2.30 2.24 2.47 0.0075 0.5080 0.14 Ciegos 10.5 9.91 10.4 0.2237 0.6944 0.55 Bazo 1.50b 1.92a 2.00 a 0.1168 0.0006 0.08 Timo 7.37 a 6.12 b 4.85 b 0.2271 0.0011 0.43 Bolsa Fabricio 2.49 2.56 2.88 0.0010 0.1587 0.16 Hígado 32.3 b 37.5 a 37.0 a 0.1222 0.0006 0.83 Corazón 8.83 b 9.39 ab 10.2 a 0.0059 0.0330 0.36 Páncreas 3.74 b 4.63 a 4.83 a 0.2062 0.0015 0.2 a,b,c Las medias con diferente letra son significativamente diferentes a p< 0.05%; n=24 Cuadro 8. Recuento de bacterias acido lácticas y enterobacterias aisladas de contenido cecal de pollos de engorde y pH a los 32 días en los tratamientos con dieta base sin (control negativo) y con antibióticos promotores de crecimiento (APC) (control negativo), e inclusión de probiótico en el agua ad libitum. Tratamiento Variables Control negativo Control positivo Probiótico ad libitum Sexo × TRT Valor P E.E ± Bacterias acido Lácticas 7.29b 6.72b 8.43a 0.6919 0.0025 0.34 Escherichia coli 7.22 7.40 7.57 0.0023 0.3231 0.15 Clostridium 7.61 7.60 7.56 0.8486 0.6421 0.18 Salmonella spp 5.46 5.40 5.23 0.7167 0.1620 0.11 pH 7.18b 6.53ab 5.81a 0.6106 0.0404 0.24 a,b,c Las medias con diferente letra son significativamente diferentes a p< 0.05%; para recuento n= 18; pH n=10 Bioquímica sanguínea, perfil lipídico e inmunología. En los resultados de la bioquímica sanguínea se registraron diferencias significativas entre tratamientos en la serie blanca de células sanguíneas, los linfocitos y las plaquetas; presentándose el mayor valor de células blancas y linfocitos en el tratamiento con probióticos, y en plaquetas en el control positivo con antibióticos (Cuadro 9). En el perfil inmunológico, solo la variable G de las inmunoglobulinas mostró diferencias significativas, 18 siendo el mejor valor con probióticos. Finalmente, en el perfil lipídico las diferencias significativas fueron en triglicéridos, con el mayor valor para el control negativo. Cuadro 9. Análisis de parámetros hematológicos, bioquímicos y perfil lipídico en muestras de sangre de pollos de engorde de 32 días de los tratamientos con dieta base sin (control negativo) y con antibióticos promotores de crecimiento (APC) (control negativo), e inclusión de probiótico en el agua ad libitum. Tratamiento Variables Control negativo Control positivo Probiótico ad libitum Valor P E.E ± Hematología Células blancas 5.52 b 5.28 b 7.04 a 0.0002 0.17 Linfocitos 3.45 b 3.51b 4.80 a 0.0001 0.12 Monocitos 0.68 0.08 0.16 0.4233 0.33 Granulocitos 2.24 1.60 2.08 0.2675 0.23 Linfocitos (%) 62.6 66.6 68.6 0.2041 2.19 Monocitos (%) 2.00 1.40 2.40 0.2508 0.39 Granulocitos (%) 35.2 32.0 29.4 0.2877 2.4 Recuento glóbulos rojos 2.49 2.48 2.46 0.9765 0.009 Hemoglobina 11.3 10.8 11.6 0.3501 0.34 Concentración media HC 33.2 33.2 33.3 0.7660 0.06 Hemoglobina corpuscular media 46.0 44.4 44.3 0.9126 3.14 Volumen corpuscular medio 137 133 141 0.7278 7.37 Hematocitos 34.2 32.6 34.8 0.3397 1.02 Plaquetas 7.18 ab 7.74 a 6.12b 0.0094 0.28 Inmunología Inmunoglobulina A 0.19b 0.28ab 0.32a 0.0923 0.04 Inmunoglobulina G 1.00b 0.96b 1.56a 0.0178 0.13 Inmunoglobulina M 1.96b 2.70a 3.06a 0.1223 0.34 Perfil Lipídico Triglicéridos 30.49a 25.1ab 20.7b 0.0205 1.90 Colesterol total 120ab 124a 112a 0.0310 2.54 LDL 45.4b 49.9a 49.2ab 0.0755 1.26 HDL 69.3a 69.4a 59.2b 0.0477 2.75 LDL/HDL 0.67b 0.72ab 0.83a 0.0628 0.04 a,b,c Las medias con diferente letra son significativamente diferentes al p< 0.05%, n=15, LDL= Lipoproteína de baja densidad, HDL= Lipoproteína de alta densidad 19 Análisis de contenido en tibias de pollos de engorde. Para el contenido en tibias se encontraron diferencias significativas en la cantidad de cenizas (p<0.004) siendo el mayor valor en el control negativo y probióticos y relacionados con el contenido de calcio, en la que ambos tratamientos fueron superiores al control positivo con antibióticos (Cuadro 10). Cuadro 10. Análisis de ceniza, calcio y fósforo en tibias de pollos de engorde de 32 días de los tratamientos con dieta base sin (control negativo) y con antibióticos promotores de crecimiento (APC) (control negativo), e inclusión de probiótico en el agua ad libitum. Variables Tratamiento Control negativo Control positivo Probiótico ad libitum Valor P E.E ± Ceniza 63.6a 59.7b 63.6a 0.0046 0.67 Calcio 12.4b 13.2a 12.4b 0.0151 0.19 Fósforo 4.85 4.87 4.80 0.9293 0.13 a,b,c Las medias con diferente letra son significativamente diferentes a p< 0.05%; n=15 Análisis en camas. En el análisis de la humedad, contenidos de nitrógeno, fósforo, y amoníaco en el suelo y en la altura de las aves, no se encontraron diferencias significativas (Cuadro 11). Cuadro 11. Contenidos de humedad, nitrógeno, fósforo y amoníaco (NH3) en camas de pollos de engorde en los tratamientos con dieta base sin (control negativo) y con antibióticos promotores de crecimiento (APC) (control negativo), e inclusión de probiótico en el agua ad libitum. Variables Tratamiento Control negativo Control positivo Probiótico ad libitum p-value E.E ± Humedad 32.1 27.3 32.0a 0.3361 2.38 Nitrógeno 2.59 2.88 2.90 0.1245 0.09 Fósforo 0.93b 1.02a 0.93b 0.0609 0.02 NH3 (piso) 0.10ab 0.28a 0.08b 0.0766 0.06 NH3 (altura ave) 0.09 0.19 0.07 0.1639 0.05 a,b,c Las medias con diferente letra son significativamente diferentes a p< 0.05%; n=15 20 5. DISCUSIÓN El objetivo del estudio fue identificar y demostrar la capacidad probiótica de aislamientos de Lactobacillus del tracto intestinal de gallos que no estuvieron la expuestos a antibióticos promotores de crecimiento mediante ensayos in vitro y analizando los resultados obtenidos. El aislamiento y caracterización de cepas de Lactobacillus del tracto gastro intestinal permitió comprobar de manera experimental y posterior en ensayos in vivo la capacidad de colonización y posible característica probiótica de los aislamientos (Rondón et al., 2008). Como resultado de los ensayos in vitro se aislaron nueve cepas de las cuales solo cinco mostraron viabilidad al crecer en diferentes medios, dando un resultado negativo para la prueba de catalasa y positivo para tinción Gram, indicando que pertenecían al grupo de Lactobacillus. Sin embargo, para una mayor fiabilidad del hallazgo se procedió a realizar una identificación molecular basada en secuenciación de ARNr 16S; de esta prueba, de los nueve aislados secuenciados dos resultaron ser Lactobacillus reuteri, solo la cepa CLP6 mostro crecimiento permanente, tanto en los tratamientos como en la reproducción masiva. Las cepas de Lactobacillus son de importancia industrial y se han estudiado por su capacidad probiótica al soportar diversas condiciones (Kubota et al., 2009). Uno de los criterios más importantes para la selección in vitro de las cepas probióticas, es la tolerancia a pH ácido y sales biliares. En ensayos realizados por Pérez et al. (2015) mencionan que someterlos a pH muy acido puede reducir la supervivencia de algunas cepas, sin embargo, en el estudio los aislamientos mostraron supervivencia en todos los niveles de pH, incluso a uno muy bajo como pH 2.0, lo cual es ventajoso ya que las bacterias al pasar por el tracto gastrointestinal se exponen a niveles de pH entre 1.5 y 2.0 (He et al., 2019) La tolerancia a sales biliares se considera vital por la capacidad de colonización que deben tener las bacterias probióticas en las paredes intestinales y su buena capacidad metabólica en el huésped (Sirichokchatchawan et al., 2018). En las concentraciones empleadas en el ensayo La cepa CLP4 mostró valores de supervivencia significativos (P<0.05), lo cual indica su posible capacidad de supervivencia en el tracto gastrointestinal en los pollos al ser incluido en el agua de bebida como probiótico. Este resultado es satisfactorio ya que la concentración de sal biliar en el intestino oscila entre 0.2% y 0.3% (Hu et al., 2018) .El crecimiento de la cepa CLP4 probiótica de Lactobacillus reuteri a temperaturas de 42 °C, muestra la viabilidad para ensayos in vivo ya que las temperaturas pueden variar dentro de los galpones y sobre todo en el agua de bebida proporcionada a los pollitos desde su primer día de vida. Por lo que su tasa de crecimiento no se debería ver 21 drásticamente afectada, facilitado el consumo y por ende el desarrollo y colonización en el intestino, por lo que el crecimiento de la cepa en todas las concentraciones de sal indica una buena supervivencia como probiótico industrial (Gancel et al., 1997). La cepa de Lactobacillus reuteri, mostró actividad antimicrobiana al dar resultados de resistencia a los antibióticos usados en el estudio, siendo una cepa funcional para ser administrada junto a antibióticos en pollos de engorde. Los análisis de susceptibilidad son de suma importancia para la elección de un probiótico ya que de eso dependerá la adecuada administración y capacidad de supervivencia en diferentes ambientes (Sharma et al., 2014) . Otros organismos que mostraron resistencia a antibióticos fueron las cepas enteropatógenos incluidas en el estudio, a excepción de Salmonella typhimurium ATCC 14028TM, que mostró susceptibilidad a ciprofloxacina y trimetropin. La resistencia a los antibióticos es considerada como un problema de salud pública, y en el caso de las aves de corral podrían jugar un papel importante al momento de incubar infecciones (Diarra et al., 2010). Esto representa una amenaza latente a la salud humana, principalmente por el uso no controlado de APC, asociado a la presión de selección en la población de aves de corral, reduciendo la eficacia terapéutica y generando resistencia (Diarra y Malouin, 2014). Se ha comprobado que en las granjas orgánicas la resistencia a antibióticos es menor, indicando la importancia de conocer la interacción de los microorganismos y antibióticos con el ambiente y alternativas para su disminución (Hegde et al., 2016). Por otro lado, el antagonismo entre Lactobacillus reuteri y las cepas enteropatógenas no mostró resultados significativos, por lo que se podrían utilizar otras técnicas para comprobar si existe o no antagonismo, ya que los probióticos como Lactobacillus poseen compuestos naturales inhibitorios en el intestino, reduciendo la posibilidad de crecimiento de algunas bacterias dañinas al disminuir el pH por acción de ácidos orgánicos como el ácido láctico (Aroutcheva et al., 2001). FASE II. Prueba in vivo de la cepa con característica probiótica mediante adición al agua de bebida en pollos de engorde En esta etapa del estudio se registraron diferencias significativas en la mayoría de las variables relacionadas al desempeño productivo. En el peso final, el tratamiento con probiótico tuvo la menor ganancia a diferencia de estudios realizados por Zhang y Kim (2014) observaron que al suplementar la dieta con probióticos el peso de los pollos de engorde incrementó con respecto al tratamiento control. En cuanto al consumo de alimentos, el mayor valor se obtuvo en el tratamiento negativo (control) en relación con el tratamiento con probiótico que reportó un menor consumo de alimento a los 32 días. Este resultado contrasta con la menor conversión alimenticia reportada en la investigación con el uso de probióticos; en concordancia con los estudios realizados por Blajman et al. (2015), en los que la administración de probióticos en la dieta, mejoran la eficiencia en el conversión alimenticia respecto al tratamiento control. Para el rendimiento de las partes comestibles, el análisis de la canal arrojó valores significativos, siendo mayor para el tratamiento positivo con APC que contrasta con el resultado del peso final. 22 Estudios realizados por Núñez Torres et al. (2017) demostraron que el uso de probióticos en la dieta para pollos de engorde a través del agua mejora el rendimiento de la canal. Con el fin de evaluar la aceptación de la carne proveniente de las partes comestibles del pollo, se realizó un análisis sensorial con una escala hedónica de 9 puntos, utilizando diferentes atributos para calificar la calidad de los tratamientos. La carne de pollo posee nutrientes indispensables para diversas funciones del organismo por lo que conocer su calidad y aceptación general es importante (Gallinger et al., 2004). Para el atributo color, el tratamiento con probiótico obtuvo la mayor aceptación; en cuanto al atributo olor, el tratamiento positivo con ACP como el de probiótico obtuvieron los mejores valores de aceptación respecto al tratamiento negativo sin ACP. Siendo el tratamiento con probióticos el que obtuvo la mejor aceptación por parte del panel de jueces. Durante el proceso de eviscerado, se midieron los órganos productivos y viseras, y los órganos con diferencias significativas fueron intestino delgado, bazo, timo, hígado, corazón y páncreas. El factor sexo afectó únicamente el corazón. El recuento de bacterias acido lácticas en el contenido cecal de pollos de engorde a los 32 días mostró un valor superior para las aves suplementadas con el probiótico Lactobacillus reuteri en el agua de bebida, mientras que, el tratamiento positivo basado en el uso de antibióticos en la dieta mostró el menor recuento de bacterias ácido lácticas. Lo anterior contrasta con estudios realizados por (Danzeisen et al., 2011; Lin et al., 2013) en los que la adición de antibióticos al concentrados redujeron la población de Lactobacillus. La mayor concentración de Lactobacillus en el tratamiento con probióticos concuerda con el menor valor en la concentración de pH. Según resultados del ensayo no hubo diferencias significativas entre tratamientos para el recuento de cepas entero-patógenas, a pesar de la disminución del pH en el contenido cecal para el tratamiento suplementado con probióticos. El mismo resultado fue evidenciado por (Kazue et al., 2012) en el que no encontraron diferencias en el recuento de E. coli después de recibir Lactobacillus. Sin embargo, otros estudios en los que se suplementaron con Lactobacillus lograron disminuir las poblaciones de Salmonella, Clostridium perfringens y Escherichia coli (van Coillie et al., 2007). De acuerdo con los análisis hematológicos realizados a los 32 días en pollos de engorde, la mayoría de las variables no presentaron diferencias significativas. Las células blancas presentaron diferencias significativas, indicando un mejor valor para el tratamiento suplementado con probióticos; contrario a los encontrado por Avilez Colón et al. (2015) en el que el recuento de células blancas fue menor en los tratamientos suplementados con probióticos al utilizar Bacillus. El recuento de linfocitos mostró valores más altos al suplementarse probióticos, sin embargo, reportes realizados por Tessari et al. (2006) no encontraron diferencias significativas a pesar de tener recuentos un poco mayores en los tratamientos con probióticos Adicionalmente, el recuento plaquetario mostró diferencias significativas, pero los valores más bajos los reporto el tratamiento con probióticos, coincidiendo con estudios realizados por Gutiérrez y Corredor (2017) que mostraron que el recuento plaquetario fue inferior para los probióticos utilizados en a dieta, lo que podría generar hemorragia, siendo necesario profundizar en este estudio. 23 Los tratamientos no influenciaron en el cambio de otros parámetros hematológicos, en el recuento de glóbulos rojos no se observó diferencias al igual que en estudios realizados por Gutiérrez y Corredor (2017) en el que reportan valores menores al usar Bacillus , como si esta adición generará alguna limitante en la producción de oligoelementos y vitaminas. Los valores de hematocritos no mostraron diferencias significativas, reportándose valores bajo el límite o en el límite inferior respecto al rango utilizado por el laboratorio. Chanie y Haile (2014) mencionan que los pollos de engorde pueden tener valores de hematocritos más bajo, pero podrían aumentar con la edad. De acuerdo con estudios realizados por Fernández et al. (2018), no se encontraron diferencias significativas en el recuento de hemoglobina. Sin embargo, Gheisari y Kholeghipour (2006) si encontraron diferencias entre tratamientos para recuento de hemoglobina adicionando Saccharomyces cerevisiae. En el perfil inmunológico no se observaron diferencias significativas en dos de los antígenos, pero si en el antígeno IgG en el que el mejor valor fue en los probióticos. Algunos estudios reportan que al suministrar probióticos en el agua de bebida mejoraron la respuesta inmune en pollos de engorde, debido a que los probióticos mejoran la función inmune al estimular la síntesis de péptidos en el intestino, lo que indica animales más sanos (Salim et al., 2013; Stringfellow et al., 2011). En otros estudios se demostró que la adición de probióticos estimuló el crecimiento de órganos linfoides como el timo y la bolsa de Fabricio (Alkhalf et al., 2010), en este estudio estos órganos presentaron diferencias significativas lo cual pudo inducir a un mejor valor para los pollos tratados con probióticos en la respuesta inmune. La suplementación de probióticos se ha comprobado que posee efectos positivos sobre las grasas, lo cual se evidencia en los valores menores en el tratamiento con probióticos, aunque solo los triglicéridos mostraron diferencias significativas. Esta mejora en el metabolismo de las grasas se debe a la disminución de los fosfolípidos y la reducción de la grasa abdominal de las aves (Angelovičová et al., 2013). En cuanto al proceso de mineralización ósea, los resultados mostraron diferencias significativas para ceniza y calcio, siendo el valor mayor para probiótico y el control negativo en ceniza y para calcio el mejor valor fue para el tratamiento positivo con ACP. La variable ceniza en la tibia es una de las más usadas para explicar el proceso de mineralización de calcio y fósforo (Chung et al., 2013). El contenido de ceniza es muy sensible a que tanto puede variar el calcio; en este estudio la cantidad de ceniza fue inversamente proporcional a la de calcio, ya que el tratamiento positivo tiene la menor cantidad de ceniza, pero la mayor en calcio, contrastando así con estudios realizados por Yan et al. (2005) en el que lo valores de ceniza respecto a calcio eran inversos, confirmando así la alta sensibilidad entre estas variables. 24 CONCLUSIONES Los ensayos de in vitro mostraron resultados contundentes sobre las pruebas de tolerancia en una de las cepas aisladas, confirmándose con la secuenciación genética que corresponde a una cepa de Lactobacillus reuteri, la es una bacteria con muy buenas características probióticas. Sin embargo, para el ensayo de antagonismo, se sugiere replicar y utilizar otra metodología para confirmar la viabilidad de la cepa aislada en presencia de bacterias entero-patógenas. La cepa probiótica mostró buenos resultados en cuanto a la conversión alimenticia y otros parámetros en pollos de engorde de un período de 32 días. Es una cepa resistente a los cambios de temperatura en los galpones, así como al pH en el agua de bebida, por lo que es una cepa adecuada para futuros ensayos. Es necesario mejorar la presión del agua para una mejorar la distribución del agua con el probiótico, para asegurar que se mantenga en las tuberías la concentración deseada para el consumo de los pollos durante el ciclo de engorde. 25 LITERATURA CITADA Agostini, P. S., Solà-Oriol, D., Nofrarías, M., Barroeta, A. C., Gasa, J. y Manzanilla, E. G. (2012). Role of in-feed clove supplementation on growth performance, intestinal microbiology, and morphology in broiler chicken. Livestock Science, 147(1-3), 113–118. https://doi.org/10.1016/j.livsci.2012.04.010 Alkhalf, A., Alhaj, M. y Al-Homidan, I. (2010). Influence of probiotic supplementation on blood parameters and growth performance in broiler chickens. Saudi Journal of Biological Sciences, 17(3), 219–225. https://doi.org/10.1016/j.sjbs.2010.04.005 Angelovičová, M., Alfaig, E., Král, M. y Tkáčová, J. (2013). The effect of the probiotics Bacillus subtilis (pb6) on the selected indicators of the table eggs quality, fat, and cholesterol. 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