l PRODUCCION DE HIBRIDOS E INCREMENTO EN LA COMPATIBILIDAD DE Phaseolus vulgaris x Phaseolus acutifolius EN RETROCRUZAS CONGRUENTES MEDIANTE RESCAlE DE EMBRIONES PO R: _!Zuis lCoJr.i9o f-J et.~~ Camacho TESIS PRESENTADA COMO REQUISITO PREVIO A LA OBTENCION DEL TITULO DE INGENIERO AGRONOMO c , ESCUELA AGRICOLA PANAMERICANA AGOSTO, 1994 iii PRODUCCION DE HIBRIDOS E INCREMENTO EN LA COMPATIBILIDAD DE Phaseo/us vulgaris x Phaseolus acutifo/ius EN RETROCRUZAS CONGRUENTES MEDIANTE RESCATE DE EMBRIONES Por Luis Rodrigo Perez Camacho El autor concede a la Escuela Agricola Panamericana el permiso para reproducir o distribuir copias de este trabajo para los fines que considere necesarios. Para otras personas y otros fines se reservan los derechos del autor. -------~J~:l~f i: _______ _ . . Luis Rodrigo Perez Camacho Agosto - 1994 IV DEDICATORIA A Dios por su inrnenso amory bondad. A mis padres, Marina Rosa y Rafael por su amor, dedicaci6n y sacrificios que nos han prodigado a nosotros sus hijos. A mis hermanos, Adolfo, Ximena y Diego, por su apoyo, carifio y confianza. A mi sobrinita Pamela por ser una persona tan especial en mi vida. A mis cufiados Juan Pablo y Ana Maria por el apoyo y amistad que me han brindado. v AGRADECIMIENTOS Quiero agradecer especialmente al Dr. Juan Jose Alan por la orientacion brindada en el transcurso de mis estudios de cuarto afio y en la realizacion de Ia presente investigacion. AI Dr. Wilfredo Colon y al Dr. Juan Carlos Rosas por sus consejos y colaboracion en Ia elaboracion de esta tesis. Al Dr. Francisco Gomez por su ayuda en el anatisis estadistico realizado en este trabajo. A la Ing. Agr. Aracely Castro, al Ing. Agr. David Rodriguez y al log. Agr. Oswaldo Varela, M.Sc. por sus consejos y apoyo brindado durante la realizacion de Ia tesis. A Olga Murillo por su colaboracion en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos. A Leslie Colindres, Luz Henriquez, Carlos Alvarado, Jorge Sanchez y Roger Ramos por su ayuda en la realizacion de las hibridaciones interespecificas. AI Arq. Teodoro Albornoz y a Donaldo Caceres por el trabajo de fotografia. A la familia Holloway: Beth, Aldon, Braden y Hamptom y tambien a mis amigos Franklin Fernandez, Rodrigo Salinas, Marco Vasquez, Ivan Ortiz, Rodrigo Daza, Naozumi Tanaka, Luis Prado, Giacomo Pezzarossi, Edgar Fajardo, Carlos Fuentes, Ricardo Ewel, Edwin Ac Bol, Mario Justiniano, Clodys Menacho, Ostilio Almendarez, Xavier Sandoval, Edgardo Varela, Fernando Neri, Sergio Castro y Marco Zelada por la amistad que me brindaron durante mi carrera. A Ia familia Beltran en Tegucigalpa, Amoldo, Delicia y Carlos por el carifio, la confianza, y amabilidad con que me han tratado durante mi permanencia en Honduras. A mis queridos amigos Ace, en Bolivia, por su amistad y buenos momentos que disfrutamos juntos. Al personal del Departamento de Agronomia que de una u otra manera ayudaron en la realizacion del trabajo. VI INDICE TITULO ....................................................................................................................... i APROBACION ........................................................................................................... ii DERECHOS DE AUTOR ......................................................................................... .iii DEDICATORIA ........................................................................................................ .iv AGRADECIMIENTOS ............................................................................................... v INDICE ....................................................................................................................... vi INDICE DE CUADROS .............................................................................................. x INDICE DE FIGURAS .............................................................................................. xiv COMPENDIO ............................................................................................................ xvi I. INRODUCCION ................................................................................................... 1 II. REVISION DE LITERA TURA ......................................................................... .3 A. Introducci6n ................................................................................................ 3 B. Problematica ............................................................................................... 4 C. Origen de Phaseo/us vulgaris y Phaseo/us acutifo/ius .............................. .5 D. Hibridaci6n interespecifica entre las especies de Phaseolus ...................... 5 E. Rescate de embriones ................................................................................... 7 F. Generaciones hibridas interespecificas ....................................................... 9 G. Fertilidad de las generaciones hibridas interespecificas ........................... 11 III. MA TERIALES Y METODOS .......................................................................... 12 A. Localizaci6n ............................................................................................... 12 B. Material genetico para la obtenci6n de hibridos F 1 .................................. 12 1. Caracteristicas de los genotipos ..................................................... 13 a. Phaseo/us vulgaris ............................................................. 13 VII b. Phaseolus acutifolius ......................................................... 13 C. Material genetico del Programa de Investigaciones en Frijol ................... 14 D. Siembra del material genetico para Ia producci6n de hibridos F1 ........... 19 E. Hibridaci6n entre Pv y Pa para Ia producci6n de hibridos F1 .................. 20 1. Material y equipo para realizar las hibridaciones .......................... 20 2. Cruzas interespecificas entre P. vulgaris y P. acutifolius .............. 21 F. Rescate de embriones ................................................................................. 22 1. Preparaci6n del medio de cultivo ................................................... 22 2. Esterilizaci6n del medio de cultivo ............................................... .22 3. Material vegetal ............................................................................. 22 4. Asepsia ............................................................................................ 23 5. Condiciones de crecimiento ........................................................... .25 G. Transplante y adaptaci6n de los hibridos Fl .............................................. 25 H. Prueba de viabilidad de polen de los lubridos Fl ....................................... 27 I. Retrocruzas congruentes .............................................................................. 28 J. Rescate de embriones provenientes de Ia primera retrocruza congruente (RCl) ........................................................................................ 29 K. Adaptaci6n de las RCl ............................................................................... 29 L. Pruebas de viabilidad de polen de las RCl ................................................. 29 M. Autopolinizaci6n de RCl ........................................................................... 29 N. Retrocruzas congruentes del material proveniente del PIF ......................... 29 N. Prueba de viabilidad de polen del material proveniente del PIF ................. 31 0. Producci6n de semilla .................................................................................. 31 P. Analisis estadistico ....................................................................................... 32 IV. RESULT ADOS ..................................................................................................... 34 Vlll A. Hibridaci6n interespecifica entre P. vulgaris y P. acutifolius .............. .34 B. Rescate de embriones ............................................................................. 38 C. Transplante y adaptaci6n de los hibridos Fl ......................................... .48 D. Prueba de viabilidad de polen de los htbridos Fl .................................. 55 E. Retrocruzas congruentes ......................................................................... 56 F. Rescate de embriones provenientes de la primera retrocruza RCl ........ 59 G.Transplante y adaptaci6n de las RCl ...................................................... 63 H. Pruebas de viabilidad de polen de las RCl ............................................ 66 I. Autopolinizaci6n de RC 1 ........................................................................ 67 J. Retrocruzas congruentes del PIF ............................................................. 68 K. Prueba de viabilidad del pol en del material genetico del PIF ............... 70 L Produce ion de semilla ............................................................................ 73 V. DISCUS! ON .................................................................................................... 76 A. Hibridaci6n interespecifica entre P. vulgaris y P. acutifolius ............... 76 B. Rescate de embriones ............................................................................. 80 C. Transplante y adaptaci6n de los hibridos Fl .......................................... 82 D. Prueba de viabilidad de polen de los hibridos Fl .................................. 84 E. Retrocruzas congruentes ........................................................................ 85 F. Rescate de embriones provenientes de Ia primera retrocruza RCl ........ 86 G. Adaptaci6n de las RCl ........................................................................... 87 H. Prueba de viabilidad de polen de las RCl ............................................. 88 I. Autopolinizaci6n de RCI ........................................................................ 88 J. Retrocruzas congruentes del PIF ............................................................. 89 K. Prueba de viabilidad del pol en del material genetico del PIF ................ 90 L. Producci6n de semilla ............................................................................. 90 IX Vl. CONCLUSIONES ........................................................................................ 91 Vll. RECOMENDACIONES .............................................................................. 92 VIII. LITERATURA CITADA ............................................................................. 93 X INDICE DE CUADROS Cuadro 1. Genotipos utilizados para la obtenci6n de hibridos interespecificos entre Phaseolus vulgaris y Phaseolus acutifolius ................................... 13 Cuadro 2. Fechas de siembra para el programa de hibridaci6n interespecifica entre P. vulgaris y P. acutifo/ius ............................................................ 19 Cuadro 3. Composici6n del medio basico de Murashige y Skoog (1962) modificado, utilizado para el cultivo de embriones provenientes de cruzas interespecificas entre P. vulgaris y P. acutifolius .................. 23 Cuadro 4. Clave para Ia identificaci6n de los hibridos F1 seg(m Ia cruza inicial entre P. vulgaris y P. acutifo/ius ................................................. 24 Cuadro 5. Soluci6n nutritiva (Broughton y Dillworth, 1970) utilizada para regar las plantulas F1 durante los primeros diez dias de adaptaci6n y Ia floraci6n .......................................................................................... 27 Cuadro 6. Porcentaje de prendimiento y caracteristicas cuantitativas de las F1 entre P. vulgaris y P. acutifolius ....................................................... 35 Cuadro 7. Analisis de la variancia del prendimiento en Ia hibridaci6n interespecifica entre Phaseolus vulgaris y Phaseolus acutifolius ......... .36 Cuadro 8. Analisis de separacion de medias del prendimiento en cruzas interespecificas entre P. vulgaris y P. acutifolius segim los genotipos utilizados como planta femeninas y masculinas .................... 36 Cuadro 9. Componentes de la variancia del prendimiento en las cruzas interespecificas entre P. vulgaris y P. acutifolius .................................. 37 XI Cuadro 10. Promedios y rangos de dfas desde Ia cruza basta el rescate, semillas por vaina y embriones rescatados por vaina ...... ... ................. .. .. 39 Cuadro 11 . Correlaci6n entre Ia longitud de Ia vaina, el niunero de semillas por vaina y los dias despues de Ia cruza hasta el rescate de embriones F1 .. ....... .......... .... ........... .. ... ..... ....... ..... ........... ......... .............. 41 Cuadro 12. Promedios y rangos de algunas caracteristicas de los embriones y las plantulas F1 transplantadas ... .............. .. ...... ..... ...... ...................... . .44 Cuadro 13. Promedios, rangos y porcentajes de dias desde el rescate basta el transplante, F1 que florecieron y fertilidad del polen observados en las plantas F1 provenientes de cruces interespecificos entre Pv y Pa .. . .49 Cuadro 14. Correlaciones entre el niunero de embriones F1 rescatados y el niunero de plantulas Fl transplantables ... ... .. ... ..... ....... .... ..... .... .... .... ..... 53 Cuadro 15. Componentes de Ia variancia de la fertilidad del pol en durante retrocruzas entre P. vulgaris (DOR 364) y los hfbridos Fl ............ ... .... 55 Cuadro 16. Analisis de variancia de la fertilidad del polen en las retrocruzas entre P. vulgaris (DOR 364) y los hfbridos Fl .. ... .. ..... ... ..... .. ...... .......... .56 Cuadro 17. Porcentajes de prendimiento y caracteristicas cuantitativas de las RCl (DOR 364 x hfbridos Fl) ...................... ............... .................. 51 Cuadro 18. Componentes de la variancia del prendimiento en las retrocruzas entre P. vulgaris (DOR 364) y los hibridos Fl ... .... .. ... ..... ......... ............ 58 Cuadro 19. Amilisis de Ia variancia del prendimiento en las retrocruzas entre P. vulgaris (DOR 364) y los hibridos Fl ....... .. ............................. 58 XII Cuadro 20. Promedio y rangos de dias desde la retrocruza hasta el rescate de embriones, semillas por vaina y embriones rescatados por vaina ............ 60 Cuadro 21. Promedios y rangos de algunas caracteriscticas cuantitativas de los embrines y las plantulas RC1 transplantadas ..................................... 61 Cuadro 22. Correlaciones entre la longitud de la vaina, el nfunero de semillas por vaina y los dias despues de Ia retrocruza hasta el rescate de los embriones RC 1 .............................................................................. 62 Cuadro 23. Analisis de Ia variancia del numero de semillas por vaina en las retrocruzas entre P. vulgaris (DOR 364) y los hibridos Fl ..................... 62 Cuadro 24. Promedios, rango y porcentajes de dias desde el rescate hasta el transplante, RC 1 que florecieron y fertilidad de pol en observados en las plantas RCI ................................................................................... 64 Cuadro 25. Correlaciones entre el numero de embriones RC1 rescatados y el nfunero de plantulas RCI transplantables ............................................... 65 Cuadro 26. Analisis de Ia variancia de la fertilidad del polen en las retrocruzas y autopolinizaci6n del material genetico RCl ........................................ 66 Cuadro 27. Analisis de la variancia del numero de semillas producidas por planta despues de Ia autopolinizaci6n del material genetico RCI ......... 67 Cuadro 28. Porcentajes de fertilidad del polen y semillas producidas en las retrocruzas congruentes (RC l) con materiales del PIF ..................... 71 Cuadro 29. Porcentajes de fertilidad del polen y semillas producidas en las retrocruzas congruentes (RC2) con materiales del PIF ...................... 71 XIII Cuadro 30. Amilisis de la variancia de la fertilidad del polen en las retrocruzas RCI del PIF .............................................................................................. 72 Cuadro 31. Analisis de la variancia de la fertilidad del polen en las retrocruzas RC2 del PIF ............................................................................................. 72 Cuadro 32. Analisis de la variancia del numero de semillas producidas por planta en las retrocruzas RC 1 del PIF ...................................................... 73 Cuadro 33. Analisis de la variancia del numero de semillas producidas por planta en las retrocruzas RC2 del PIF ..................................................... 74 Cuadro 34. Separaci6n de medias del nl1mero de semillas producidas por planta en las retrocruzas RC2 del PIF ..................................................... 74 Cuadro 35. Correlaci6n entre el prendimiento, la viabilidad del polen y el numero de semillas por vaina en la fase de retrocruzas .......................... 75 Fig. 1 Fig. 2 Fig. 3 Fig. 4 Fig. 5 Fig. 6 Fig. 7 Fig. 8 XIV INDICE DE FIGURAS Entre los ocho y 24 dfas despues de Ia hibridaci6n se removieron las vainas de Ia planta madre. N6tese el pequefio tamafio de Ia vaina ................................................................. .38 Crecimiento de embriones hfbridos provenientes de cruzas interespecfficas entre Pv y Pa. De izquierda a derecha se muestra Ia forma ovoide de los cotiledones, Ia radfcula agrandada en relaci6n con los cotiledones, Ia diferencia en el tamafio en una mismo embri6n y el crecimiento de Ia radfcula y del tallo ............................................................................................... 40 Embri6n normal de Pv, grande y verde y embri6n F1 (Pv x Pa), pequefio y blanco, rescatados 16 dias despues de Ia hibridaci6n Escala 1: 4 ........................................................................................... 42 Plantula hibrida (Pv xPa) 15 dfas despues del rescate. Se observa el desarrollo del tallo y las hojas primarias. La radicula no se desarrollo ...................................................................................... 43 Plantula hibrida (Pv x Pa) cinco dias despues del rescate. La raiz media aproximadamente 2.5 em y el tallo 1 em de longitud ........ .45 Plantula hfbrida (Pv x Pa) antes del transplante, 20 dfas despues del rescate. Se puede notar el tallo delgado de apariencia debit y una hoja trifoliolada pequefia. Su sistema radical presenta Ia raiz principal y raices secundarias .............................................................................. 46 Phintula al momento del transplante, que muestra una hoja primaria entera y otra trifololiada. Escala 2:1 .................................. .47 Plantula F1 (Pv x Pa) mostrando ramas desarrolladas a partir de yemas en el nudo cotiledonar. N6tese que la yema apical del tallo principal ha muerto ..................................................................... .48 Fig. 9 Fig. 10 Fig. 11 Fig. 12 Fig. 13 Fig. 14 Fig. 15 XV De izquierda a derecha se muestra el tamafio de las plantas del P. vulgaris (izquierda), el hibrido F1 (centro) y del P. acutifolius (derecha) durante Ia etapa de floraci6n. Se puede notar Ia pequeiia altura del hibrido F 1, aproximadamente de 20 em .................................. .50 Morfologia de las hojas del hibrido F1 (Pv x Pa) en la etapa de floraci6n. N6tese en la hoja trifoliolada (en la parte inferior izquierda) el foliolo terminal de forma redondeada yen la parte central (inferior y superior) foliolos lanceolados y ovoide- lanceolados, similares al del progenitor de Pa ....................................... .51 Hojas trifolioladas de Pv (izquierda), hibrido F1 (Pv x Pa) (centro) y de Pa (derecha) en Ia etapa de floraci6n ................................ 52 N6tese, de izquierda a derecha, la flor de color lila (89F-50-19); flor de color blanca (hibrido RP-15), flor blanca con tintes de color lila (hfbrido RP-26) y flor blanca (DOR 391). Las vainas del hibrido, similares a las de Pv ................................................................................. 54 Planta RC1-RP26 en periodo de floraci6n. N6tese en Ia hoja trifoliolada (parte superior derecha y parte inferior izquierda) el foliolo terminal de forma triangular similar al del progenitor Pv ............ 63 Plantas de Ia segunda retrocruza RC2 en Ia etapa de floraci6n. Planta del genotipo 92-19-RC2 (izquierda) proveniente de Ia retrocruza 89F-50-18 x 92-19-RCl que muestra el tipo de crecimiento y la morfologia similar a su progenitor femenino (Pa). El genotipo 92-I7B-RC2 ( derecha) proveniente de Ia retrocruza DOR 391 x 92-17A-RC1 muestra caracteristicas similares aPv ............. 68 N6tese a Ia izquierda las flores y las vainas del 92-17-RC2 descendiente de DOR 391 x 92-17- RCl. Las vainas son similares a las del progenitor de Pv. En el92-19-RC2 (a Ia derecha), descendiente de 89F-50-18 x 92-I9-RC1, las vainas son similares a las del progenitor de Pa .............. 69 XVI COMPENDIO La hibridaci6n interespecifica en el genero Phaseolus es uno de los metodos mas utilizados con el objetivo de transferir al frijol comim (Phaseolus vulgaris L.) (Pv), caracteristicas deseables tales como: tolerancia a sequia y a altas temperaturas y resistencia a enfermedades. El frijol tepari (Phaseolus acutifolius A. Gray) (Pa), por su tolerancia a Ia sequia y al calor y resistencia a Ia bacteriosis comim es un recurso genetico con potencial en el mejoramiento del frijol comim. A pesar de que el Pa pertenece al mismo genero que Pv, Ia dificultad que existe para obtener hibridos entre estas dos especies hace que el Pa se encuentre dentro del reservorio terciario de genes de Pv, lo que significa que los hibridos obtenidos senin parcialmente esteriles o esteriles. El problema se presenta despues de Ia polinizaci6n artificial donde las semillas en formaci6n cesan su crecimiento y las vainas caen. El aborto de los embriones puede ocurrir entre los tres y 24 dias despues de Ia polinizaci6n. La utilizaci6n del rescate de embriones in vitro se ha utilizado para superar esta incompatibilidad. El objetivo general de este estudio fue: estudiar Ia compatibilidad y fertilidad de los hibridos provenientes de cruzas interespecificas entre Phaseolus vulgaris y Phaseolus acutifolius. Para alcanzar este objetivo se obtuvieron hibridos Fl mediante cruzamiento y rescate de embriones; de igual manera, se utiliz6 esta tecnica en Ia primera retrocruza (RCI) y se evaluaron Ia fertilidad y compatibilidad de las plantas Fl y RCI. Se continuo con las retrocruzas congruentes del PIF. Se utilizaron cuatro genotipos de Pv como plantas femeninas y cuatro genotipos de Pa como plantas masculinas. Se cruzaron todos los materiales de Pv con Pa tratando de realizar el mayor nfunero posible de cruzas. El estudio se realiz6 en el Departamento de Agronomia de Ia EAP. XVII El prendirniento de las cruzas interespecificas varia seg(m el genotipo de Pa involucrado. La fertilidad de las plantas RC1 fue, en prornedio de 33%, mayor a Ia observada en las plantas F 1 ( 17% ). Se obtuvieron un total de 170 sernillas RC 1. Probablernente, el uso de Ia tecnica del rescate de ernbriones haya contribuido en gran rnanera a Ia producci6n de sernilla hibrida F1 y especialrnente para obtener los hibridos RCl. En los rnateriales del PIF se observ6 un incremento de Ia fertilidad en los rnateriales RC1 y RC2 (de 33% a 37%), despues de que se realizaron las retrocruzas congruentes. I. INTRODUCCION En Latinoamerica, los rendimientos del frijol com1m, Phaseo/u~ vulgaris L. (Pv), son de 599 kglha, significativamente inferiores al potencial de rendimiento observado de este cultivo (mayores de 1000 kglha) (Singh, 1991~ Pachico (1989) citado por Rosas, 1994). Existen varios factores que limitan la productividad de Pv, entre los que se encuentran la irregularidad en la distribuci6n de las lluvias y el ataque de plagas y enfermedades como Ia bacteriosis comun, causada por Xanthomonas campestris pv. phaseoli (Xcp ). Con el objetivo de introducir algunas caracteristicas deseables al Pv se ha utilizado al Phaseo/us acutifoliu~ (Pa), frijol tepari, que es una planta tolerante a Ia sequia y a las altas temperaturas y resistente a Xanthomonas campestris pv. phaseo/i (Haghighi y Ascher, 1988; Ortega, 1992). A pesar de que el Pa pertenece al mismo genero que el Pv, Ia dificultad que existe para obtener hibridos entre estas dos especies hace que se encuentre dentro del reservorio terciario de genes del Pv; lo que significa que los hlbridos obtenidos senin esteriles o tendnin caracteristicas letales. Durante los ultimos afios se han utilizado diferentes tecnicas para obtener hibridos interespecificos entre Pv y Pa con distintos resultados. La que mejores resultados ha dado es el rescate de embriones. El problema surge despues de Ia polini:zaci6n artificial, donde las semillas cesan su crecimiento y las vainas caen. El aborto de embriones puede presentarse entre los tres y 24 dias despues de Ia polini:zaci6n. Retrasos en la divisi6n del endosperma y del 2 embri6n pueden ser las causas del aborto y, consecuentemente, del desprendimiento de la vaina (Sabja, Mok y Mok, 1990). El programa de hibridaci6n interespecifica entre Pv y Pa, en el Departamento de Agronomia de Ia Escuela Agricola Panamericana (EAP), se inici6 en 1989 con el objetivo de transferir las caracteristicas de tolerancia a Ia sequia y resistencia a la bascteriosis comfut del Pa al Pv. En un estudio realizado por Ortega (1992), obtuvo los hibridos Fl mediante rescate de embriones. La fertilidad de las plantas Fl fue baja, por lo que hizo retrocruzas congruentes; sin embargo, no realiz6 rescate de embriones y obtuvo muy poca semilla. Por esta raz6n, en el presente estudio, ademas de obtenerse plantas Fl (Pv x Pa) mediante rescate de embriones tambien se utiliz6 esta tecnica en Ia primera generaci6n de retrocruzas congruentes para incrementar el nU.mero y la fertilidad de los hibridos. De igual manera, se continuaron realizando retrocruzas congruentes con los materiales producidos en los trabajos anteriones. El objetivo general en la presente investigaci6n fue estudiar Ia compatibilidad y la fertilidad de los materiales hibridos provenientes de cruzas interespecificas entre Phaseo/us vulgaris y Phaseolus acutifo/ius. Para ello, se establecieron los siguientes objetivos especificos: 1. Obtener las plantas hibridas Fl (Pv x Pa) mediante hibridaci6n y rescate de embriones. 2. Obtener plantas de Ia primera retrocruza congruente (RCl) con Ia ayuda de rescate de embriones. 3. Evaluar la fertilidad de las plantas Fl y RCl por medio de la viabilidad del polen. 4. Continuar con las retrocruzas congruentes del programa de hibridaci6n interespecifica entre Pv y Pa en la EAP. ll. REVISION DE LITERA TURA A. Introducci6n El genero Phaseolus, de Ia familia de las leguminosas, incluye aproximadamente 35 especies de las cuales cuatro son cultivadas, Phaseolus vulgaris o frijol coml'm, Phaseo/us lunatus o frijol lima, Phaseo/us coccineus o frijol ayocote y Phaseo/us acutifo/ius o frijol tepari (Evans, 1973; CIAT, 1980). De estos, el frijol coml'm es el principal, ya que suple Ia mayor cantidad de proteina en Ia dieta latinoamericana. Lastimosamente, es muy afectado por las enfermedades, los insectos y Ia sequia (Haghighi, 1987; Waines, Manshardt y Wells, 1988; Singh et a/., 1989; White e Izquierdo, 1989). En Latinoamerica, el Phaseolus vulgaris L. (Pv) es cultivado por pequefios agricultores que producen aproximadamente un 48% de Ia producci6n mundial (3983 mill ones de toneladas ). Los rendimientos obtenidos son alrededor de 599 kglha, significativamente inferiores al potencial de rendimiento observado de este cultivo con mejores practicas de producci6n (mayores de 1000 kglha) (Singh, 1991; Pachico (1989) citado por Rosas, 1994). Por otro lado, el frijol tepari, Phaseolus acutifolius A Gray (Pa), a pesar de ser una especie tolerante a Ia sequia, al calor y resistente a las enfermedades y los insectos se cultiva en algunas regiones del noroeste de Mexico y suroeste de los Estados Unidos, pero con baja intensidad de producci6n (Nabhan y Felger., 1978; CIAT, 1980; Haghighi, 1987; Ortega, 1992). 4 B. Problematica En Latinoamerica, en general, el frijol comim se siembra dos veces al aiio de acuerdo con el regimen de lluvias (Thung, 1991; Rosas, 1994 ). En la epoca lluviosa la precipitacion es mayor al requerimiento de agua del cultivo. El exceso de agua se acumula en los suelos y causa encharcamiento, dificulta la recoleccion del grano en el campo ya que la cosecha coincide con este periodo; consecuentemente, causa perdidas del grano por viviparidad y aumenta el ataque de patogenos ( Serracin et a/., 1991; Thung, 1991 ). Por otro lado, en la epoca seca la distribucion de la lluvia es escasa y se presenta estres hidrico en la etapa reproductiva de la planta y en casos extremes puede causar disminuciones entre 35% y 71% en el rendimiento ( Dubets y Mahalle (1969), citados por Thung, 1991 ). El frijol comim es susceptible a enfermedades virales, bacterianas y fimgicas (Sabja, Mok y Mok, 1990). La bacteriosis comim, causada por Xanthomonas campestris pv. phaseoli (Smith) Dye (Xcp), ha sido reconocida como la enfermedad bacteriana mas importante del frijol. Condiciones climaticas de alta humedad relativa y altas temperaturas (28°C a 30°C) favorecen la aparici6n y diseminaci6n de este pat6geno. La bacteria es capaz de infectar el follaje, los tallos, las vainas y las semillas y de sobrevivir en los residuos de la cosecha. En el frijol, la presencia de esta enfermedad se ha observado tanto en la epoca lluviosa como en la seca, pudiendo causar perdidas en el rendimiento entre 22% y 42% (Serracin eta/., 1991). Singh et a/. ( 1989}, sugieren que la mejor man era para maximizar los rendimientos del frijol comim sin incrementar los costos de producci6n que esten al alcance del agricultor es desarrollar variedades que reunan caracteristicas de tolerancia al estres hidrico, al calor y resistencia a las enfermedades. 5 C. Origen de Phaseolus vulgaris y Phaseolus acutifolius Todas las especies cultivadas del genero Phaseolus son diploides, 2n=2x=22. El frijol comim es originario de Mesoamerica o Sudamerica ( Scott, 1968; Brticher y Brticher, 1976; CIAT, 1980; Evans, 1980; Kaplan, 1981; Hucl y Scoles, 1985; Gepts y Debouck, 1991 ). Las principales evidencias de su centro de origen estan basadas tanto en datos arqueol6gicos como en hallazgos de semillas y pedazos de vainas que datan de 10.000 afios de antigiiedad. estudios geobotanicos como Ia distribuci6n de las especies silvestres del frijol comim en algunas regiones de Mexico y Argentina, datos hist6ricos como textos espaftoles del siglo dieciseis que mencionan a1 frijol comim y evidencias lingilisticas como algunas palabras de varias lenguas nativas, entre elias el quechua, el aymara, y el maya que nombran al frijol comun en su vocabulario (Gepts y Debouck, 1991; Rosas, 1994). Por otro lado, el Phaseolus acutifolius es originario de las regiones secas y aridas, de lo que hoy son el suroeste de los Estados Unidos de Norteamerica y el noroeste de Mexico. Segim los registros arqueol6gicos, su antiguedad como especie cultivada data de alrededor de 5000 afios A.C. (CIAT, 1980). Es tolerante a las altas temperaturas y al estres hidrico (Haghighi, 1987). Se adapta al calor y a los climas semiaridos. Tambien es resistente a Ia bacteriosis comun (Xanthomonas campestris pv. phaseoli (Smith) Dye), el chancro de Ia raiz (Macrophomina phaseolina) y al insecto Empoasca kraemeri (Nabhan y Felger, 1978; Waines, Manshardt y Wells, 1988). D. Hibridaci6n interespecifica entre las especies de Phaseolus El primer informe acerca de un intento para obtener hibridos interespecificos en el genero Phaseolus fue el cruce realizado por Mendel en 1865 (Yarnell, 1965 citado por Hucl y Scoles, 1985) entre P. vulgaris y Phaseolus coccineus. Por otro lado, en 1935 6 Mackie y Smith (citados por Thomas y Waines, 1984) informaron cruzamientos entre P. vulgaris y P. acutifo/ius. Debido a que existen ciertas dificultades al hibridizar dentro y entre especies en algunos generos, Harlan y de Wet (1971) (citados por Haghighi, 1987; Waines, Manshardt, Wells, 1988), tomando como base la afinidad reproductiva, clasificaron a las especies en reservorio o acervo primario, secundario y terciario de genes. En el genero Phaseolus las especies de poblaciones domesticadas y silvestres que se pueden hibridizar libremente con Phaseolus vulgaris sin ning(m inconveniente, pertenecen al acervo primario. El reservono secundario incluye al Phaseolus coccineus, donde la transferencia de geneses posible pero con dificultades. Finalmente, el Phaseolus lunatus y el Phaseolus acutifolius se encuentran dentro del reservorio terciario, donde se dificulta a(m mas el flujo libre de genes para obtener hibridos entre estas especies y donde los hibridos pueden ser letales o esteriles (Haghighi, 1987; Andrade-Aguilar y Jackson, 1988; Waines, Manshardt y Wells, 1988). El problema que se presenta en la hibridaci6n interespecifica entre Pv y Pa es el aborto prematuro de los embriones que ocurre normalmente entre los tres y 24 dias despues de la polinizaci6n artificial. Retrasos en la divisi6n de las celulas del endosperma y del embri6n pueden ser las causas del aborto y consecuentemente del desprendimiento de la vaina (Honma, 1956; Al-Yasiri y Coyne, 1966; Smart, 1970; Mok, Mok y Rabakoarihanta, 1978; Rabakoarihanta, Mok y Mok, 1979; Thomas y Waines, 1984; Andrade- Aguilar y Jackson, 1988; Young, Alan y Rosas, 1988; Ortega, 1992). El exito en Ia hibridaci6n interespecifica entre Pv y Pa depende de varios factores, entre ellos Ia tecnica de polinizaci6n utilizada, las condiciones de crecimiento en cuanto a temperatura y humedad relativa, y las especies y genotipos utilizados como planta 7 femenina o masculina (Smart, 1970; Thomas y Waines, 1984; CIAT, 1980; Andrade­ Aguilar y Jackson, 1988; Pratt, Bressan, Hasegawa, 1985). Se han encontrado diferencias en la eficiencia del prendimiento de cruces reciprocos interespecificos entre el frijol com(m y el frijol tepari. Honma (1956), Al­ Yasiri y Coyne (1966), Smartt (1970), Mok, Mok y Rabakoarihanta (1978) y Andrade­ Aguilar y Jackson (1988), indican que, en general, el P. vulgaris tiene mayor exito de prendimiento como planta femenina comparado con el P. acutifolius; esto se debe, principalmente, a que las partes florales del P. acutifolius son mas pequeiias y delicadas, lo cua1 dificulta su manipulaci6n (Strand, 1942). Sin embargo, Thomas y Waines (1984) informaron que no hay diferencias reciprocas en la hibridaci6n interespecifica entre P. vulgaris y P. acutifo/ius. Pratt, Bressan y Hasegawa (1985) indicaron que en los programas de mejoramiento fitogenetico del frijol comUn, la mejor combinaci6n parental para obtener exitosamente hibridos interespecificos, es la utilizaci6n de plantas heterocigotas resultado de diversos cruces intraespecificos, tanto para el P. vulgaris como en el P. acutifolius. E. Rescate de embriones Los embriones hibridos interespecificos provenientes de cruzas entre P. vulgaris y P. acutifolius, generalmente cesan su crecimiento antes de llegar a su madurez (Sabja, Mok y Mok, 1990). El uso de tecnicas in vitro a traves del cultivo de embriones es requerida para la obtenci6n de plantas hibridas interespecificas (Pratt, Bressan y Hasegawa, 1985; Young, Alan y Rosas, 1988). 8 El primer cruce interespecifico entre P. vulgaris y P. acutifolius utilizando medio de cultivo artificial fue hecho por Honma (1955) (citado por Waines, Manshardt y Wells, 1988). Honma (1956), Smart (1970), Mok, Mok y Rabakoarihanta (1978), Rabakoarihanta, Mok y Mok (1979), CIAT (1980), Thomas y Waines (1984), Pratt, Bressan y Hasegawa (1985), Haghighi (1987), Andrade-Aguilar y Jackson (1988), Haghighi y Ascher (1988), Waines, Manshardt y Wells (1988), Young, Ahin y Rosas (1988) Sabja, Mok y Mok (1990) y Ortega (1992) obtubieron embriones hibridos provenientes de cruzas interespecificas entre P. vulgaris y P. acutifolius con distinto exito, despues de utilizar el cultivo in vitro. Pratt, Bressan y Hasegawa (1985) y Waines, Manshardt y Wells (1988) informaron que el crecimiento de los embriones hibridos entre Pv y Pay de las phintulas F 1 esta determinado por el progenitor femenino utilizado. Nestling y Morris (1979) (citados por Sabja, Mok y Mok, 1990) indican que las bases fisiol6gicas para Ia obtenci6n de hibridos entre Pv y Pa todavia no se conocen. Igualmente, informan que posiblemente existe un desbalance en Ia biosintesis y metabolismo hormonal de los embriones ya que estos contienen menor cantidad de citocininas extraibles comparados con sus progenitores. Rabakoarihanta, Mok y Mok (1979) y Ortega (1992) informaron la cruza de varios genotipos de Pv y Pa, y utilizaron Ia tecnica del rescate de embriones para obtener hibridos F 1. Posteriormente, retrocruzaron las F 1 obtenidas de Ia cruza inicial con alguno de los progenitores. En esta fase no utilizaron el cultivo in vitro y obtuvieron poca o ninguna semilla. Concluyeron que, definitivamente, se debe utilizar Ia tecnica del rescate de embriones para obtener descendencia de Ia primera cruza y Ia primera retrocruza (F 1, RC 1 ). 9 AI-Y asiri y Coyne ( 1964) indicaron que con Ia ayuda de reguladores de crecimiento se puede retrasar Ia caida de las vainas y el aborto de los embriones, y, consecuentemente, se pueden obtener embriones hibridos de mayor tamaiio. Sabja, Mok y Mok (1990) informaron que los embriones hibridos de mayor tamafto cultivados in vitro, son los que tienen el mejor crecimiento durante su cultivo y permiten una mayor cantidad de plantulas transplantables. El exito en la supervivencia de los embriones hibridos depende de los requerimientos nutricionales, del medio de cultivo y de los genotipos utilizados. Por esta raz6n, se debe establecer un medio de cultivo 6ptimo para cultivarlos (Sabja, Mok y Mok, 1990; Ortega, 1992). F. Generaciones hibridas interespecificas Andrade-Aguilar y Jackson (1984), informaron que para que un programa de fitomejoramiento sea exitoso se requieren poblaciones grandes de hibridos F 1. Adicionalmente, Waines, Manshardt y Wells (1988) informaron que el potencial de obtenci6n de hibridos F 1 esta influido por el genotipo de P. vulgaris utilizado como planta femenina. Rabakoarihanta, Mok y Mok (1979); Thomas y Waines (1984) observaron que Ia generaci6n de la primera retrocruza (F 1 RC1) produce poca semilla. Por esta raz6n, concluyeron que en un programa de fitomejoramiento por lo menos diez plantas F 1 RC 1 son necesarias para trasferir caracteres a Ia poblaci6n F2 autofecundada. Pratt, Bressan y Hasegawa ( 1985) indican que el potencial para Ia obtenci6n de plantas F 1 RC1 esta controlado por el genotipo del hibrido interespecifico F 1 y no por el padre recurrente. 10 Haghighi y Ascher (1988) indican que las retrocruzas recurrentes, que consisten en retrocruzar los hibridos hacia uno de los progenitores, son ineficientes ya que retrasan el tiempo en que las caracteristicas deseables de los padres (como el niunero de semillas por vaina) se mantienen en la descendencia. Por otro lado, Pratt, Bressan y Hasegawa (1985) informaron que las retrocruzas congruentes, que consisten en retrocruzar los hibridos con cada padre en forma altemada, pueden ser una soluci6n a los problemas en la obtenci6n de generaciones avanzadas de hibridos interespecificos, debido a que en la quinta o sexta generaci6n las plantas F 1 RC 1 producen un niunero de semillas por vaina, similar al de los progenitores. Coyne ( 1964 ), Al-Y asiri y Coyne ( 1966) sugieren que el uso de una tercera especie como "puente" es una altemativa para obtener hibridos interespecificos entre Phaseolus vulgaris y Phaesolus acutifolius. El Phaseolus coccineus, por tener afinidad reproductiva con ambas especies, es una buena opci6n para servir como puente. Sin embargo, Pratt, Bressan y Hasegawa (1985) indican que la utilizaci6n del P. coccineus es muy complicada y que el uso de diversos genotipos del reservorio primario de genes como progenitores, es una mejor altemativa para recuperar caracteristicas deseables entre el frijol comim y el frijol tepari. Se ha intentado producir alotetraploides usando colchicina para duplicar los cromosomas ( colchiploides) y asi mantener la fertilidad de los hibridos entre P. vulgaris y P. acutifolius, para aumentar la fertilidad del polen (Hucl y Scoles, 1985) e incrementar el numero de vainas en comparaci6n con los hibridos diploides (Thomas y Waines, 1984). Waines, Manshardt y Wells (1988) indicaron que es conveniente realizar un mapeo cromos6mico en los hibridos interespecificos para comprobar Ia existencia o ausencia de recombinaci6n genetica. De igual manera, otros investigadores utilizaron 11 otras tecnicas para comprobar el intercambio de genes en Ia descendencia. Pratt, Bressan y Hasegawa ( 1985) utilizaron aruilisis de proteinas en Ia semilla. Haghighi ( 1987) y Haghighi y Ascher (1988) utilizaron electroforesis basandose en los patrones de peroxidasa de los tejidos de Ia raiz para verificar hibridos interespecificos F1 y Ia primera retrocruza RCl. G. Fertilidad de las generaciones hibridas interespecfficas Andrade-Aguilar y Jackson (1984) informaron que los hibridos F 1 pueden ser esteriles o parcialmente fertiles y que estan influidos por el genotipo de P. vulgaris utilizado como planta femenina. Thomas y Waines (1984); Pratt, Bressan y Hasegawa (1985) informaron que Ia fertilidad de los F 1 es variable y que fluctita entre 0% y 38%. Rabakoarihanta, Mok y Mok (1980) indican que la primera retrocruza (F 1 RC1) es normalmente esteril o parcialmente esteril. Adicionalmente, Thomas y Waines (1984) informan que la viabilidad del polen puede variar entre 0% y 49%. Pratt, Bressan y Hasegawa ( 1985) informaron que en generaciones posteriores de retrocruzas (F 1 RC2 y F 1 RC3) y autopolinizaciones F2 se incrementa Ia fertilidad. Pratt, Bressan y Hasegawa (1985) inforrnaron que Ia fertilidad de las plantas F 1 RC 1 esta controlada por el hibrido Fly no por la especie con la cual se cruza. Haghighi y Ascher ( 1988) indican que existe una relaci6n entre la fertilidad de los hibridos y el nfunero de semillas por vaina, que son importantes para evaluar las siguientes generaciones. m. MATERIALES Y METODOS A. Localizacion El estudio se realiz6 en el Departamento de Agronomia de la Escuela Agricola Panamericana (EAP), en el valle del rio Yeguare, Zamorano, Departamento de Francisco Morazan, Honduras. Las cruzas se efectuaron en tres invemaderos y una casa de malla del Programa de Investigaciones en Frijol (PIF), y las pruebas de viabilidad del polen y el rescate de embriones en el Laboratorio de Biotecnologia del Departamento de Agronomia. B. Material Genetico para Ia Obtencion de Hibridos Fl Los materiales de Phaseolus vulgaris (Pv) y Phaseo/us acutifolius (Pa) (Cuadro 1) que se usaron son los mas utilizados en programas de mejoramiento de la EAP ya que han presentado las mejores caracteristicas agron6micas y morfol6gicas en ensayos previos (Young, Alan y Rosas, 1988; Ortega, 1992). Algunas lineas de P. acutifolius fueron recolectadas por el proyecto colaborativo entre el Consejo Intemacional de Recursos Fitogeneticos (IBPGR, siglas en ingles) y Ia EAP, y otras lineas fueron donadas por el Dr. Peter Ascher de la Universidad de Minnesota, EE.UU. y el Dr. George Freytag, anterior genetista de Ia Estaci6n de Investigaci6n de Agricultura Tropical (TARS, siglas en ingles) en Puerto Rico. Los genotipos de Pv se enumeraron del 1 al4 y los de Pa del5 al8 (Cuadro 1). 13 Cuadro 1. Genotipos utilizados para Ia obtencion de hibridos interespecificos entre Phaseolus vulgaris y Phaseolus acutifolius. P. vulgaris: DOR364 (1) z P. acutifolius: 89F-50-18 (5) DOR391 (2) 89F-50-19 (6) DOR482 (3) A-80-10 (7) DANLI 46(4) F-0078 (8) ------ z Los nfuneros entre parentesis indican Ia identificaci6n del genotipo 1. Caracteristicas de los Genotipos a. Phaseolus vulgaris a. La variedad comercial DOR 364 es de alto rendimiento y tiene resistencia al virus del mosaico com(m y es tolerante al virus del mosaico dorado. b. La linea mejorada DOR 391 y Ia variedad OOR 482 son de alto rendimiento y tienen resistencia al virus del mosaico dorado y mosaico com\m. c. La variedad comercial DANLI 46 es cultivada en muchas regiones de Honduras. b. Phaseolus acutifolius a. Las lineas 89F-50-18 y 89F-50-19, se consideran excelentes fuentes de resistencia aXcp y son tolerantes al estres hidrico. b. La linea A-80-1 0 tiene buena adaptaci6n y rendimiento, es tolerante a Ia sequia y a Xcp. Ha sido utilizada para varios trabajos de cruces interespecificos con Pv en el Departamento de Agronomia de Ia EAP. c. La linea F0078, fue colectada en Ia zona sur de Honduras por el Proyecto ffiPGRIEAP. Presenta buen grado de adaptaci6n local, es tolerante ala sequia y resistente aXanthomonas campestris pv. phaseoli (Xcp). 14 C. Material Genetico del Programs de Investigaciones en Frijol Se continuo con las retrocruzas congruentes de materiales F2 de que disponia el Programa de Investigaciones en Frijol (PIF). La obtenci6n de los materiales utilizados en el estudio se describen en los procedimientos siguientes: Para obtener el material hibrido interespecifico 92-11 (RC2) se cruz6 inicialmente el progenitor DANLI 46 (P. vulgaris}, con A-80-10 (P. acutifolius) como planta masculina; de dicha cruza se produjo el hibrido Fl (CD-11) el cual se retrocruz6 con el progenitor A-80-10 (P. acutifolius) para producir individuos de primera retrocruza 92-Il (RCl). Posteriormente, la 92-11 (RCl) se retrocruz6 con el progenitor DANLI 46 (P. vulgaris) produciendose individuos de segunda retrocruza 92-11 (RC2) y estos se autofecundaron y produjeron 8 semillas F2. Este procedimiento para obtener el hibrido 92-11 (RC2) se resume de la manera siguiente: 92-11 (RC2) DANLI 46 (Pv) x A-80-10 (Pa) ""' A-80-10 (Pa) x CD-11 (F1) ~ DANLI 46 (Pv) x 92-11 (RC 1) ~ 92-11 (RC2) ~ Autofecundaci6n ~ F2 (8 semillas) 15 El procedimiento para obtener el hfbrido interespecffico 92-17 A (RC2) y 92-178 (RC2) fue similar al 92-Il (RC2). La diferencia fue que se utilizaron genotipos distintos al del progenitor P. vulgaris original cuando se retrocruz6 el 92-17 A(RCl) y 92-IB (RCl), este fue DOR 391. 92-17 A (RC2) DANLI 46 (Pv) x A-80-10 (Pa) -1- A-80-10 (Pa) x CD-11 (Fl) -1- 92-178 (RC2) DANLI 46 (Pv) x A-80-10 (Pa) -1- A-80-10 (Pa) x CD-11 (F1) -1- DOR 391 (Pv) x 92-17 A(RCl) -1- DOR 391 (Pv) x 92-17 B(RC1) -1- 92-I7A (RC2) -1- Autofecundaci6n ..V F2 (71 semillas) 92-I7B (RC2) -1- Autofecundaci6n ..V F2 ( 5 semillas) Para obtener el hfbrido interespecifico 92-14 (RCl) se autofecund6 inmediatamente despues de obtenida Ia RCl para aumentar el nfunero de semillas disponibles. El siguiente esquema describe el procedimiento. 92-14