Escuela Agrícola Panamericana, Zamorano Departamento de Ciencia y Producción Agropecuaria Ingeniería Agronómica Proyecto Especial de Graduación Estimación de costos de producción de micropropagación a partir de meristemos de la orquídea Rhyncholaelia digbyana (Lindl.) Schltr. Estudiante Isabella Dennisse Viteri García Asesoras Cinthya Martínez, MAE. María Alexandra Bravo, M. Sc. Honduras, julio de 2022 2 Autoridades TANYA MÜLLER GARCÍA Rectora ANA M. MAIER ACOSTA Vicepresidenta y Decana Académica CELIA O. TREJO RAMOS Directora del Departamento de Ciencia y Producción Agropecuaria HUGO ZAVALA MEMBREÑO Secretario General 3 Contenido Índice de Cuadros.................................................................................................................................... 5 Índice de Figuras ..................................................................................................................................... 6 Índice de Anexos ..................................................................................................................................... 7 Resumen ................................................................................................................................................. 8 Abstract ................................................................................................................................................... 9 Introducción .......................................................................................................................................... 10 Materiales y Métodos ........................................................................................................................... 14 Fuente de Material Vegetal .................................................................................................................. 14 Extracción y Desinfección de Meristemos / Preparación ..................................................................... 14 Medio de Cultivo: Etapa I - Establecimiento ......................................................................................... 16 Medio de Cultivo: Etapa II - Multiplicación ........................................................................................... 17 Medio de Cultivo: Etapa III - Enraizamiento ......................................................................................... 18 Incubación de Meristemos ................................................................................................................... 19 Etapa de Aclimatación .......................................................................................................................... 19 Estimación de Costos ............................................................................................................................ 20 Resultados y Discusión .......................................................................................................................... 21 Conclusiones ......................................................................................................................................... 27 Recomendaciones ................................................................................................................................. 28 4 Referencias ............................................................................................................................................ 29 Anexos ................................................................................................................................................... 32 5 Índice de Cuadros Cuadro 1 Medio de cultivo de Murashige y Skoog para la Etapa I (Establecimiento) in vitro de meristemas de Rhyncholaelia digbyana ............................................................................................... 17 Cuadro 2 Medio de cultivo de Murashige y Skoog para la Etapa II (Multiplicación) in vitro de meristemas de Rhyncholaelia digbyana. .............................................................................................. 18 Cuadro 3 Medio de cultivo de Murashige y Skoog para la Etapa III (Enraizamiento) in vitro de Rhyncholaelia digbyana ........................................................................................................................ 18 Cuadro 4 Ciclo de producción para Rhyncholaelia digbyana ............................................................... 21 Cuadro 5 Costos del medio de cultivo de Murashige y Skoog para la Etapa I (Establecimiento) in vitro de Rhyncholaelia digbyana expresado en dólares ............................................................................... 22 Cuadro 6 Costos del medio de cultivo de Murashige y Skoog para la Etapa II (Multiplicación) in vitro de Rhyncholaelia digbyana expresado en dólares ............................................................................... 23 Cuadro 7 Costos del medio de cultivo de Murashige y Skoog para la Etapa III (Enraizamiento) in vitro de Rhyncholaelia digbyana expresado en dólares ............................................................................... 24 Cuadro 8 Costos y depreciación anual del equipo utilizado para las Etapas I, II y III de la siembra de la Rhyncholaelia digbyana expresado en dólares .................................................................................... 25 Cuadro 9 Costo total en la realización de cada una de las etapas de propagación expresado en dólares .............................................................................................................................................................. 25 6 Índice de Figuras Figura 1 Planta madre de Rhyncholaelia digbyana en el Orquideario de Zamorano Jorge Bueso Arias. .............................................................................................................................................................. 14 Figura 2 Brotes extraídos de la planta madre de Rhyncholaelia digbyana. ......................................... 15 Figura 3 Meristemo de Rhyncholaelia digbyana.................................................................................. 16 Figura 4 Meristemo de Rhyncholaelia digbyana a los 29 días desde el Establecimiento .................... 23 7 Índice de Anexos Anexo A Costo total en la realización de cada una de las etapas de propagación expresado en dólares .............................................................................................................................................................. 32 8 Resumen Las orquídeas son reconocidas por sus extraordinarias flores de formas y colores muy variados, siendo de las especies botánicas más numerosas que existen en el mundo. Una de ellas es la flor nacional de Honduras, Rhyncholaelia digbyana (Lindl.) Schltr., esta y muchas otras más orquídeas están en peligro de extinción, debido a las malas prácticas humanas que destruyen su hábitat. Actualmente, esta planta no es producida de manera comercial, por eso se usan varias técnicas de reproducción, como la micropropagación, para así tener un elevado número de plantas homogéneas y de una muy alta calidad fitosanitaria en un laboratorio, llevando estas plantas al mercado. El establecimiento a través de los meristemos ha sido usado en la iniciación de los cultivos in vitro para obtener plantas sanas y libres de patógenos, sin embargo, todas estas técnicas representan elevados costos de producción, no siendo beneficioso para su comercialización. Por eso es importante entender una estimación de costos, así como su comportamiento. Para que la producción de estas plantas sea rentable se debe conocer los costos de los insumos, la mano de obra y la energía a utilizar que se usan en todo el proceso de propagación. Los objetivos de este estudio fueron establecer in vitro meristemos de Rhyncholaelia digbyana; y, estimar los costos de la producción de plantas in vitro de Rhyncholaelia digbyana a partir de meristemos. El costo directo de producción por plántula estimado fue de $1.60, producida en un ciclo de 14 meses. Palabras clave: meristemos, epífitas, extinción, orquídeas, propagación. 9 Abstract Orchids are recognized for their extraordinary flowers of very varied shapes and colors, being one of the most numerous botanical species that exist in the world. One of them is the national flower of Honduras, Rhyncholaelia digbyana, this and many other orchids are in danger of extinction, due to bad human practices that destroy their habitat. Currently, this plant is not produced commercially, which is why various reproduction techniques are used, such as micropropagation, to have many homogeneous plants of very high phytosanitary quality in a laboratory, bringing these plants to market. The establishment through the meristems has been used in the initiation of in vitro cultures to obtain healthy and pathogen-free plants, since they provide permanent plant growth, however, all these techniques represent high production costs, not being beneficial for marketing. That is why it is important to understand a cost estimate, as well as its behavior, for these plants to be profitable, the costs of the inputs, the labor, and the energy to be used that are involved in the entire propagation process must be known. The objectives of this study were to establish in vitro meristems of Rhyncholaelia digbyana; and, to estimate the costs of the production of in vitro plants of Rhyncholaelia digbyana from meristems. Giving an estimated direct cost of production per seedling was $1.60, produced in a 14-month cycle. Keywords: meristems, epiphytes, extinction, orchids, propagation. 10 Introducción Las orquídeas son reconocidas por sus extraordinarias flores de formas y colores muy variadas. Estas plantas pertenecen a la familia botánica Orchidaceae, que contiene entre 25 y 30 mil especies, se pueden encontrar por todo el mundo, pero son abundantes en regiones tropicales o cálido- húmedas (Menchaca García 2011). El uso más popular de las orquídeas es en el ámbito estético, para así embellecer los espacios, por el interés y armonía que provoca Tejeda-Sartorious et al. 2017). Las orquídeas constituyen una de las familias de plantas que son reconocidas fácilmente por sus flores grandes, bellas y exóticas (Sedano et al. 2015). Las orquídeas tienen diferentes hábitos de crecimiento, de forma terrestre o epífitas, esta últimas siendo la más conocida, alcanzan su mayor diversidad y abundancia en los bosques nubosos tropicales (Cascante-Marín y Trejos Hernández 2019). Son plantas muy adaptables, pero se destacan por depender de hongos, algunos micorrícicos, para su germinación (Chavez et al. 2014). A nivel mundial, con la destrucción del hábitat y el cambio global, la recolección de varias especies para la horticultura, alimento o medicina representa una de las principales amenazas para la supervivencia de algunos grupos más destacados de orquídeas (Fay 2018). Las orquídeas se pueden reproducir por propagación sexual y asexual. En la propagación sexual es usada la germinación por semillas, estas realizan una función simbiótica, para que así los organismos se beneficien mutuamente sin afectar al otro, sin embargo, tiene en contra factores climáticos, el suelo y la competencia entre especies (Menchaca García 2011). En la propagación asexual casi siempre la nueva planta es genéticamente idéntica al progenitor, esto a través de la separación de partes vegetativas (Osuna Fernández H et al. 2016). Esto consiste en la separación de un fragmento de la planta que se desea multiplicar y conseguir que a partir de ese fragmento se desarrolle un individuo nuevo (Osuna Fernández H et al. 2016). Uno de los métodos más utilizados para obtener plantas libres de patógenos, es a través de la propagación in vitro usando meristemas, con esta técnica se logra la propagación masiva de plantas sanas y libres de enfermedades (Solis et al. 2011). Esta forma de cultivar las plantas tiene dos 11 características fundamentales: la asepsia (ausencia de gérmenes) y las condiciones controladas (temperatura, humedad relativa, luz y medio de cultivo). Los dos principales problemas que presenta la micropropagación son la contaminación con microorganismos y la oxidación del explante (Bolaños Campollo 2017). La presencia de microrganismos en los cultivos in vitro reduce el éxito de los resultados, en especial durante las primeras etapas de propagación (Afanador Pérez 2005). Los explantes suelen sufrir situaciones de estrés, ocasionadas por daños mecánicos o por las condiciones del cultivo in vitro, por ejemplo la preparación de los explantes y los cortes previos que hay que realizar y también los componentes del medio de cultivo, esto producirá una síntesis de fenoles causando hipersensibilidad, dando origen a la oxidación de fenoles que son tóxicos para los explantes (Afanador Pérez 2005). La micropropagación ofrece una serie de ventajas sobre la propagación convencional, como la posibilidad de producir un elevado número de plantas homogéneas y de una muy alta calidad fitosanitaria, en un menor lapso y en espacios reducidos. El cultivo se incuba bajo condiciones adecuadas de luz, temperatura, humedad y que junto con las físico químicos y nutricionales conducen al desarrollo del explante (Calva y Pérez 2005). Los meristemos no suelen usarse de manera tan frecuente, por su difícil extracción y baja sobrevivencia, pero son conocidos por ser un grupo de células que al dividirse dan origen a una célula hija que continúa siendo meristemática y otra que se diferencia (Bolaños Campollo 2017). El establecimiento de meristemos ha sido usado en la iniciación de los cultivos in vitro para obtener plantas sanas y libres de patógenos (García-Águila et al. 2001). Una vez obtenidos los meristemos se proceden a la siembra en un medio de cultivo, con el cual se busca el crecimiento y regeneración de estos mediante el aporte de nutrientes (Afanador Pérez 2005). La Rhyncholaelia digbyana (Lindl.) Schltr., es la flor nacional de Honduras desde 1969, su presencia en bosques y zonas montañosas ha disminuido, debido a la extracción indiscriminada de las plantas adultas que posteriormente son comercializadas ilegalmente, de igual forma por la destrucción acelerada de los bosques (Salgado Moncada 2002). La Convención sobre el Comercio 12 Internacional de Especies Amenazadas de Fauna y Flora Silvestres (CITES) se redactó como resultado de una reunión de los miembros de la UICN, celebrada en 1963 con la finalidad de velar por que el comercio internacional de animales y plantas silvestres no constituya una amenaza para la supervivencia de las especies, existen tres apéndices en que son colocadas las especies, dependiendo del grado de riesgo y peligro de extinción. La Rhyncholaelia digbyana está en el apéndice II, no es altamente amenazada, pero podría estarlo si no se toman las medidas necesarias a tiempo (Salgado Moncada 2002). La Rhyncholaelia digbyana es una planta compacta de tamaño mediano, tiene una fragancia nocturna muy parecida a los cítricos (Silva Sanchez 2020). La amenaza de esta y casi todas las orquídeas, es la que actualmente enfrentan todos los seres vivientes: el calentamiento global y las actividades humanas que destruyen su hábitat. En la actualidad es necesario aumentar las poblaciones de Rhyncholaelia digbyana para reinsertarlas en hábitats silvestres o permitir asegurar su conservación. El uso de técnicas de cultivo in vitro ofrece la posibilidad de acortar hasta en dos años el tiempo requerido para la floración de plántulas, teniendo así un óptimo enraizamiento y producciones masivas (Tejeda-Sartorious et al. 2017) a pesar de producir muchas plantas, la principal desventaja de la micropropagación es el elevado costo de producción, no siendo rentable en algunos casos, además, en algunos ejemplares es difícil la obtención de plantas madres de las cuáles se extraiga explantes, sin embargo las investigaciones avanzan en algunas especies de interés económico (Espinoza 2020). Entender una estimación de costos, así como su comportamiento, permite llevar a cabo una mejor estimación a futuro de los mismos, logrando establecer prioridades y conseguir una eficiente asignación y control de los recursos, evitando así costos innecesarios (Lambretón 2015). Los puntos principales para hacer una diferenciación de costos se dividen en las siguientes categorías: inversiones y reemplazo periódico, costos de producción (suele variar por la escala de manufactura) y, los costos o gastos generales, estos no suelen variar por los cambios en la magnitud de la producción (FAO 2005). Una estimación de costos se realiza para poder analizar, controlar y poder asignar valores correctamente a los procesos y actividades que se realizan en la fabricación de algún producto o 13 emprendimiento. Va más allá de determinar el costo de algo sino de una comprensión de factores como la calidad, el ciclo de vida de los productos, innovaciones tecnológicas y sistemas productivos (Lambretón 2015). Uno de los principales actores es la depreciación, se presenta como un costo indirecto, se caracteriza por la recuperación del capital invertido en bienes de producción y por determinar con seguridad costos de producción para llevar un correcto registro de costos (FAO 1998). Además, se debe resaltar que a nivel nacional no se produce de manera comercial la Rhyncholaelia digbyana, en la Escuela Agrícola Panamericana Zamorano se han hecho investigaciones para reproducir in vitro esta planta, pero a través de germinación por semillas y no por meristemos. Por esa razón no hay costos estimados para la producción de Rhyncholaelia digbyana a partir de este explante. Los objetivos de este estudio fueron establecer in vitro meristemos de Rhyncholaelia digbyana; y, estimar los costos de la producción de plantas in vitro de Rhyncholaelia digbyana a partir de meristemos. 14 Materiales y Métodos La investigación se realizó en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos en la Escuela Agrícola Panamericana, Zamorano, ubicada en el valle del río Yegüare a 30 km de Tegucigalpa, Municipio de San Antonio Oriente, Francisco Morazán, Honduras. Fuente de Material Vegetal El material se obtuvo de la colección de orquídeas del Orquideario de Zamorano Jorge Bueso Arias y de plantas madre del laboratorio de Cultivo de Tejidos de Zamorano (Figura 1). Figura 1 Planta madre de Rhyncholaelia digbyana en el Orquideario de Zamorano Jorge Bueso Arias. Extracción y Desinfección de Meristemos / Preparación Previo a la extracción de los meristemos de la Rhyncholaelia digbyana las plantas fueron aplicadas con el funguicida sistémico PREVALOR®84 SL, su ingrediente activo es el fosetyl + propamocarb, la dosis recomendada para aplicaciones foliares es de 1.5 - 2 L/ha (Bayer CropScience AG 2011). Se realizaron dos aplicaciones y cinco días después de la última aplicación se extrajeron los brotes. Se seleccionaron 10 brotes asegurándose que no estén inducidos a floración, sin daño mecánico, que no hubiera presencia de plagas o enfermedades (Figura 2). Fueron cortados con la 15 ayuda de un bisturí desinfectado para evitar cualquier tipo de contaminación, los cortes se realizaron lo más cerca de la base y colocándolos en papel toalla mientras se trasladaron de los invernaderos al laboratorio de cultivo de tejidos. Figura 2 Brotes extraídos de la planta madre de Rhyncholaelia digbyana. Después de tener los brotes, se realizó el proceso de desinfección que constó de los siguientes pasos: 1. Lavar con agua potable y jabón. 2. Sumergir alcohol 70% por 10 segundos. 3. Sumergir en cloro 10% v/v, más Tween80 por 15 segundos. 4. Lavar con agua destilada estéril dentro de la cámara de flujo laminar. La extracción de los meristemas se realizó dentro de la cámara de flujo laminar, con herramientas desinfectadas previamente con alcohol al 70% y papel toalla y colocadas posteriormente en el esterilizador de calor seco a 350°C por 30 segundos. Una vez frías las herramientas se retiraron las primeras capas de brotes con la ayuda de las pinzas y bisturí, cortando el tejido sobrante que se encontraba en la parte de arriba, dejando expuesto el meristemo, con una medida aproximada de 2 mm de altura y 1 mm de grosor (Figura 3). 16 Figura 3 Meristemo de Rhyncholaelia digbyana Según la etapa de micropropagación se utilizan medios de cultivo diferentes. Las etapas para la micropropagación de Rhyncholaelia digbyana son las siguientes: Etapa I - Establecimiento del cultivo: el explante se transfiere al medio de cultivo para la formación de callos y la generación de nuevos brotes. Etapa II - Multiplicación de brotes: el propágulo germinado se multiplica, seguido de la proliferación de brotes axilares para la estabilidad genética. Las citoquininas se utilizan en mayor cantidad para superar la dominancia apical en este paso. Etapa III - Enraizamiento del brote: cuando se desarrollan los brotes, se transfieren al medio de enraizamiento para la formación de raíces adventicias. Etapa IV - Aclimatación de las plántulas: al ya tener un crecimiento de raíces las plántulas se pasan de las bandejas a maceteros con huecos en la parte inferior para ayudar a la aireación, en esta etapa después de realizar un manejo adecuado de sustratos, fertilizantes y fungicidas se puede comercializar finalmente. Medio de Cultivo: Etapa I - Establecimiento Para esta etapa se utilizó el medio de cultivo de Murashige y Skoog (Cuadro 1). El pH del medio se ajustó a 5.8, y para solidificarlo se usó Phytagel® 1.8 g/L. 17 Cuadro 1 Medio de cultivo de Murashige y Skoog para la Etapa I (Establecimiento) in vitro de meristemas de Rhyncholaelia digbyana Componente Unidad Cantidad usada en 1L Macroelementos MS (10X) mL 100.00 FeNaEDTA mg 50.00 Microelementos MS (1000X) mL 1.00 Inositol g 0.10 Ácido nicotínico mg 0.01 Cisteína mg 10.00 Biotina mg 0.0001 Pantoneato mg 0.01 Sulfato de adenina mg 5.00 Caseína hidrolizada mg 1.00 Tiamina mg 0.10 Piridoxina mg 0.10 Ácido naftalenacético mg 1.50 Sacarosa g 30.00 El medio de cultivo fue colocado en frascos de vidrio y sellados con papel aluminio, finalmente se esterilizó en autoclave por 20 minutos, con una presión de 1.1 kg/cm2 y una temperatura de 120°C. Cuando los meristemos alcanzaron una altura de 4 cm, se trasladaron al nuevo medio de cultivo para realizar la segunda etapa (multiplicación). Medio de Cultivo: Etapa II - Multiplicación En el Cuadro 2 se muestra el medio de cultivo utilizado, para esta etapa se aumentó la cantidad de citoquininas, para superar la dominancia apical en este paso. El pH del medio se ajustó hasta llegar a 5.8 y para solidificarlo se usó 1.8 gramos de Phytagel®. 18 Cuadro 2 Medio de cultivo de Murashige y Skoog para la Etapa II (Multiplicación) in vitro de meristemas de Rhyncholaelia digbyana. Componente Unidad Cantidad usada en 1L Macroelementos MS (10X) mL 100.00 FeNaEDTA (200X) mL 5.00 Microelementos MS (1000X) mL 1.00 Inositol g 0.10 Tiamina mg 0.50 Ácido nicotínico mg 0.50 Piridoxina mg 0.50 Glicina mg 2.00 6-Bencilaminopurina mg 0.01 Ácido indol-3-acético mg 0.10 Sacarosa g 30.00 Posteriormente, se retiraron los brotes del medio de cultivo de la Etapa de Establecimiento y se trasladaron a este medio de cultivo, para proceder a la multiplicación de cada uno de estos, para su crecimiento. Las plantas al estar sanas continuaron avanzando en el proceso de micropropagación. Medio de Cultivo: Etapa III - Enraizamiento Al desarrollar los brotes, se transfirieron al medio de enraizamiento para la formación de raíces adventicias, en esa formulación se reducen las citoquininas y se aumenta auxinas como el ácido naftalenacético (Cuadro 3). Se ajustó el pH a 5.8 y para solidificarlo se usó 1.8 gramos de Phytagel®. Cuadro 3 Medio de cultivo de Murashige y Skoog para la Etapa III (Enraizamiento) in vitro de Rhyncholaelia digbyana Componente Unidad Cantidad usada en 1L Macroelementos MS (10X) mL 100.00 FeNaEDTA (200X) mL 5.00 Microelementos MS (1000X) mL 1.00 Inositol g 0.10 Tiamina mg 0.40 Ácido nicotínico mg 0.50 Piridoxina mg 0.50 6-Bencilaminopurina mg 0.10 Ácido naftalenacético mg 1.00 Sacarosa g 20.00 19 Incubación de Meristemos Los meristemos de Rhyncholaelia digbyana sembrados en los frascos permanecieron en el cuarto de crecimiento I, el cual se encuentra con una humedad relativa entre un 30%, temperatura de 22 a 24°C, 16 horas de luz a 4,000 lux y una radiación fotosintéticamente activa (PAR) de 40 µm/m2/s. Una vez que las plantas salen del laboratorio continúan con la etapa de aclimatación. Esta etapa no se llevó a cabo por razones de tiempo, pero los costos fueron estimados, mediante revisión de literatura y ayuda de técnicos del laboratorio de cultivo de tejidos y la unidad de Propagación de plantas. Etapa de Aclimatación Este es el proceso de traspaso de las plantas del Laboratorio de Cultivo de Tejidos al invernadero, las vitro plántulas se colocan en bandejas plásticas de 50 alveolos, las bandejas deber ser previamente desinfectadas sumergiéndolas en una solución de cloro a 0.20 g/L. Se utiliza un sustrato formulado para producción de orquídeas Orchid Bark ¼” - ¾”, el cual permite una mejor retención de agua y nutrientes y un mejor desarrollo radicular para la plántula en esta etapa. Las bandejas permanecen en el invernadero a 80% de sombra, con una Humedad Relativa arriba de 85% y una temperatura promedio de 24°C. EL invernadero cuenta con un sistema de ventilación, y está cubierto por malla sarán, 80%. El sistema de riego a utilizar es de nebulización, en el cual se expulsa agua en forma de neblina, a través de emisores colocados en la parte superior de los cultivos, el cual además de suministrar agua contribuye a disminuir temperatura y elevar el nivel de humedad relativa en el interior de los invernaderos. Para completar el proceso, las plántulas ya adaptadas, son llevadas al área de crecimiento, es decir pasan a otro invernadero donde son trasplantadas a maceteras de mayor tamaño, y con perforaciones pequeñas en la parte inferior para su aireación, se utiliza el sustrato Orchid Bark ¼” – ¾”. En esta etapa las plantas se fertilizan con Triple 20 o Vitafol 10–40-10, para favorecer su crecimiento y aplicar de 2 - 3 tratamientos con intervalos de 12 - 14 días en pulverización foliar 20 mojando abundantemente. Las aplicaciones recomendadas de fungicidas para prevención y control de hongos. Estimación de Costos Para obtener los costos de producción, se estimaron y se asignaron según las cantidades de insumos utilizados y la mano de obra usada en la producción. Se recolectó información por medio de visitas al laboratorio, registros contables y personas expertas del laboratorio para llevar a cabo la producción del cultivo in vitro de la Rhyncholaelia digbyana. Para el cálculo de la depreciación de los equipos e implementos que se encuentran en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos, se usó la depreciación en línea recta, al ser la más simple en aplicación y el método más usado frecuentemente. (FAO 1998). Este cálculo se hizo mediante la fórmula para calcular la Depreciación en Línea Recta (DLR) descrita a continuación: 𝐷𝐿𝑅 = 𝐶𝑜𝑠𝑡𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑜 𝑉𝑖𝑑𝑎 ú𝑡𝑖𝑙 𝑑𝑒𝑙 𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑜 [1] Sin embargo, para esta estimación solo se incluyeron los costos directos, no se incluyó esta depreciación, debido al desconocimiento de los costos actuales de cada uno de los equipos que se encuentran en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetal, y su depreciación en cada uno de los años de vida útil, pero se incluyó una depreciación en línea recta para observar así un costo aproximado de cada uno de estos y el aumento que podrían causar en el costo total de producción por plántula. 21 Resultados y Discusión Dentro de las tres primeras etapas de propagación de Rhyncholaelia digbyana se tuvo un 60% de sobrevivencia. Para evitar esto, es necesario tener un manejo fitosanitario de las plantas madre desde que están en el invernadero con un control previo, observando las plantas jóvenes que serán de ayuda para su multiplicación y con el uso de fungicidas que ayuden a contrarrestar enfermedades o contaminaciones al momento de extraer los brotes. De igual manera, en laboratorio, ya que pueden contaminarse los explantes al momento de siembra, por el error humano. El ciclo de producción para la micropropagación de Rhyncholaelia digbyana es de 14 meses (Cuadro 4), siendo la primera etapa la más larga debido al tiempo que necesita el explante de pasar de un medio ambiente diferente a adaptarse al medio de cultivo. Cuadro 4 Ciclo de producción para Rhyncholaelia digbyana Etapa Número de días Lugar Temperatura °C Humedad Relativa % Etapa I: Establecimiento 90 - 120 Cuarto de crecimiento I 22 – 24 40 – 70 Etapa II: Multiplicación 90 Cuarto de crecimiento I 22 – 24 40 – 70 Etapa III: Enraizamiento 90 Cuarto de crecimiento I 22 – 24 40 – 70 Etapa IV: Aclimatación 60 Invernadero 24 – 30 90 – 100 Área de Crecimiento 60 Invernadero 24 – 30 50 – 60 En el Cuadro 5, se puede observar el costo del medio de cultivo utilizado en la primera etapa, para el estudio se estimó la preparación de 1 litro de medio. Siendo el Phytagel® el componente más costoso, este componente se usa para solidificar los medios y dar soporte a los explantes. 22 Cuadro 5 Costos del medio de cultivo de Murashige y Skoog para la Etapa I (Establecimiento) in vitro de Rhyncholaelia digbyana expresado en dólares Componente Unidad Costo por unidad Cantidad por envase Cantidad usada en 1L Costo por litro Macroelementos MS (10X) mL 7.1 1000 100 0.71300 Microelementos MS (1000X) mL 26.6 500 1 0.05316 FeNaEDTA (200X) mL 47.7 1000 5 0.23850 Inositol g 85.1 1000 0.1 0.00851 Ácido nicotínico mg 21.5 5000 0.01 0.00004 Cisteína g 29.2 25 0.01 0.01168 Biotina mg 24.5 100 0.0001 0.00002 Pantotenato mg 18.4 100 0.01 0.00184 Sulfato de adenina mg 19.6 5000 5 0.01960 Caseína hidrolizada g 20.1 100 0.0001 0.00020 Tiamina mg 17.7 5000 0.1 0.00035 Piridoxina mg 65.8 5000 0.1 0.00132 Ácido naftalenacético g 32.6 25 0.0015 0.00196 Sacarosa g 46.8 5000 30 0.28080 Phytagel g 61.0 100 1.8 1.09800 Costo total 2.42898 En el Cuadro 6, se muestra el costo por unidad del medio de cultivo y el costo usado en 1 litro de para la multiplicación realizada en la segunda etapa de propagación de la Rhyncholaelia digbyana. Se puede observar una disminución del 5% en el costo por unidad de este medio de cultivo de la etapa de establecimiento, por la eliminación de los componentes: cisteína, biotina, pantoneato, sulfato de adenina, caseína hidrolizada y ácido naftalenacético. 23 Cuadro 6 Costos del medio de cultivo de Murashige y Skoog para la Etapa II (Multiplicación) in vitro de Rhyncholaelia digbyana expresado en dólares Componente Unidad Costo por unidad Cantidad por envase Cantidad usada en 1L Costo por litro Macroelementos MS (10X) mL 7.1 1000 100 0.71000 Microelementos MS (1000X) mL 26.6 500 1 0.05320 FeNaEDTA (200X) mL 47.7 1000 5 0.23850 Inositol g 85.1 1000 0.1 0.00851 Tiamina mg 17.7 5000 0.5 0.00177 Ácido nicotínico mg 21.5 5000 0.5 0.00215 Piridoxina mg 65.8 5000 0.5 0.00658 Glicina g 65.6 500 0.002 0.00026 6-Bencilaminopurina mg 20.8 100 0.01 0.00208 Ácido indol-3-acético mg 31.5 5000 0.1 0.00063 Sacarosa g 46.8 5000 30 0.28080 Phytagel g 61.0 100 1.8 1.09800 Costo total 2.402482 Al ya ir absorbiendo los diferentes nutrientes, los meristemos comienzan con el crecimiento y generación de brotes (Figura 4), alcanzando una altura de 4 mm. Figura 4 Meristemo de Rhyncholaelia digbyana a los 29 días desde el Establecimiento En el Cuadro 7, se presentan los costos por unidad y el costo usado por 1 litro de los componentes del medio de cultivo para la tercera etapa, el enraizamiento. Respecto al costo final de 24 este medio hubo una reducción del 1%, ya que solo se eliminó la glicina, y se incluyó el ácido naftalenacético. Cuadro 7 Costos del medio de cultivo de Murashige y Skoog para la Etapa III (Enraizamiento) in vitro de Rhyncholaelia digbyana expresado en dólares Componente Unidad Costo por unidad Cantidad por envase Cantidad usada en 1L Costo por litro Macroelementos MS (10X) mL 7.10 1000 100 0.71000 Microelementos MS (1000X) mL 26.60 500 1 0.05320 FeNaEDTA (200X) mL 47.70 1000 5 0.23850 Inositol g 85.10 1000 0.1 0.00851 Tiamina mg 17.70 5000 0.4 0.00142 Ácido nicotínico mg 21.50 5000 0.5 0.00215 Piridoxina mg 65.80 5000 0.5 0.00658 6-Bencilaminopurina mg 20.80 100 0.1 0.02080 Ácido naftalenacético g 32.60 25 0.001 0.00130 Sacarosa g 46.80 5000 20 0.18720 Phytagel g 61.00 100 1.8 1.09800 Costo final 2.32766 La estimación de costos se hizo para una capacidad de 8,400 frascos, siendo esta la capacidad total del cuarto de crecimiento I, en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos. En el Cuadro 8, se presentan los costos de los equipos que se encuentran en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos que fueron usados para la preparación del medio de cultivo y la respectiva propagación de la Rhyncholaelia digbyana. Se calculó la depreciación, esta demuestra el momento en que un activo alcanzó el límite de su vida útil, esto por un desgaste físico o técnico, al final de cada periodo se refleja el gasto depreciable que es la parte del servicio que ha expirado por el uso en la elaboración de un producto o servicio (Carrión Cumbicos 2019). 25 Cuadro 8 Costos y depreciación anual del equipo utilizado para las Etapas I, II y III de la siembra de la Rhyncholaelia digbyana expresado en dólares Equipo Costo Vida Útil (Años) Depreciación anual Autoclave 11,476.00 25 459.04 Cámara de flujo laminar 10,236.00 30 341.20 Balanza analítica 3,693.20 20 184.66 Aire acondicionado incubación 2,488.22 5 497.64 Aire acondicionado transferencia 1,685.01 5 337.00 Estereoscopio 691.00 20 34.55 Refrigerador 626.30 25 25.05 Esterilizador de calor seco 554.00 10 55.40 Agitador mecánico 323.32 5 64.66 Extractor de humedad 190.63 10 19.06 Microondas 169.45 20 8.47 Medidor de pH 76.00 3 25.33 Programador de luz 63.38 10 6.34 En el Cuadro 9 se presenta el total de cada uno de los costos de los materiales y mano de obra usados en las etapas de propagación, desde que entra al laboratorio hasta su momento de venta ya en macetas. Cuadro 9 Costo total en la realización de cada una de las etapas de propagación expresado en dólares Descripción Costo total % % Total por etapa Etapa I: Establecimiento Insumos 354.62 29.22 9.05% Medio de cultivo 610.97 50.34 Mano de obra 248.00 20.44 Subtotal 1,213.59 Etapa II: Multiplicación Insumos 212.80 29.17 5.44% Medio de cultivo 361.83 49.59 Mano de obra 155.00 21.24 Subtotal 729.63 Etapa III: Enraizamiento Insumos 1,276.80 32.64 29.18% Medio de cultivo 2,108.11 53.89 Mano de obra 527.00 13.47 Subtotal 3,911.91 26 Descripción Costo total % % Total por etapa Etapa IV: Aclimatación Bandejas 171.36 9.81 13.03% Sustrato 990.00 56.67 Fertilización 9.33 0.53 Fungicidas 5.91 0.34 Insecticida 12.34 0.71 Mano de obra 558.00 31.94 Subtotal 1,746.94 Área de crecimiento Macetas 2,268.00 39.08 43.29% Sustrato 2,750.00 47.39 Fertilización 146.86 2.53 Funguicidas 5.91 0.10 Insecticida 12.34 0.21 Mano de obra 620.00 10.68 Subtotal 5,803.11 Total 13,405.18 100.00% Costo total de producción/planta 1.60 Se pudo observar un mayor porcentaje de costos en la Etapa IV: Aclimatación en el segundo invernadero, con un 43.29%, debido a los altos costos necesarios para su tiempo en el invernadero. Para la producción de la Rhyncholaelia digbyana se recomienda establecer en un invernadero con techo de plástico, para así evitar la exposición a precipitaciones y poder controlar la temperatura (Medina y Vargas 2020). La temperatura óptima varía según las especies, pero casi siempre está comprendida entre 10 y 25°C (FAO 2002). A diferencia de la Etapa II: Multiplicación, que obtuvo un 5.44% siendo la de menor costo por la disminución de ingredientes en la realización del medio de cultivo. En las primeras tres etapas se pudo observar que el mayor gasto está destinado hacia la mano de obra, ocupando más del 40% de los costos totales en esta parte. Mientras que en las dos últimas etapas el costo de mayor insumo es el sustrato que se va a utilizar en las plántulas de Rhyncholaelia digbyana. 27 Conclusiones Se logró establecer Rhyncholaelia digbyana a partir de sus meristemos. Para la producción de 8,400 orquídeas in vitro a partir de meristemas el costo directo de producción por cada planta de 1.60 dólares. 28 Recomendaciones Para reducir contaminación en la etapa de establecimiento, utilizar material sano de las plantas madre de Rhyncholaelia digbyana. Completar el proceso de producción hasta la etapa de crecimiento, para obtener un costo más aproximado. Realizar el costeo total que incluya estimación de costos indirectos para tener un costo total con mayor exactitud. 29 Referencias Afanador Pérez AM. jun. 2005. Propagación in vitro a partir de meristemos de cinco variedades comerciales de Dianthus caryophyllus L. (clavel). Colombia: Pontificia Universidad Javeriana, Facultad de Ciencias Carrera de Biología. 137 p; [consultado el 6 de jun. de 2022]. https:// repository.javeriana.edu.co/bitstream/handle/10554/8740/ tesis68%20%281%29.pdf?sequence=3&isAllowed=y. Bayer CropScience AG. 2011. 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