1 ZAMORANO CARRERA DE CIENCIA Y PRODUCCIÓN AGROPECUARIA IDENTIFICACION DE LAS PRINCIPALES INFECCIONES VIRALES EN LOS CULTIVOS DE CHILE, TOMATE Y SANDIA EN HONDURAS Proyecto especial presentado como requisito parcial para optar al título de Ingeniera Agrónoma en el Grado Académico de Licenciatura. Presentado por Edith Esther Bermeo Mármol Zamorano, Honduras Octubre, 2001 2 La autora concede a Zamorano permiso para reproducir y distribuir copias de este trabajo para fines educativos, siempre y cuando se cite la fuente. Para otras personas físicas o jurídicas se reservan los derechos de autor. _____________________________ Edith Bermeo Mármol Zamorano, Honduras Octubre, 2001 3 IDENTIFICACION DE LAS PRINCIPALES INFECCIONES VIRALES EN LOS CULTIVOS DE CHILE, TOMATE Y SANDIA EN HONDURAS Presentado por Edith Esther Bermeo Mármol Aprobada: ________________________ ________________________ María Mercedes Doyle, Ph. D. Alfredo Rueda, Ph. D. Asesora Principal Coordinador de área temática ________________________ ________________________ Alfredo Rueda, Ph. D. Jorge Ivan Restrepo, M. B. A. Asesor Jefe de la Carrera de Ciencia y Producción Agropecuaria ________________________ ________________________ Elsa Barrientos, M. Sc. Antonio Flores, Ph. D. Asesora Decano ________________________ ________________________ Pablo Paz, Ph. D. Keith Andrews, Ph. D. Coordinador PIA Director General 4 DEDICATORIA A mi madre. A mis hermanas Ruth y Tatiana. A la memoria de mi padre. 5 AGRADECIMIENTOS A mi familia, por su amor incondicional, apoyo, confianza y por creer siempre en mí. Al Dr. Alfredo Rueda por sus valiosas ideas y sugerencias en la realización de este trabajo. A la Ing. Lorena Lastres de Rueda, por su apoyo en el trabajo de campo y por ser ejemplo de una excelente profesional, sin su ayuda este trabajo no hubiera sido posible. A todo el personal del D.P.V. (Antonio, Dr. Pitty, Dr. Cave, Maximino, Ana, Rosa, Julio, Werner, Jorge, Don Rafael, Silvia, Carolina, Doña María....) gracias por todo. A Lourdes por estar siempre dispuesta a ayudar. A Estela por brindarme su ayuda, conocimientos, tiempo y amistad. A la Dra. María Mercedes Doyle por brindarme la oportunidad de realizar mis estudios de ingeniería, por su paciencia y ayuda. A la Lic. Elsa Barrientos por su ayuda en el trabajo de laboratorio. A mis compañeros de laboratorio Andrés y Carlos por su ayuda. A Melissa por su buena disposición a ayudar y paciencia. A mis amigos (as): Ana Cristina, Sonia, Cecilia, Guillermo, Claudia, Hugo, Gerardo y Carlos. Muchas gracias por su apoyo constante, preocupación y amistad. A todas las personas que de una u otra forma contribuyeron con este trabajo y que me guardan cariño. Muchas gracias. 6 AGRADECIMIENTO A PATROCINADORES Agradezco al Instituto Ecuatoriano de Crédito Educativo y Becas por contribuir financieramente para continuar mis estudios en el programa de Ingeniero Agrónomo. Al Fondo Dotal Suizo, por el apoyo financiero durante el programa de agrónomo. Agradezco al Proyecto IPM-CRSP por brindarme el apoyo económico parcial en el programa de Ingeniero Agrónomo. Agradezco al Proyecto Salud de Suelos de la Universidad de Cornell y Zamorano y al Centro de Desarrollo de Agronegocios por la colaboración brindada para este proyecto de investigación. 7 RESUMEN Bermeo Mármol, Edith. 2001. Identificación de las principales infecciones virales en los cultivos de chile, tomate y sandía en Honduras. Proyecto Especial del Programa de Ingeniero Agrónomo, Zamorano, Honduras. 78 p. Las infecciones virales son uno de los factores más limitantes en la producción de chile, tomate y sandía en Honduras. Hay poco conocimiento sobre la etiología de las enfermedades virales y sus relaciones con vectores y hospederos. Existe la percepción errónea de que la virosis es un solo problema asociado a un vector, la mosca blanca, por lo que el manejo basado en el uso de insecticidas para controlarla ha sido ineficiente. Entre marzo y junio de 2001 se recolectaron 204 muestras con síntomas virales (84 de chile, 31 de tomate, 44 de sandía, 8 de otros cultivos: berenjena, melón, okra china, pepino y pepino peludo y 37 malezas asociadas a estos cultivos, en Comayagua, Copán, Choluteca, Güinope, Olancho, Valle y Zamorano. En la mayoría de las plantaciones se midió la incidencia y severidad de las infecciones virales. Las muestras se analizaron para geminivirus universal mediante la técnica de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa). También se diagnosticaron para potyvirus y virus del mosaico del pepino (CMV), y se analizaron 92 muestras de chile y tomate para el virus de la marchitez manchada del tomate (TSWV), utilizando la técnica de ELISA (Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a una Enzima). La incidencia y severidad más alta se observó en chile, en Comayagua, Zamorano y Valle; en tomate, en Zamorano y Güinope; y en sandía, en Valle. En chile hubo 54% de infección por geminivirus, 8% por CMV y 44% de infección mixta entre geminivirus y CMV. En tomate hubo 23% de infección por geminivirus. No se encontró el TSWV. En sandía hubo 36% de geminivirus, 41% de potyvirus y 23% de infección mixta entre geminivirus y potyvirus. En otros cultivos solamente se encontró 50% de geminivirus en melón. Las malezas Boerhavia erecta, Cleome viscosa, Cucurbita moschata, Cucurbita pepo, Luffa cilindrica, Nicandra physalodes y una maleza de la familia solanácea fueron positivas a geminivirus; Luffa cilindrica con potyvirus y Cucurbita pepo con una infección mixta de geminivirus y potyvirus. Aunque en chile y sandía se ha establecido la etiología de las principales enfermedades virales, 38% de muestras de chile, 77% de tomate y 23% de sandía resultaron negativas a los virus probados. Estos porcentajes pueden atribuirse a enfermedades virales de etiología desconocida, o patologías causadas por factores abióticos que deben identificarse. Palabras claves: Etiología, incidencia, infección viral, severidad. _____________________ Abelino Pitty, Ph. D. 8 NOTA DE PRENSA Identificados los principales virus que afectan al chile, tomate y sandía en Honduras Zamorano condujo un estudio entre marzo y junio de 2001, con el fin de identificar los principales virus que afectan a los cultivos de chile, tomate y sandía en Honduras. En Comayagua, Copán, Choluteca, Güinope, Olancho, Valle y Zamorano. Se recolectaron 204 muestras con síntomas virales de los cultivos de chile, tomate, sandía y 37 malezas encontradas en asocio a estos cultivos. En chile, los principales virus encontrados fue un grupo llamado geminivirus (54%) que es transmitido por la mosca blanca. Además, se encontró 8% del virus del mosaico del pepino (CMV) transmitido por áfidos y mecánicamente, y 44% de muestras presentaban ambos virus (geminivirus y CMV). En tomate se encontró 23% de geminivirus. En chile y tomate se hicieron pruebas para identificar la presencia del virus de la marchitez manchada del tomate y para un grupo de virus llamado potyvirus, las muestras resultaron negativas. En sandía se encontró 36% de geminivirus, 41% de potyvirus, que son transmitidos por áfidos y mecánicamente y 23% de muestras con los dos virus, geminivirus y potyvirus. 0 20 40 60 80 Chile (84) Tomate (31) Sandía (44) Cultivo % d e in fe cc ió n Geminivirus Potyvirus CMV "Otros virus" Gráfica 1. Virus encontrados en el estudio En las malezas analizadas, la Boerhavia erecta (pata de paloma), Cleome viscosa (tabaquillo), Cucurbita moschata (calabaza), Cucurbita pepo (ayote), Luffa cilindrica (paste), Nicandra physalodes (tomatillo) y una maleza de la familia solanácea fueron positivas a geminivirus; Luffa cilindrica fue positiva a potyvirus y Cucurbita pepo presentó dos virus en una misma muestra (geminivirus y potyvirus). Aunque con el presente estudio se han identificado algunos de los principales virus que afectan al cultivo de chile y sandía en Honduras, un 38% de las muestras de chile, 77% de tomate y 23% de sandía resultaron negativas a los virus probados, por lo que los estudios para determinar otros virus presentes continúan. Las muestras se analizaron en el laboratorio de diagnóstico de Zamorano, utilizando dos técnicas, PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) que permite identificar geminivirus al incrementar la cantidad de ADN del virus, en caso de estar presente en una muestra se puede observar; y la técnica ELISA (Ensayo Inmunoabsorbente ligado a una enzima) con 9 la que se identificó el virus del mosaico del pepino y potyvirus; esta técnica permite detectar un virus en una muestra de planta por medio de la identificación de la proteína del virus. Los problemas por virus en los cultivos de chile, tomate y sandía, se han incrementado en los últimos años, disminuyendo los rendimientos y causando grandes pérdidas a los productores. La importancia de identificar los virus que afectan a estos cultivos radica en que se puede lograr un manejo eficiente del virus en el campo, al conocer las formas de transmisión específica del virus y además determinar las especies de plantas que pueden ser afectadas. Además, las malezas que se encuentran dentro y en los alrededores del cultivo pueden ser hospederos de virus e insectos vectores y podrían ser fuente de diseminación del virus en el cultivo. En la actualidad Zamorano trabaja en la identificación de virus en los principales cultivos hortícolas con el fin de diseñar e implementar planes de manejo de infecciones virales en las principales zonas de producción de estos cultivos. _______________________ Sobeyda Alvarez, Licda. 10 CONTENIDO Portadilla ............................................................................................................. i Autoría ................................................................................................................ ii Página de firmas .................................................................................................. iii Dedicatoria .......................................................................................................... iv Agradecimientos .................................................................................................. v Agradecimiento a patrocinadores ........................................................................ vi Resumen .............................................................................................................. vii Nota de prensa ..................................................................................................... viii Contenido ............................................................................................................. x Indice de cuadros ................................................................................................. xiii Indice de figuras.. ................................................................................................. xiv Indice de gráficas.................................................................................................. xvi Indice de anexos.................................................................................................... xvii 1. INTRODUCCION.............................................................................................. 1.1 OBJETIVOS........................................................................................................ 1.1.1 Objetivo General............................................................................................... 1.1.2 Objetivos Específicos........................................................................................ 2. REVISION DE LITERATURA.......................................................................... 2.1 MECANISMOS DE TRANSMISION DE VIRUS A LAS PLANTAS.............. 2.1.1 Transmisión de virus por vectores.................................................................... 2.2 PROBLEMATICA DEL COMPLEJO MOSCA BLANCA-GEMINIVIRUS.... 2.3 DIAGNOSTICO DE INFECCIONES VIRALES EN CULTIVOS HORTICOLAS Y MALEZAS EN HONDURAS............................................... 2.3.1 Determinación de los virus de melón y sus malezas hospederas en Choluteca, Honduras (1991)............................................................................. 2.3.2 Caracterización de Geminivirus presentes en frijol, tomate, otros vegetales y malezas en Comayagua y Zamorano (1998-1999)............................................ 2.3.3 Diversidad de Begomovirus en América Central y el Caribe....................... 2.3.4 Diagnóstico de geminivirus y potyvirus en chile y sandía en Comayagua, Olancho y Valle, Honduras (2000)................................................................... 2.4 GENERALIDADES SOBRE LOS PRINCIPALES VIRUS QUE AFECTAN AL CHILE, TOMATE Y CUCURBITACEAS................................................... 2.4.1 Potyvirus........................................................................................................... 2.4.2 Geminivirus....................................................................................................... 2.4.3 Cucumovirus..................................................................................................... 2.4.4 Tospovirus......................................................................................................... 1 2 2 2 3 3 3 4 6 6 8 11 12 13 14 20 24 26 11 3. MATERIALES Y METODOS............................................................................ 3.1 DIAGNOSTICO PRELIMINAR......................................................................... 3.2 MUESTREO........................................................................................................ 3.2.1 Cultivos muestreados y su ubicación................................................................ 3.2.2 Recolección e identificación de las muestras.................................................... 3.3 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS EN EL LABORATORIO............. 3.3.1 Preservación del tejido foliar............................................................................. 3.3.2 Diagnóstico de virus de ADN: geminivirus...................................................... 3.3.3 Diagnóstico de virus de ARN............................................................................ 4. RESULTADOS Y DISCUSION.......................................................................... 4.1 RESULTADOS DEL DIAGNOSTICO PRELIMINAR..................................... 4.1.1 Resultados del diagnóstico preliminar en tomate.............................................. 4.1.2 Resultados del diagnóstico preliminar en chile................................................. 4.1.3 Resultados del diagnóstico preliminar en sandía y melón................................ 4.2 CHILE.................................................................................................................. 4.2.1 Resultados del análisis de geminivirus.............................................................. 4.2.2 Resultados del análisis de virus de ARN.......................................................... 4.3 TOMATE............................................................................................................. 4.3.1 Resultados del análisis de geminivirus.............................................................. 4.3.2 Resultados del análisis de virus de ARN.......................................................... 4.4 SANDIA............................................................................................................... 4.4.1 Resultados del análisis de geminivirus.............................................................. 4.4.2 Resultados del análisis de virus de ARN.......................................................... 4.5 OTROS CULTIVOS............................................................................................ 4.6 MALEZAS........................................................................................................... 4.7 RESULTADOS EN CONJUNTO....................................................................... 4.7.1 Comparación de la infección por geminivirus en chile, tomate y sandía en los años 1999 y2001 en Honduras.................................................................... 4.7.2 Comparación de la infección por geminivirus, potyvirus, virus del mosaico del pepino (CMV) y otros virus de etiología desconocida, encontrados en chile, tomate y sandía en Honduras (2001)....................................................... 5 CONCLUSIONES................................................................................................. 28 28 29 29 31 31 31 32 33 35 35 35 35 35 35 36 37 38 39 39 40 41 41 42 42 44 44 46 50 12 6. RECOMENDACIONES...................................................................................... 7. BIBLIOGRAFIA.................................................................................................. 8. ANEXOS............................................................................................................... 52 54 58 13 INDICE DE CUADROS 1. Malezas hospederas de virus reportadas en Choluteca, Honduras (1991)............. 7 2. Porcentaje de infección por geminivirus determinada por PCR en diferentes cultivos y malezas en el Valle de Comayagua y Zamorano. Enero-mayo (1999. 9 3. Malezas recolectadas para análisis por PCR para geminivirus universal en el Valle de Comayagua y Zamorano. Enero-julio (1999)................................................. 10 4. Geminivirus identificados mediante caracterización molecular en América Central, Jamaica y República Dominicana (2001)............................................... 12 5. Porcentaje de muestras de chile positivas a geminivirus y potyvirus por lugar de muestreo. Honduras. Enero-abril (2000)............................................................. 12 6. Porcentaje de muestras de sandía positivas a geminivirus y potyvirus por lugar de muestreo. Honduras. Enero-abril (2000)............................................................. 13 7. Virus específicos seleccionados para diagnóstico en AGDIA a muestras de chile, tomate, sandía y melón. USA. Febrero (2001).................................................... 29 8. Cantidad de muestras de chile, tomate y sandía recolectadas de acuerdo al cultivo y lugar de muestreo. Honduras. Marzo-junio (2001)............................................. 30 9. Otros cultivos recolectados de acuerdo al lugar de muestreo. Honduras. Marzo- junio (2001)........................................................................................................... 30 10. Incidencia y severidad de infecciones virales observada por síntomas en las plantaciones de chile por lugar de muestreo. Honduras. Marzo-junio (2001).... 36 11. Porcentaje de muestras de chile positivas a geminivirus, potyvirus, virus del mosaico del pepino (CMV) y virus de la marchitez manchada del tomate (TSWV) por lugar de muestreo. Honduras. Marzo-junio (2001)....................................... 36 12. Incidencia y severidad de infecciones virales observada por síntomas en las plantaciones de tomate por lugar de muestreo. Honduras. Marzo-junio (2001). 38 13. Porcentaje de muestras de tomate positivas a geminivirus, potyvirus, virus del mosaico del pepino (CMV) y virus de la marchitez manchada del tomate por lugar de muestreo. Honduras. Marzo-junio (2001)...................................................... 39 14. Incidencia y severidad observada por síntomas en las plantaciones de sandía por lugar de muestreo. Honduras. Marzo-junio (2001)............................................. 40 14 15. Porcentaje de muestras de sandía positivas a geminivirus, potyvirus, virus del mosaico del pepino (CMV) e infecciones mixtas por lugar de muestreo. Honduras. Marzo-junio (2001)............................................................................................... 40 16. Porcentaje de muestras de berenjena, melón, okra china, pepino y pepino peludo positivas a geminivirus, potyvirus y virus del mosaico del pepino (CMV) por lugar de muestreo. Honduras. Marzo-junio (2001)...................................................... 42 17. Malezas recolectadas de acuerdo al cultivo y lugar donde se encontraron. Honduras. Marzo-junio (2001)............................................................................. 43 15 INDICE DE FIGURAS 1. 2. 3. 4. 5. 6. Partículas de un potyvirus.................................................................................... 14 Partículas de un geminivirus................................................................................ 20 Partículas de un cucumovirus............................................................................... 24 Partículas de un tospovirus................................................................................... 26 Fotografía de una gel de electroforesis mostrando los resultados de las muestras de chile de Valle.................................................................................... 37 Fotografías de chile, tomate y cucurbitáceas con síntomas virales y su diagnóstico.................................................................................................... 48 16 INDICE DE GRAFICAS 1. Infección de geminivirus en Zamorano, 1998 y 1999............................................... 11 2. Infección por geminivirus en chile, tomate y sandía en Honduras en 1999............................................................................................................................ 45 3. Infección de geminivirus, potyvirus, virus del mosaico del pepino (CMV) y otros virus (de etiología desconocida) en chile, tomate y sandía en Honduras. Marzo-junio (2001)......................................................................................................................... 46 17 INDICE DE ANEXOS 1. Extracción de ADN total (planta y viral), modificación de Doyle & Doyle (1990), FOCUS 12 (1): 13-15. Extracción Miniprep de ADN.............................................. 58 2. Diagrama de amplificación de ADN usando la técnica de PCR (Reacción en cadena de la polimerasa)........................................................................................................ 61 3. Protocolos para la prueba ELISA directa e indirecta proporcionados por AGDIA... 61 4. Diagrama de ELISA directa....................................................................................... 68 5. Lista de los virus reportados en tomate, chile y sandía a nivel mundial.................... 69 6. Descripción de las muestras recolectadas de acuerdo al cultivo y lugar................... 71 18 1. INTRODUCCION La incidencia y severidad de infecciones virales en los cultivos hortícolas se ha incrementado durante los últimos años hasta convertirse en uno de los factores limitantes más importantes en la producción de varios cultivos en Honduras, como tomate, chile y cucurbitáceas (Sponagel y Fúnez, 1994). Uno de los principales problemas en el desarrollo de programas de manejo de virus es la falta de información básica sobre su epidemiología. En Honduras, existe muy poca información sobre los virus que afectan a los cultivos, sus relaciones con vectores y hospederos (Espinoza, 1991), y la identificación de infecciones virales generalmente se ha hecho en base a sintomatología. Existe la percepción errónea de que todas las enfermedades virales, llamadas localmente virosis, son causadas por geminivirus transmitidos por mosca blanca, por lo que el manejo se ha basado en el uso excesivo de insecticidas para controlar al vector, lo que ha traído como consecuencia resistencia, contaminación ambiental, daño a la salud humana, grandes pérdidas económicas e ineficiencia en el manejo de virus (Doyle et al., 1999). Cada virus tiene vectores, formas de transmisión y hospederos específicos, por tanto el conocimiento o diagnóstico correcto de éstos, constituye la base para un manejo eficiente. Debido a esto, programas internacionales como el IPM (“Integrated Pest Management”) y el “Bean Cow-Pea CRSP” (“Collaborative Research Support Program”) donde participa Zamorano y otros dirigidos por el CATIE (Centro Agronómico Tropical de Investigación Agrícola) y el CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical), entre otros, iniciaron en 1997 un estudio con énfasis en expandir el conocimiento epidemiológico del complejo mosca blanca/geminivirus y determinar otros grupos de virus que están afectando a cultivos hortícolas de importancia económica y social en Honduras como tomate, chile, cucurbitáceas y sus malezas (Doyle et al., 1999). En 1998 y 1999 se recolectaron muestras con síntomas virales de los cultivos de tomate, chile, sandía, malezas, entre otros, de los valles de Comayagua y Francisco Morazán; las muestras fueron analizadas mediante la técnica de PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa) encontrándose en promedio un 30% de infecciones virales causadas por geminivirus en 1998 y 48% de infecciones por geminivirus en 1999. Por lo tanto un poco más del 50% de muestras sintomáticas resultaron negativas a geminivirus, atribuyéndose a otros virus o patologías causadas por factores abióticos. Por lo que el siguiente paso fue determinar que otros grupos de virus están afectando a los cultivos de chile, tomate y cucurbitáceas. 19 El presente trabajo constituye parte de este estudio que tiene como objetivos identificar otros grupos de virus que están afectando a estos cultivos en Honduras. Debido a la gran cantidad de virus que afectan al chile, tomate y sandía, se limita el número de virus para los que se puede probar y la cantidad de muestras a probar. El estudio continuará en el año 2002 ampliando el número de virus y muestras a probar. 1.1 OBJETIVOS 1.1.1 Objetivo general Identificar las principales enfermedades virales que afectan a los cultivos de chile, tomate, sandía y las malezas asociadas a estos cultivos, como base para desarrollar programas de manejo. 1.1.2 Objetivos especificos • Obtener información para entender la dinámica de las infecciones virales en los cultivos de chile, tomate y sandía. • Determinar la presencia y porcentaje de infecciones virales en los cultivos de chile, tomate y sandía causadas por geminivirus, potyvirus y virus del mosaico del pepino (CMV). • Diagnosticar la presencia del virus de la marchitez manchada del tomate (TSWV), en muestras de tomate y chile. • Determinar si las malezas más comunes encontradas en asocio a los cultivos de chile, tomate y sandía tienen infecciones causadas por geminivirus, potyvirus y CMV, ya que podrían ser hospederas de estos virus. 20 2. REVISION DE LITERATURA 2.1 MECANISMOS DE TRANSMISION DE VIRUS A LAS PLANTAS Los virus fitopatógenos son transmitidos a las plantas mediante la propagación vegetativa, mecánicamente a través de la savia, por medio de semillas, polen, vectores y la cúscuta. Los virus no son diseminados por el viento o agua. Cuando se transportan en la savia o residuos vegetales, generalmente no producen infecciones, a menos que entren en contacto con los contenidos de una célula viva dañada (Agrios, 1995). La transmisión de virus mediante propagación vegetativa y por semilla, son importantes porque permiten que el virus sea transmitido entre generaciones de plantas (infección primaria), por lo tanto, ocasionan solamente enfermedades monocíclicas, pero no tienen importancia en la propagación del virus de plantas enfermas a plantas sanas de una misma generación. A diferencia, la transmisión de virus mediante vectores como insectos, introducen el virus en el cultivo (infección primaria) y también lo transmiten de plantas infectadas a sanas de una misma generación y durante la misma estación de crecimiento (infecciones secundarias) (Agrios, 1995). 2.1.1 Transmisión de virus por vectores Los vectores conocidos que transmiten virus son: insectos, nematodos, ácaros y hongos. Las enfermedades que producen éstos son policíclicas y el número de ciclos por estación puede variar de unos cuantos como en el caso de nematodos (2 a 5) a muchos, como los áfidos (10 a 20) (Agrios, 1995). La transmisión de virus mediante vectores puede ser de dos formas: • Transmisión no persistente: el vector es capaz de adquirir el virus de una planta enferma en un corto tiempo (minutos) y pierde rápidamente la capacidad de transmitirlo (minutos). La relación del virus y el vector es temporal (Agrios, 1995). • Transmisión semipersistente: el virus es adquirido e inoculado en largas succiones al floema y puede ser retenido por horas o días (Agrios, 1995). • Transmisión persistente circulativa: las partículas virales adquiridas por el insecto al alimentarse circulan dentro de su cuerppo parsando del intestino a la hemolinfa hasta llegar a las glándulas salivales, para volver a ser inyectado en otra planta hospedera (Sponagel y Fúnez, 1994). • Transmisión persistente propagativa: El virus se multiplica y circula de la misma forma que la transmisión persistente circulativa y se propaga transováricamente a la progenie (Sponagel y Fúnez, 1994). 21 Agrios (1995) considera que el mecanismo de transmisión de virus más común y de mayor importancia económica en el campo es a través de insectos vectores, aunque los miembros de grupos de insectos que son vectores de virus son reducidos; el orden Homoptera tiene la mayor cantidad y los más importantes vectores, como áfidos (Aphidae), mosca blanca (Aleuroididae) y otros de menor importancia como escamas, piojos harinosos (Coccoidae), periquitos (Membracidae). Vectores de otros órdenes son los trips (Thysanoptera), escarabajos (Coleóptera), las chinches verdaderas (Hemiptera) y saltamontes (Orthoptera). Los áfidos se encuentran entre los vectores más importantes de virus fitopatógenos y transmiten alrededor de 170 virus en forma no persistente en su mayoría (pocos lo transmiten de forma persistente circulativa); en general los áfidos adquieren el virus al alimentarse de una planta enferma durante períodos cortos de tiempo (30 segundos o menos) y los transmiten cuando se alimentan de una planta sana en un tiempo similar. El tiempo en que los áfidos pueden transmitir el virus desde que lo adquieren varía desde unos minutos a varias horas, después de lo cual ya no pueden transmitir el virus (Agrios, 1995). Brown y Bird (1992) afirman que la mosca blanca (B. tabaci) es el vector de un grupo de virus fitopatógenos muy importante. La transmisión de geminivirus por mosca blanca es de tipo persistente circulativa, para la adquisición eficiente del virus, la mosca blanca necesita un tiempo de succión de 2-24 horas; es capaz de transmitir el virus después de 4- 10 horas después de la adquisición y por un período de 5-20 días, mostrando una disminución gradual en la eficiencia de la transmisión. Se ha demostrado también que los ácaros de la familia Eriophyidae transmiten nueve virus, la transmisión de virus es muy específica, debido a que estos ácaros tienen un rango de hospederos limitado y es el único vector conocido del virus que transmiten. Hay ácaros que transmiten virus en forma no persistente y persistente circulativa (Agrios, 1995). Los nematodos de los géneros Longidorus, Xiphinema, Trichodorus y Paratrichodorus, en etapa larval y adulto pueden transmitir virus al alimentarse de raíces de plantas enfermas y luego pasar a plantas sanas. Estos no lo transmiten a la progenie, ni pasa a través de las mudas (Agrios, 1995). . 2.2 PROBLEMATICA DEL COMPLEJO MOSCA BLANCA-GEMINIVIRUS La mosca blanca (Bemisia tabaci) es considerada la especie más difundida y posiblemente más dañina presente en todas las zonas agrícolas y en muchos cultivos en Honduras desde hace muchos años. Hasta finales de los años 80 fueron consideradas plagas secundarias controlándose solamente en épocas y cultivos específicos (Sponagel y Fúnez, 1994). 22 A partir de 1989 la mosca blanca llegó a ser una plaga clave en América Central, Florida, México, el Caribe, Venezuela y Brazil. En Honduras afecta principalmente a los cultivos de tomate, chile, frijol, algodón y cucurbitáceas (Polston y Anderson, 1997). El daño que causa la mosca blanca es directo e indirecto; el daño directo lo hace al succionar la savia y el daño indirecto excretando mielecilla donde se desarrolla la fumagina y como insecto transmisor de virus. El daño más serio que B. tabaci ocasiona es la transmisión de geminivirus lo que ha ocasionado las reducciones en rendimiento más grandes en Honduras y el abandono de cultivos especialmente en tomate y chile (Sponagel y Fúnez, 1994). Las razones del cambio de B. tabaci de una especie inocua a una plaga clave y vector de virus importante no se conocen realmente, sin embargo, los cambios en las prácticas agrícolas locales y regionales, la expansión del monocultivo bajo irrigación de hortalizas, la expansión de épocas de cultivo debido al uso de variedades mejoradas, la introducción y resistencia subsecuente de poblaciones del insecto a nuevos plaguicidas y el incremento del transporte mundial de plantas y productos vegetales posiblemente han contribuido al problema (Brown, 1992). En el valle de Comayagua en 1992, se estimó que la reducción en rendimiento en tomate por virosis atribuída a mosca blanca fue mayor al 70% (Caballero y Rueda, 1993). El Valle de Comayagua es la zona más importante de producción de vegetales en Honduras por parte de pequeños y grandes productores. El complejo mosca blanca-geminivirus es muy difícil de manejar con este tipo de sistema de cultivo mixto, porque muchos de los cultivos sirven como hospederos de vectores como mosca blanca (Doyle et al. ,1999). Alvarez et al. (1993) mencionan que en República Dominicana, en 1988, debido a una explosión de B. tabaci que tuvo grandes repercusiones y pérdidas económicas, especialmente en plantaciones de tomate, condujo a que la Secretaría de Estado de Agricultura formara una comisión nacional de manejo de mosca blanca, donde se impusieron medidas legales, como regulación de épocas de siembra de los cultivos y eliminación de rastrojos. Debido al cumplimiento de estas disposiciones a nivel nacional, se pudo manejar exitosamente el complejo mosca blanca-geminivirus y disminuir la incidencia de geminivirus en cultivos hortícolas 1 La incidencia y severidad de infecciones virales en cultivos como tomate, chile y cucurbitáceas se ha incrementado desde inicios de los 90, lo cual coincide con el cambio de “status” de mosca blanca de una plaga secundaria a una plaga clave, observándose altas poblaciones de mosca blanca en zonas como Comayagua; sumado a esto, el poco entendimiento sobre la biología y ecología de la mosca blanca, el poco conocimiento e información sobre la epidemiología de infecciones virales y, a que la identificación de éstas generalmente se ha realizado en base a sintomatología, ha ocasionado que la mayoría de infecciones virales o amarillamientos sean erróneamente atribuídas a geminivirus transmitidos por mosca blanca (Doyle et al., 1999). 1 Doyle, M. 2001. Manejo del complejo mosca blanca-geminiviurus en República Dominicana. Zamorano, Honduras. (Comunicación personal). 23 Debido a eso, el manejo de la virosis se ha enfatizado en el manejo de mosca blanca, basado en el uso excesivo de insecticidas, lo que ha traído como consecuencia resistencia, contaminación ambiental, daño a la salud humana, grandes pérdidas económicas e ineficiencia en el manejo de los virus (Doyle et al., 1999). El complejo mosca blanca-geminivirus causa un daño de mucha importancia en la producción de tomate y chile en Honduras. En tomate en el valle de Comayagua, Hilje y Arboleda (1993) estimaron que la reducción en la producción a causa de enfermedades virales transmitidas por Bemisia tabaci fue mayor al 70% con pérdidas por más de US$ 4 millones. Estas estimaciones se hicieron basado en la población de mosca blanca en el lugar. Sin embargo posiblemente se ha sobreestimado su importancia al atribuir a todas las enfermedades de carácter viral como geminivirus. Existe la incertidumbre sobre que otros grupos de virus y en que medida están afectando a estos cultivos. Debido a esto, programas internacionales como el IPM (“Integrated Pest Management”) y el “Bean Cow-Pea CRSP” (“Collaborative Research Support Program”) donde participa Zamorano y otros dirigidos por el CATIE (Centro Agronómico Tropical de Investigación Agrícola), el CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical), REDCAHOR (Red colaborativa de investigación y desarrollo de las hortalizas para América Central, Panamá y República Dominicana) entre otros, iniciaron en 1997 un estudio con énfasis en expandir el conocimiento epidemiológico del complejo mosca blanca/geminivirus y determinar otros grupos de virus que están afectando a cultivos hortícolas de importancia económica y social en Honduras como tomate, chile, cucurbitáceas y sus malezas (Doyle et al., 1999), para poder determinar con certeza la importancia y porcentaje de infecciones virales causadas por geminivirus y otros grupos de virus como base para un manejo eficiente. 2.3 DIAGNOSTICO DE INFECCIONES VIRALES EN CULTIVOS HORTICOLAS Y MALEZAS EN HONDURAS 2.3.1 Determinación de los virus de melón y sus malezas hospederas en Choluteca, Honduras (1991) Valdivia (1991) entre noviembre de 1990 y abril de 1991 realizó un estudio en Choluteca, con el fin de determinar los virus que afectaban lotes comerciales de melón, identificar las malezas hospederas de virus de cucurbitáceas e identificar los insectos vectores y su papel en la transmisión viral. Mediante la prueba de ELISA ("Enzyme Linked Inmunosorbent Assay", Ensayo Inmunoabsorbente ligado a una enzima) se detectó en melón el "Cucumber mosaic virus" (CMV) (virus del mosaico del pepino), "Watermelon mosaic virus 1 (WMV1) (Virus del mosaico de la sandía 1, "Watermelon mosaic virus 2" (WMV2) (Virus del mosaico de la sandía 2) y el "Zucchini yellow mosaic virus" (ZYMV) (Virus del mosaico amarillo del zucchini), el primero del grupo cucumovirus y los restantes del grupo potyvirus, así como la presencia de infecciones compuestas, con combinaciones entre todos los virus analizados, siendo las más comunes CMV-WMV1 y WMV1-WMV2. 24 En cuanto a malezas, Valdivia (1991) reportó en Choluteca, Honduras en los alrededores, dentro y en las orillas de plantaciones de melón varias especies de malezas hospederas de virus, se muestran en el cuadro 1. Cuadro 1. Malezas hospederas de virus reportadas en Choluteca, Honduras (1991). Maleza CMV WMV1 WMV2 SMV ZYMV Amaranthus spinosus - - + - + Boerhavia erecta + + + - + Calotropis procera + - - - - Cleome viscosa + - - - + Cucumis anguria - + + - - Cucumis melo + + + - - Cucurbita pepo + + + + + Malva sp. - + - - - Margaranthus solanacearum + - + - - CMV: "Cucumber mosaic virus" WMV2: "Watermelon mosaic virus 2" WMV1: "Watermelon mosaic virus 1" SMV: "Squash mosaic virus" ZYMV: "Zuchini yellow mosaic virus" Fuente: Valdivia (1991). 2.3.1.1 Importancia de las malezas como hospederas de virus Las malezas como hospederos alternos de virus, juegan un papel muy importante en la epidemiología viral. Las malezas y plantas voluntarias de cultivos anteriores en la misma plantación y en lugares cercanos a las plantaciones sirven de refugio para vectores y son hospederos de virus (Maelzer 1986, citado por Valdivia 1991). Posiblemente los problemas que surgen con infecciones virales en los cultivos estén relacionados con la presencia de malezas reservorias de virus y/o de insectos vectores y cultivos viejos en los alrededores de la plantación, siendo fuente de inóculo para las nuevas siembras (Valdivia, 1991). Cuando las condiciones ecológicas son desfavorables para la sobrevivencia de vectores como áfidos y mosca blanca es necesario identificar a las malezas que permitan la sobrevivencia de los vectores durante el invierno y verano. La falta del inóculo de virus, y no la falta de vectores es probablemente la razón de la ausencia de epidemias de virus. (Lastres, 1991). Lastres (1991) afirma que la eliminación de malezas y plantas voluntarias infectadas por virus, sanidad y siembra en tiempo apropiado son métodos efectivos en la reducción de la diseminación de virus. El combate de infecciones virales es puramente preventivo, no curativo, por tanto la eliminación de las fuentes de inóculo es el método más efectivo de prevención (Valdivia et al., 1992). 25 Sin embargo, debe considerarse que la eliminación de malezas no siempre reduce la incidencia de virus en un cultivo, en algunos casos puede incrementar la infección ya que induce al vector a moverse de las malezas al cultivo (Lastres, 1991). 2.3.2 Caracterización de Geminivirus presentes en frijol, tomate, otros vegetales y malezas en Comayagua y Zamorano (1998-1999) Este estudio se realizó por personal de Zamorano como parte de los programas IPM- CRSP y Bean Cow-Pea CRSP, que iniciaron en el año 1998. Entre enero y julio de 1998 se recolectaron 170 muestras con síntomas de virus (mosaico, moteado, amarillamiento, corrugamiento de hojas y achaparramiento de la planta) de los valles de Francisco Morazán y Comayagua, incluyendo frijol, tomate, chile dulce, pepino, sandía y 22 tipos de malezas, con el objetivo de determinar el porcentaje de plantas con síntomas virales infectadas con geminivirus (Doyle et al., 1999). Las muestras fueron analizadas por PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa). Para esto se contaban con dos grupos de iniciadores o “primers” universales: 514 y 1048 para geminivirus proporcionados por la Universidad de Arizona y los "primers" 715 y 1978 proporcionados por la Universidad de Wisconsin (USA). También se contaba con dos pares de "primers" específicos: el par de "primers" 47/1068 desarrollado para la detección del "Bean golden mosaic virus" (BGMV) (presente en Honduras) desarrollado en la Universidad de Wisconsin y los "primers" para el "Tomato yellow leaf curl virus" (TYLCV) desarrollados en Israel (Doyle et al., 1999). En ese estudio, se utilizaron los "primers" AV 514 y AC 1048, desarrollados para amplificar el gen de la cápside proteica de geminivirus del subgrupo III (Begomoviridae). El gen de la cápside proteica (CP) es la región más conservada del genoma de la familia Geminiviridae, haciéndolo muy útil para el diagnóstico e investigación de la historia evolucional viral. Estos "primers" amplifican un producto de PCR de un peso molecular de 576 pb (pares de bases) nitrogenadas (Brown y Wyatt, 19972). En este estudio (1998) solo un 30% de las muestras resultaron positivas a geminivirus. Entre enero y mayo de 1999, el período correspondiente a la estación seca, cuando existe la mayor presión del complejo mosca blanca-geminivirus, un segundo estudio se condujo para confirmar los resultados obtenidos en 1998 y para tener más información que pudiera contribuir a entender el predominio de la infección por geminivirus en diferentes cultivos y estaciones en Honduras (Doyle et al., 1999). En el segundo estudio (1999) se recolectaron 189 muestras con síntomas de virus del valle de Comayagua y Zamorano, incluyendo frijol, tomate, chile dulce, sandía, papaya y malezas. Se realizó una descripción de los síntomas de las muestras y se estimó el porcentaje de infección (incidencia) por virus en cada plantación de donde se obtuvieron las muestras basado en síntomas visuales. Las muestras fueron analizadas por PCR probando para geminivirus universal. Un 48% de las muestras resultaron positivas a geminivirus (cuadro 2) (Doyle et al., 1999). 26 Cuadro 2. Porcentaje de infección por geminivirus determinada por PCR en diferentes cultivos y malezas en el Valle de Comayagua y Zamorano. Enero-mayo (1999). CULTIVO TOTAL DE MUESTRAS POSITIVAS-CULTIVO (%) Frijol 42 48 Tomate 36 78 Sandía 45 51 Chile dulce 28 71 Malezas 24 42 Papaya 14 0 Total 189 48 Fuente: Doyle et al.(1999), modificado por el autor. Un 48% de las muestras con síntomas de infección viral resultaron positivas a geminivirus en 1999 (cuadro 2), el 52% de las muestras restantes con sintomatología viral podrían atribuirse a otros virus diferentes de geminivirus transmitidos por mosca blanca, deficiencias nutricionales u otras causas (Doyle et al., 1999). En 1999, sólo en el Valle de Comayagua 162 muestras fueron analizadas. Un 55% de éstas resultaron positivas a geminivirus. En malezas en el valle de Comayagua y Zamorano un 42% de las muestras resultaron positivas a geminivirus, las malezas recolectadas se muestran en el cuadro 3. En ese estudio se identificaron a Nicandra physalodes, Abutilon spp, Sida acuta, Euphorbia heterophylla, Malvastrum coromandelianum y Wissadula excelsior, como malezas hospederas de geminivirus. Sin embargo para establecer que una especie de maleza es hospedera alterna de un virus específico es necesario identificar el tipo de virus, para esto es necesario secuenciar por lo menos un producto de PCR, o utilizar un anticuerpo específico (monoclonal) e identificar el o los vectores del virus y hacer pruebas de transmisión 2 Cuadro 3. Malezas recolectadas para análisis por PCR para geminivirus universal en el Valle de Comayagua y Zamorano. Enero-Julio (1999). MALEZA ORIGEN PCR PARA GEMINIVIRUS Nicandra physalodes Las Flores, Co. + 2 Doyle, M. 2001. Determinación de malezas como hospederos alternos de virus. Zamorano, Honduras. (Comunicación personal). 27 Abutilon spp. San Nicolás, Co. + Sida acuta Los Castaños, Co. + No identificada Voluntades Unidas, Co + Euphorbia heterophylla Zamorano, zona I + Euphorbia heterophylla Villa de San Antonio, Co. + No identificada Las Flores, Co. + Malvastrum coromandelianum Palo Pintado, Co. + No identificada Palo Pintado, Co. + Malvastrum coromandelianum Palo Pintado, Co. + Wissadula excelsior CEDA, Co. + Titonia spp. Cascabeles, Co. - Sida acuta Los Castaños, Co. - Nicandra physalodes Zamorano, zona II - Nicandra physalodes Zamorano, zona III - Abutilon spp. San Nicolás, Co. - Malvastrum coromandelianum San Nicolás, Co. - Boerhavia erecta San Nicolás, Co. - Sida spp. San Nicolás, Co. - Melampodium divaricatum Zamorano, Zona II - Physallis ignota Villa de San Antonio, Co. - Titonia spp. Villa de San Antonio, Co. - Amaranthus spp. Villa de San Antonio, Co. - Physallis ignota Villa de San Antonio, Co. - Nicandra physalodes Zamorano, Zona III - Rhynchosia jalapiensis Parcelas de tomate, Co - Rhynchosia minima Parcelas de maíz, Co. - Wissadula amplissima Valle de Comayagua, Norte - + : positivo a geminivirus. -: negativo a geminivirus. Fuente: (Doyle et al., 19991), modificado por el autor. La diferencia encontrada entre los años 1998 y 1999 de 30% y 48% de geminivirus en Honduras respectivamente, se piensa que no fue por un aumento de infección por geminivirus de un año a otro; sino que pudo deberse a la metodología de muestreo, ya que en el año de 1999 se tuvo un mejor criterio de muestreo y mayor práctica, descartando muestras con infecciones por factores abióticos como deficiencias nutricionales o toxicidades que causaban síntomas similares a geminivirus en la planta 3 En la gráfica 1 puede observarse la infección por geminivirus solamente en Zamorano comparando los años 1998 y 1999. 3 DOYLE, M.M. 2001. Diagnóstico de geminivirus en cultivos hortícolas en Honduras en los años 1998 y 1999. Zamorano, Honduras. Comunicación personal. 28 0 10 20 30 40 50 60 70 80 % D E M U ES TR A S PO SI TI VA S A G EM IN IV IR U S Frijol Tomate Sandia Pepino Malezas Papaya 1998 1999 Gráfica 1. Infección de geminivirus en Zamorano, 1998 y 1999. 2.3.3 Diversidad de Begomovirus en América Central y el Caribe Maxwell et al. (2001), en América Central, Jamaica y República Dominicana, detectaron ocho geminivirus afectando a tomate los cuales se caracterizaron molecularmente en la Universidad de Wisconsin, Estados Unidos. En el cuadro 4 se presenta el nombre del virus y el país en el que se detectó. Además, en Honduras se detectaron dos virus asociados a malezas, el "Rhynchosia golden mosaic virus" (RGMV) y el "Euphorbia mosaic virus" (EMV) (Doyle et al., 2001). Hasta la fecha, en Honduras, no se ha encontrado el "Tomato yellow leaf curl virus" (TYLCV). Considerando que se ha reportado el TYLCV en países como Jamaica y República Dominicana, Doyle4 recomienda que debería hacerse evaluaciones continuas para determinar la presencia o ausencia de este virus en Honduras. Cuadro 4. Geminivirus identificados mediante caracterización molecular en América Central, Jamaica y República Dominicana (2001). Geminivirus H G C.R. J N R.D. 4 Doyle (2001). "Tomato yellow leaf curl virus". Zamorano, Honduras. Comunicación personal. 29 "Tomato severe leaf curl" • • • "Tomato mild mottle" • • "Tomato mosaic Havana" • "Tomato yellow mottle" • "Tomato golden mottle" • "Tomato mosaic Havana (JM1)" • "Tomato yellow leaf curl" • • "Tomato leaf curl Sinaloa" • • • : Se encontró el virus. C.R.: Costa Rica. G: Guatemala. H: Honduras. J: Jamaica. N: Nicaragua. R.D.: República Dominicana. Fuente: Maxwell et al.(2001). Modificado por el autor. 2.3.4 Diagnóstico de geminivirus y potyvirus en chile y sandía en Comayagua, Olancho y Valle, Honduras (2000) Guamán (2000) realizó un estudio entre enero y abril del 2000 diagnosticando visualmente y por métodos de laboratorio, 50 muestras con síntomas diversos de virus en el cultivo de chile y 40 muestras de sandía utilizando PCR para geminivirus universal y ELISA para potyvirus. En chile, un 90% de las muestras fueron plantas sintomáticas a infecciones virales y un 10% de plantas asintomáticas y la maleza Amaranthus hibridus (Guamán, 2000). Se muestran los resultados del estudio (cuadro 5). Cuadro 5. Porcentaje de muestras de chile positivas a geminivirus y potyvirus por lugar de muestreo. Honduras. Enero-abril (2000). Lugar Muestras recolectadas Positivas a geminivirus (%) Positivas a potyvirus (%) Comayagua 28 93.0 0 Zamorano 22 82.0 0 Total 50 88.0 0 Fuente: Guamán (2000). El análisis mostró una infección de 88% de geminivirus y un 0% de potyvirus, quedando un 12% de infecciones virales o patologías de etiología desconocida. En chile, la comparación del diagnóstico visual de geminivirus con análisis de laboratorio fue más efectiva comparada a sandía que fue muy baja, pero se comprobó que el diagnóstico visual en infecciones virales no es confiable (Guamán, 2000). En sandía se analizaron 40 muestras de las cuales un 87.5% correspondían a plantas sintomáticas, las restantes a plantas asintomáticas. Los resultados de PCR y ELISA de acuerdo al sitio de muestreo pueden observarse en el cuadro 6. 30 Cuadro 6. Porcentaje de muestras de sandía positivas a geminivirus y potyvirus por lugar de muestreo. Honduras. Enero-abril (2000). Lugar Muestras recolectadas Positivas a geminivirus (%) Positivas a potyvirus (%) Valle 20 15 20 Olancho 20 5 25 Total 40 10 22.5 Fuente: Guamán (2000). En sandía los resultados de PCR mostraron un 10% de geminivirus, de las cuales tres muestras fueron recolectadas en el Departamento de Valle y una en Olancho. La prueba de ELISA mostró un 22.5% de potyvirus en sandía, quedando un 67.5% de infecciones virales o patologías de etiología desconocida. En el estudio se concluyó que el grupo geminivirus constituye la problemática más común e importante en el cultivo de chile en las zonas muestreadas. Esto contrasta con el cultivo de sandía, donde los resultados sugirieron que las enfermedades virales del grupo potyvirus son más limitantes que las del grupo geminivirus en las dos zonas muestreadas. Se recomendó continuar el estudio de enfermedades virales en chile y sandía mediante pruebas de ELISA probando para otros grupos de virus en el caso de chile y para virus específicos dentro del grupo potyvirus en sandía para poder determinar los virus específicos presentes y la presencia de infecciones mixtas (Guamán, 2000). 2.4. GENERALIDADES SOBRE LOS PRINCIPALES VIRUS QUE AFECTAN AL CHILE, TOMATE Y CUCURBITACEAS A nivel mundial, se han reportado alrededor de 136 virus específicos afectando al cultivo de tomate (Lycopersicum esculentum), 49 al cultivo de chile (Capsicum sp.) y 27 a la sandía (Citrullus lanatus) (Anexo 5) (Brunt et al., 1996). 2.4.1 Potyvirus 31 Figura 1. Partículas de un potyvirus. Fuente: SANDER, D (2001). 2.4.1.1 “Watermelon mosaic virus 1” (WMV1) Virus del mosaico de la sandía 1. También conocido como Papaya ringspot virus tipo W (PRSV-W). El tipo P (PRSV-P) afecta a papaya y cucurbitáceas; el tipo W afecta a cucurbitáceas pero no a papaya (Zitter et al., 1998). Tipo de ácido nucleico: ARN de cadena simple Síntomas: El follaje de plantas infectadas presenta un mosaico verde, malformación, arrugamiento, ampollamiento, distorsión y estrechamiento de la lámina foliar. En el fruto causa malformaciones como protuberancias y excesivo crecimiento (Zitter et al., 1998). Distribución geográfica: Ha sido reportado en Estados Unidos, China, México, Honduras, el Caribe, Australia, Alemania, Francia, Italia, India y América del Sur. Rango de hospederos: Es reducido. Alrededor de 38 especies en 11 géneros de cucurbitáceas y dos especies de Chenopodiaceae, siendo los hospederos naturales de importancia económica el zapallo, sandía, pepino y melón (Brunt et al., 1996). Transmisión: Alrededor de 20 especies de áfidos en forma no persistente, incluyendo Myzus persicae y Aphis gossypii. Se transmite fácilmente mecánicamente y no se ha reportado transmisión por semilla. En regiones calientes el virus sobrevive fácilmente en cucurbitáceas silvestres (Melothria pendula, Momordica sp., y otras cucurbitáceas perennes) (Zitter et al., 1998). Manejo: • Manejo químico del vector: Uso de insecticidas y aceites para controlar áfidos pero aplicados en malezas hospederas (CATIE, 1993; Jones et al., 1997) para evitar la llegada de áfidos al cultivo porque una vez establecido el cultivo el áfido logra transmitir el virus antes de morir.5 5 Lastres, L. 2001. Eficiencia de los métodos de control de virus en cucurbitáceas. Choluteca, Honduras. (Comunicación personal). 32 • Prácticas culturales: Incorporación de residuos de cultivos anteriores. En lo posible evitar cultivos escalonados, de no ser posible, sembrar los cultivos escalonados de tal forma que el más viejo quede más alejado y en contra de la dirección del viento (Rueda, 2000). Uso de barreras vivas alrededor de la plantación que impida la llegada de áfidos a la plantación y donde éstos limpian su estilete. Control de malezas hospederas alrededor de la plantación antes de establecer el cultivo (Zitter et al., 1998). Desinfección de herramientas y manos del personal que realice labores en el cultivo como amarre y tutoreo, para evitar transmisión entre plantas (Contreras, 2001). • Resistencia genética: Se han identificado genes de resistencia en Cucumis sativus, C. melo y Cucurbita spp. y se han incorporado en cultivares comerciales. En sandía (Citrullus lanatus) no se han encontrado niveles satisfactorios de resistencia. El gen de la cubierta de proteína de WMV1 se ha introducido en la mayoría de cucurbitáceas (Zitter et al., 1998). 2.4.1.2 “Watermelon mosaic virus 2” (WMV2) Virus del mosaico de la sandía 2 Grupo: Potyvirus Tipo de ácido nucleico: ARN de cadena simple. Síntomas: En general en las hojas causa mosaico verde, anillos cloróticos, rugosidad, bandas verdes y malformación. En melón, pepino, calabaza, zapallo y sandía causa mosaicos y moteados y reducción en la producción de fruta y calidad. Algunos cultivares de Cucurbita pepo y Cucumis melo responden con síntomas muy severos en el follaje, similares a los ocasionados por Watermelon mosaic virus 1 y Zucchini yellow mosaic virus (Zitter et al, 1998). Distribución geográfica: Se ha reportado en todo el mundo. Rango de hospederos: Son susceptibles 160 especies dicotiledóneas en 23 familias, incluyendo cucurbitáceas. Ocurre naturalmente en varias leguminosas, malváceas, chenopodiaceas, plantas ornamentales y cultivadas (Zitter et al, 1998). Transmisión: Es transmitido por 29 especies de áfidos en forma no persistente incluyendo Myzus persicae. Es fácilmente transmitido mecánicamente y no hay evidencia de transmisión por semilla en cucurbitáceas y leguminosas (Brunt et al., 1996). Manejo: 33 • Manejo químico del vector: Uso de insecticidas y aceites para controlar áfidos pero aplicados en malezas hospederas (CATIE, 1993; Jones et al., 1997) para evitar la llegada de áfidos al cultivo porque una vez establecido el cultivo el áfido logra transmitir el virus antes de morir5. • Prácticas culturales: Incorporación de residuos de cultivos anteriores. En lo posible evitar cultivos escalonados, de no ser posible, sembrar los cultivos escalonados de tal forma que el más viejo quede más alejado y en contra de la dirección del viento (Rueda, 2000). Uso de barreras vivas alrededor de la plantación que impida la llegada de áfidos a la plantación y donde éstos limpian su estilete. Control de malezas hospederas alrededor de la plantación antes de establecer el cultivo (Zitter et al., 1996). Desinfección de herramientas y manos del personal que realice labores en el cultivo como amarre y tutoreo, para evitar transmisión entre plantas (Contreras, 2001). • Resistencia genética: El gen de la cubierta de proteína del WMV2 ha sido introducido en algunos cultivares de "squash". Se ha identificado resistencia en Cucumis sativus (Zitter et al., 1998). 2.4.1.3. “Zucchini yellow mosaic virus” (ZYMV) Virus del mosaico amarillo del zucchini Grupo: Potyvirus Tipo de ácido nucleico: ARN de cadena simple Síntomas: Son más afectados Cucurbita pepo, Cucumis melo y Citrullus lanatus. En las hojas se presentan mosaicos amarillentos, malformación severa, reducción extrema en el tamaño de la lámina foliar, necrosis, aspecto filiforme, achaparramiento, deformaciones severas de frutos y semillas; grietas longitudinales en los frutos de melón y sandía (Agrios, 1995). En los trópicos ZYMV está asociada con PRSV-W (Zitter et al, 1998). Distribución geográfica: Reportado en Francia, Italia, Marruecos, España, Alemania, Israel, Líbano, Estados Unidos, Egypto, Australia, Algeria, Turquía, Japón, Jordán, Taiwan y Las islas Mauricio (Brunt et al., 1996). Rango de hospederos: Incluye miembros de las familias Aizoaceae, Amaranthaceae, Apiaceae, Asteraceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cucurbitaceae, Labiatae, Leguminosae, Ranunculaceae, Scrophulariceae, Solanaceae y Umbelliferae (Zitter et al, 1998). Transmisión: Se transmite por 38 especies de áfidos en forma no persistente, incluyendo Aphis citricola Patch, A. gossypii, Macrosiphum euphorbiae y Myzus persicae. Se 34 transmite fácilmente mecánicamente y hay cierta evidencia de transmisión por semilla pero ha sido muy difícil probar (Plumb et al, 2000). Manejo: • Manejo químico del vector: Uso de insecticidas y aceites para controlar áfidos pero aplicados en malezas hospederas (CATIE, 1993; Jones et al., 1997) para evitar la llegada de áfidos al cultivo porque una vez establecido el cultivo el áfido logra transmitir el virus antes de morir5. • Prácticas culturales: Incorporación de residuos de cultivos anteriores. En lo posible evitar cultivos escalonados, de no ser posible, sembrar los cultivos escalonados de tal forma que el más viejo quede más alejado y en contra de la dirección del viento (Rueda, 2000). Uso de barreras vivas alrededor de la plantación que impida la llegada de áfidos a la plantación y donde éstos limpian su estilete. Control de malezas hospederas alrededor de la plantación antes de establecer el cultivo (Zitter et al., 1996). Desinfección de herramientas y manos del personal que realice labores en el cultivo como amarre y tutoreo, para evitar transmisión entre plantas (Contreras, 2001). • Resistencia genética: Se ha encontrado resistencia en líneas chinas de Cucumis sativus y C. melo de India. Todos los cultivares comerciales de Citrullus lanatus son susceptibles, pero la resistencia es disponible en algunos C. colocynthis de Nigeria. Se ha encontrado un nivel muy alto de resistencia en algunas razas de C. lanatus de Zimbabwe. Recientemente, líneas nuevas de "squash", melón y pepino se les ha introducido el gen de la cubierta de proteína de ZYMV (Zitter et al., 1998). 2.4.1.4 “Pepper mottle virus” (PeMoV) Virus del moteado del chile Grupo: Potyvirus Tipo de ácido nucleico: ARN de cadena simple Síntomas: En la hoja causa severos moteados, deformación y las venas se vuelven más verdes. En Capsicum frutescens (chile tabasco) causa anillos necróticos en el tallo y hojas produciendo un nuevo crecimiento distorsionado con mosaico (Black et al, 1991). Distribución geográfica: El Salvador, India y es común en zonas de los Estados Unidos como Florida, Nuevo México, Texas, Arizona y California (Brunt et al., 1996). Rango de hospederos: Es reducido. Aparentemente reducido a la familia Solanaceae, especialmente Capsicum y Nicotiana (Black et al., 1991) y afecta también a Lycopersicum. 35 Transmisión: En forma no persistente por varias especies de áfidos, incluyendo Aphis gossypii, A. craccivora, Myzus persicae. Transmitido por inoculación mecánica y por injerto; no se transmite por contacto entre plantas y no se transmite por semilla (Brunt et al., 1996). Manejo: • Manejo químico del vector: Uso de insecticidas y aceites para controlar áfidos aplicados en malezas hospederas cuando éstas no pueden eliminarse (CATIE, 1993; Jones et al., 1997) para evitar la llegada de áfidos al cultivo, cuando los áfidos están en el cultivo no es efectivo. Uso de cultivos trampa donde se realicen aplicaciones de insecticidas para controlar áfidos (CATIE, 1993). • Prácticas culturales: Uso de barreras vivas alrededor de la plantación que impida la llegada de áfidos a la plantación y donde éstos limpian su estilete. Control de malezas hospederas alrededor de la plantación antes de establecer el cultivo. En lo posible sembrar alejado de lotes viejos e incorporar rastrojos de cultivos anteriores. En lo posible sembrar en áreas con baja incidencia de áfidos y reservorios del virus (Jones et al., 1997). 2.4.1.5 “Tobacco etch virus” (TEV) Virus del grabado del tabaco Grupo: Potyvirus Tipo de ácido nucleico: ARN de cadena simple. Síntomas: En las hojas causa un mosaico, bandas de color verde grisáceo en las venas, deformación, abultamiento en hojas y venas; enanismo de la planta, los frutos se deforman y tienen zonas amarillas con manchas o franjas (CATIE, 1993). En Capsicum frutescens (chile tabasco) las plantas se marchitan y mueren 1-2 semanas después de la infección por el virus (Black et al., 1991). Distribución geográfica: América (Canadá, México, Puerto Rico, Estados Unidos), China y el Sudeste de Asia. Ha ocasionado grandes pérdidas en tomate en Venezuela y el sur de Florida (Jones et al., 1997). Rango de hospederos: Alrededor de 120 especies en 19 familias de dicotiledóneas son susceptibles. Es más común en Solanáceas, especialmente tomate, chile y tabaco. Las malezas más importantes que sirven como fuente de inóculo del virus son Solanum nigrum, S. aracile, Physalis arguluta,, P. aranicola, P. aliosa y Chenopodium album (Black et al., 1991). . 36 Transmisión: Se transmite por más de 10 especies de áfidos en forma no persistente especialmente Myzus persicae. Se transmite por inoculación mecánica y no se transmite por semilla (CATIE, 1993). Manejo: • Manejo químico del vector: Uso de insecticidas y aceites para controlar áfidos aplicados en malezas hospederas cuando éstas no pueden eliminarse (CATIE, 1993; Jones et al., 1997) para evitar la llegada de áfidos al cultivo porque una vez presentes áfidos en la plantación no es efectivo. Uso de cultivos trampa donde se realicen aplicaciones de insecticidas para controlar áfidos (CATIE, 1993). • Prácticas culturales: Uso de barreras vivas alrededor de la plantación que impida la llegada de áfidos a la plantación y donde éstos limpian su estilete. Control de malezas hospederas alrededor de la plantación antes de establecer el cultivo. En lo posible sembrar alejado de lotes viejos e incorporar rastrojos de cultivos anteriores. En lo posible sembrar en áreas con baja incidencia de áfidos y reservorios del virus (Jones et al., 1997). Desinfección de herramientas y manos del personal al realizar labores de manipuleo de plantas como amarre para evitar la transmisión entre plantas (CATIE, 1990). 2.4.1.6 “Potato virus Y” (PVY) Virus “Y” de la papa Grupo: Potyvirus Tipo de ácido nucleico: ARN de cadena simple Síntomas: Ocasiona achaparramiento de la planta con un moteado generalizado, áreas amarillas y verdes de diferentes tonalidades, abultamiento de hojas y venas, una leve distorsión; los frutos se deforman y tienen zonas amarillas con franjas o manchas (CATIE, 1993). En ocasiones las hojas se enrollan hacia abajo (Jones et al., 1997). Distribución geográfica: Se ha reportado en todo el mundo. Causa grandes problemas en la producción de tomate en el Sur de Florida, Guadeloupe, Australia, Taiwan, Argentina, Francia y varios países mediterráneos (Jones et al., 1997). El PVY es considerado el virus más diseminado e importante en Centroamérica, afectando al chile (CATIE, 1993). Rango de hospederos: Es reducido a las solanáceas como tomate, chile, papa y tabaco, pero algunos miembros de las familias Amaranthaceae, Chenopodiaceae, Compositae y Leguminosae son susceptibles (Jones et al., 1997). El PVY es capaz de infectar sistémicamente a Chenopodium amaranticolor y Datura stramonium.(CATIE, 1993). 37 Transmisión: Por áfidos en forma no persistente, principalmente: Myzus persicae, Aphis gossypii, Macrosiphum euphorbiae y A. nasturtii; también se transmite por el ácaro Tetranychus telarius (CATIE, 1990). Se transmite mecánicamente y no se transmite por semilla. Manejo: • Manejo químico del vector: Uso de insecticidas y aceites para controlar áfidos aplicados en malezas hospederas cuando éstas no pueden eliminarse (CATIE, 1993; Jones et al., 1997) para evitar la llegada de áfidos al cultivo. Uso de cultivos trampa donde se realicen aplicaciones de insecticidas para controlar áfidos (CATIE, 1993). • Prácticas culturales: Uso de barreras vivas alrededor de la plantación que impida la llegada de áfidos a la plantación y donde éstos limpian su estilete. Control de malezas hospederas alrededor de la plantación antes de establecer el cultivo. En lo posible sembrar alejado de lotes viejos e incorporar rastrojos de cultivos anteriores. En lo posible sembrar en áreas con baja incidencia de áfidos y reservorios del virus (Jones et al., 1997). Desinfectar herramientas y manos del personal que realice labores de manipuleo de plantas como amarre para evitar la transmisión entre plantas (CATIE, 1990). 2.4.2. Geminivirus Figura 2. Partículas de un geminivirus. Fuente: Ramírez y Bustamante (1996). 2.4.2.1. "Tomato yellow leaf curl virus" (TYLCV) Virus de las hojas amarillas en cuchara del tomate Grupo: Geminivirus Tipo de ácido nucleico: ADN de cadena simple. Síntomas: En las hojas causa márgenes cloróticos, enanismo, acucharamiento y engrosamiento del tejido produciendo rigidez. En general causa enanismo y brotes 38 terminales "arrepollados". En el fruto produce bajo cuajado por la absición de flores (Spraytec, 1999). Distribución geográfica: Se ha reportado en varios países de la cuenca del Mediterráneo, incluyendo Israel, Irak, Líbano, Jordania, Arabia Saudita, Nigeria, Tunisia, Turquía, Túnez, Senegal, Sudán, Egipto, Kuwait. Se ha reportado también en Cuba, República Dominicana, Jamaica y recientemente en Portugal, España y Florida (USA) (Brunt et al., 1996; Polston y Anderson, 1997; Anderson, 1998). Rango de hospederos: Incluye las familias Solanaceae, Compositae, Leguminosae- Papilionoidae, Malvaceae y Asclepiadaceae. Entre los hospederos naturales se encuentran: Datura stramonium, Nicotiana glutinosa, N. benthamiana y Phaseolus vulgaris, Lycopersicum esculentum, Malva parviflora y Cynanchum acutum (Brunt et al., 1996). Transmisión: Por el insecto Bemisia argentifolii en forma persistente, (Perring & Bellows) (Polston et al., 1994). Recientes estudios demuestran que puede ser transmitido a los huevecillos de mosca blanca por lo menos dos generaciones (Czosnek y Laterrot, 1997; citado por Guerra, 2000). Se transmite por inoculación mecánica y por injerto. No se transmite por contacto entre plantas (Brunt et al., 1996). Manejo: • Manejo químico del vector: Evitar la llegada de mosca blanca a la plantación con aplicaciones de insecticidas como Imidacloprid en cultivos aledaños o malezas hospederas (Anderson, 1998). Siembra de cultivos atrayentes en los bordes y aplicaciones de insecticidas en éstos para controlar mosca blanca (Sponagel y Fúnez, 1994). • Prácticas culturales: Incorporación de rastrojos de cultivos anteriores y eliminación de malezas hospederas antes de establecer la plantación; uso de plástico reflector, trampas pegajosas, siembra en invernaderos en lo posible (Anderson, 1998), evitar la siembra directa, en lo posible transplantar plántulas sanas y vigorosas, inicio de la siembra en la última posición contra el viento, siembra en alta densidad, rotación con cultivos no hospederos de mosca blanca, establecer un período libre de siembra y coordinar la siembra con las épocas de baja presencia de mosca blanca (Sponagel y Fúnez, 1994). • Resistencia genética: Existen variedades de tomate con tolerancia a TYLCV adaptadas al Mediterráneo (Anderson, 1998). 2.4.2.2"Chino del tomate" (CdTV) Grupo: Geminivirus Tipo de ácido nucleico: ADN de cadena simple 39 Síntomas: En chile causa un ligero mosaico y distorsión ligera de la hoja, pero a veces no expresa síntomas (Black et al., 1991), también causa arrugamiento y caída de pecíolos y frutos. En tomate causa moteado, amarillamiento y enrollamiento de la hoja (Brunt et al., 1996). El virus chino del tomate (CdTV) junto con el virus leve del tigre del chile (PMTV) y otros virus que no han sido caracterizados forman el complejo que causa la enfermedad conocida como "tiger disease" identificada en México (Black et al., 1991) y el sur de Texas (Brunt et al., 1996). Distribución geográfica: Se ha reportado en México y Estados Unidos (Brunt et al., 1996). Rango de hospederos: Incluyen Lycopersicum esculentum, Capsicum spp., Datura stramonium, Malva parviflora, Nicotiana sp, Phaseolus vulgaris (Brunt et al., 1996). Transmisión: Por Bemisia tabaci (Aleyrodidae) en forma persistente. El virus no se multiplica en el vector ni se transmite a la progenie del vector; se transmite por injerto. No se transmite por inoculación mecánica, por contacto entre plantas, ni por semilla (Brunt et al., 1996). Manejo: • Manejo químico del vector: Evitar la llegada de mosca blanca a la plantación, controlando en las malezas hospederas y en los alrededores del cultivo. Se obtienen controles satisfactorios con productos como Imidacloprid, fepropatrín, metomilo y endosulfán. • Prácticas culturales: Incorporación de rastrojos de cultivos anteriores, eliminación de malezas hospederas antes de establecer la plantación; uso de plástico reflector, trampas pegajosas, siembra en invernaderos en lo posible (Anderson, 1998), evitar la siembra directa, en lo posible transplantar plántulas sanas y vigorosas, inicio de la siembra en la última posición contra el viento, siembra en alta densidad, rotación con cultivos no hospederos de mosca blanca, establecer un período libre de siembra y coordinar la siembra con las épocas de baja presencia de mosca blanca (Sponagel y Fúnez, 1994). 2.4.2.3 "Tomato mosaic Havana virus" Virus del tomate de la Havana Grupo: Geminivirus Tipo de ácido nucleico: ADN de cadena simple. Síntomas: Enrollamiento y amarillamiento de las hojas en tomate (Brown y Wyatt, 19971). 40 Distribución geográfica: Cuba. Recientemente reportado en Honduras (Maxwell, 2001). Rango de hospederos: Lycopersicum esculentum (Brown y Wyatt, 19971). Transmisión: Transmitido por un insecto vector, mosca blanca (Bemisia tabaci) en forma persistente (Martínez et al., 1999). Manejo: • Manejo químico del vector: Evitar la llegada de mosca blanca a la plantación con aplicaciones de insecticidas como Imidacloprid en cultivos aledaños o malezas hospederas (Anderson, 1998). Siembra de cultivos atrayentes en los bordes y uso de insecticidas para la mosca blanca (Sponagel y Fúnez, 1994). • Prácticas culturales: Incorporación de rastrojos de cultivos anteriores y eliminación de plantas hospederas antes de establecer la plantación, uso de plástico reflector, trampas pegajosas, siembra en invernaderos en lo posible (Anderson, 1998), evitar la siembra directa, en lo posible transplantar plántulas sanas y vigorosas, inicio de la siembra en la última posición contra el viento, siembra en alta densidad, rotación con cultivos no hospederos de mosca blanca, establecer un período libre de siembra y coordinar la siembra con las épocas de baja presencia de mosca blanca (Sponagel y Fúnez, 1994). 2.4.2.4 "Pepper Texas virus" Virus del chile de Texas Grupo: Geminivirus Tipo de ácido nucleico: ADN de cadena simple. Síntomas: enrollamiento, deformación de la hoja, aclaramiento de las venas y disminución en el crecimiento (Brunt et al., 1996). Distribución geográfica: Se ha reportado en México y Estados Unidos (Brunt et al., 1996). Rango de hospederos: Capsicum annuum (chile), Datura stramonium, Lycopersicum esculentum (tomate), Nicotiana benthamiana, Nicotiana clevelandii, Nicotiana rustica y Nicotiana tabacum (Brunt et al., 1996). Transmisión: Transmitido por un vector, mosca blanca (Bemisia tabaci) en forma persistente; se transmite por inoculación mecánica, por injerto, no se transmite por semilla, por contacto entre plantas o por polen (Brunt et al., 1996). 41 Manejo: • Manejo químico del vector: Evitar la llegada de mosca blanca a la plantación con aplicaciones de insecticidas como Imidacloprid en cultivos aledaños o malezas hospederas (Anderson, 1998). Siembra de cultivos atrayentes en los bordes y uso de insecticidas para la mosca blanca (Sponagel y Fúnez, 1994). • Prácticas culturales: Incorporación de rastrojos de cultivos anteriores y eliminación de plantas hospederas antes de establecer la plantación, uso de plástico reflector, trampas pegajosas, siembra en invernaderos en lo posible (Anderson, 1998), evitar la siembra directa, en lo posible transplantar plántulas sanas y vigorosas, inicio de la siembra en la última posición contra el viento, siembra en alta densidad, rotación con cultivos no hospederos de mosca blanca, establecer un período libre de siembra y coordinar la siembra con las épocas de baja presencia de mosca blanca (Sponagel y Fúnez, 1994). 2.4.3 Cucumovirus Figura 3. Particulas de un cucumovirus Fuente: Green y Kim, 1991. 2.4.3.1“Cucumber mosaic virus” (CMV) Virus del mosaico del pepino Grupo: Cucumovirus. Tipo de ácido nucleico: ARN de cadena simple. Síntomas: La sintomatología es extremadamente variable. Los síntomas se manifiestan 3-4 semanas después de la infección (Contreras, 2001). En chile uno de los síntomas más comunes es una disminución en el crecimiento, un leve aclaramiento de la hoja con una apariencia cueruda, sin lesiones foliares. También puede observarse un estrechamiento de las hojas, mosaico, amarillamiento y anillos cloróticos o necróticos. En el fruto 42 pueden observarse anillos necróticos o cloróticos, superficie áspera y distorsión (Black et al., 1991). En tomate se observa mosaico, reducción en el crecimiento y en la lámina foliar (Brunt et al., 1996). Las hojas pueden mostrar un moteado similar al causado por el virus del mosaico del tabaco (Jones et al., 1997). En cucurbitáceas como melón, pepino y "squash" se observa un moteado, deformación, arrugamiento de hojas y los bordes se enrollan hacia abajo (Agrios, 1995). Hay una disminución drástica en el crecimiento, los entrenudos y pecíolos del tallo se acortan y las hojas se desarrollan la mitad del tamaño normal; forman pocos estolones, flores y frutos. En el fruto se observan áreas blancas o verde pálido mezclado con áreas en relieve de color verde oscuro, hay deformación y ablandamiento. La intensidad de los síntomas depende de la especie y el cultivar infectado, la edad de las plantas y las condiciones ambientales. Los síntomas más severos se observan en calabaza (“squash”) y melón y son menos severos en pepino y sandía (Zitter et al., 1998). Distribución geográfica: Se ha reportado en todo el mundo, sin embargo es más común en regiones templadas del mundo (Jones et al., 1997). Rango de hospederos: Afecta alrededor de 2000 especies incluyendo monocotiledóneas y dicotiledóneas, cultivos y malezas (Contreras, 2001). El rango de hospederos incluye tomate, chile y cucurbitáceas (Zitter et al., 1998). Transmisión: Alrededor de 60 especies de áfidos, incluyendo Myzus persicae, Acyrthosiphon pisum, Aphis craccivora en forma no persistente. Es transmitido fácilmente en forma mecánica, no se ha reportado transmisión por semilla (Brunt et al., 1996; Zitter et al., 1998). Manejo: • Manejo químico del vector: Uso de insecticidas y aceites para controlar áfidos pero aplicados en malezas hospederas (CATIE, 1993; Jones et al., 1997) para evitar la llegada de áfidos al cultivo porque una vez establecido el cultivo el áfido logra transmitir el virus antes de morir5. • Prácticas culturales: Incorporación de residuos de cultivos anteriores. En lo posible evitar cultivos escalonados. Si no es posible, sembrar los cultivos escalonados de tal forma que el más viejo quede más alejado y en contra de la dirección del viento (Rueda, 2000). Uso de barreras vivas alrededor de la plantación que impida la llegada de áfidos a la plantación y donde éstos limpian su estilete. Control de malezas hospederas alrededor de la plantación antes de establecer el cultivo (Zitter et al., 1998). Desinfección de herramientas y manos del personal que realice labores en el cultivo como amarre y tutoreo, para evitar transmisión entre plantas (Contreras, 2001). 43 • Resistencia genética: Existen cultivares resistentes a CMV en pepino, en Estados Unidos, cuya resistencia se deriva de cultivares chinos. En melón la resistencia se deriva de melones japoneses, Koreanos y chinos. La sandía usualmente es resistente a CMV pero ocasionalmente se ve afectada. La cubierta de proteína del CMV se ha introducido en pepino, melón y calabaza, brindándoles un buen nivel de resistencia a CMV (Zitter et al., 1998). 2.4.4 Tospovirus Figura 4. Partículas de un Tospovirus. Fuente: Green y Kim, 1991. 2.4.4.1. “Tomato spotted wilt virus” (TSWV) Virus de la marchitez manchada del tomate Grupo: Tospovirus. Tipo de ácido nucleico: ARN de cadena simple Síntomas: Son muy variables, generalmente las hojas jóvenes toman un color bronceado y luego aparecen muchas manchas pequeñas grises, moteado, deformación y amarillamiento de venas. Los ápices en crecimiento se caen, observándose marchitez en la planta, en el fruto causa manchas anulares cloróticas (Jones et al., 1997). Distribución geográfica: Se ha reportado en todo el mundo, es más común en regiones templadas y subtropicales. Ha causado grandes pérdidas en tomate en Australia, Argentina, Hawaii, Arkansas, Florida, Alabama, Georgia y Tennessee (Jones et al., 1997). Rango de hospederos: Es muy amplio, se ha reportado en 166 especies en 34 familias, incluyendo 7 familias monocotiledóneas. Incluye Lycopersicon esculentum, Capsicum annuum, Bidens pilosa, Datura stramonium, Malva parviflora, Nicandra physalodes, Phaseolus vulgaris, entre otros (Brunt et al., 1996). 44 Transmisión: Se transmite por Thrips tabaci, T. setosus, T. parmi, Frankiniella schultzei, F. occidentalis, F. fusca y Scirtothrips dorsalis, en forma persistente. El virus es adquirido por la larva, no por adultos, pero solo los adultos lo transmiten cuando se alimentan de plantas infectadas en el estado larval; no transmiten el virus a la progenie. Se transmite por inoculación mecánica, por injerto, no se transmite por contacto entre plantas, por semilla ni por polen (Brunt et al., 1996). Manejo: • Manejo químico del vector: Aplicaciones de insecticidas para controlar thrips no son efectivas porque el vector logra transmitir el virus antes de morir (Jones et al., 1997). • Prácticas culturales: No se han encontrado estrategias efectivas de control (Davis et al., 1996). 3. MATERIALES Y METODOS 45 Entre marzo y junio de 2001 correspondiente a la época seca se recolectaron muestras de tejido foliar con síntomas virales de los cultivos de chile, tomate, sandía y varias malezas asociadas a las plantaciones o cercanas a las mismas en las principales zonas de producción de estos cultivos en Honduras. Las muestras se analizaron para varios grupos de virus. Para diagnosticar geminivirus se utilizó la técnica de PCR y electroforesis; para el diagnóstico de potyvirus, virus del mosaico del pepino ("Cucumber mosaic virus") (CMV) y el virus de la marchitez manchada del tomate ("Tomato spotted wilt virus") (TSWV) se utilizó la técnica de ELISA. 3.1 DIAGNOSTICO PRELIMINAR Entre febrero de 2001 correspondiente a la época seca, se realizó un muestreo preliminar con el objetivo de tener una idea de los virus presentes en Honduras, para decidir la compra de "kits" comerciales para la prueba ELISA, específicos para cada virus, para utilizarlos con las muestras a recolectarse en el estudio de marzo a junio de 2001. Para esto, se recolectaron 8 muestras de tomate de distintas variedades de la finca experimental de FHIA (Fundación Hondureña de Investigación Agrícola) en Comayagua, 19 muestras de chile, 3 recolectadas en la finca de FHIA, 1 fruto proveniente de Nicaragua, 7 en "Chesnut Hill Farms", 9 muestras recolectadas en "Chestnut Hill Farms" y Zamorano entre enero y abril de 2000 como parte del estudio de J.L. Guamán, 1 muestra de melón recolectada en FHIA, Comayagua; 10 muestras de sandía recolectadas en Choluteca, por personal de FHIA y 1 muestra de melón recolectada en la finca de FHIA en Comayagua. Las muestras se enviaron al laboratorio comercial AGDIA (USA) solicitando el diagnóstico para los siguientes virus (cuadro 7) Cuadro 7 .Virus específicos seleccionados para diagnóstico en AGDIA a muestras de chile, tomate, sandía y melón. USA. Febrero (2001). CHILE TOMATE SANDIA Y MELON “Cucumber mosaic virus” “Potato Leaf Roll virus” “Cucumber Mosaic Virus” “Pepper Mild Mottle Virus” “Potato virus Y” “Papaya Ringspot Virus” “Potato Virus Y” “Potyvirus group” “Potato Virus Y” “Potyvirus group” “Tobacco Etch virus” “Potyvirus group” 46 “Tobacco Etch Virus” “Tobacco Mosaic Virus” “Tobacco Etch Virus” “Tobacco Mosaic Virus” “Tobacco Rattle Virus” “Tobacco Mosaic Virus” “Tobacco Rattle Virus” “Tobacco Ringspot Virus” “Tobacco Ringspot Virus” “Tobacco Ringspot Virus” “Tomato Mosaic Virus” “Tomato Ringspot Virus” “Tomato Spotted Wilt Virus” “Tomato Ringspot Virus” “Tomato Spotted Wilt Virus” “Tomato Spotted Wilt Virus” “Watermelon Mosaic Virus 2” “Zucchini Yellow Mosaic Virus” 3.2 MUESTREO 3.2.1 Cultivos muestreados y su ubicación Entre marzo y junio del 2001, correspondiente a la estación seca, se recolectaron 204 muestras de plantas con síntomas virales incluyendo los cultivos de tomate, chile, sandía y malezas asociadas a estos cultivos y/o que se encontraban cerca de las plantaciones, en las principales zonas de producción de esos cultivos en Honduras. En la mayoría de las plantaciones se midió visualmente y en porcentaje datos de incidencia y severidad de las infecciones virales afectando al cultivo, considerando la incidencia como el porcentaje de plantas con síntomas virales en una plantación y, severidad haciendo un promedio por plantación en la escala de severidad alta, moderada o baja. En el cuadro 8 se encuentra la distribución de las muestras de acuerdo a la cantidad, cultivo y lugar donde fueron recolectadas y en el cuadro 9 se mencionan otros cultivos muestreados ocasionalmente en el estudio. Cuadro 8. Cantidad de muestras de chile, tomate y sandía recolectadas de acuerdo al cultivo y lugar de muestreo. Honduras. Marzo-junio (2001). Cultivo Lugar # de muestras Chile Comayagua 33 Copán 9 Choluteca (Azacualpa) 8 Choluteca (Yusguare) 12 Valle 8 47 Zamorano 14 Subtotal 84 Tomate Comayagua 2 Choluteca (San Marcos) 13 Guinope 9 Zamorano 7 Subtotal 31 Sandía Choluteca (Azacualpa) 2 Choluteca 9 Copán 2 Olancho 15 Valle 16 Subtotal 44 Total de muestras 159 Cuadro 9 Otros cultivos recolectados de acuerdo al lugar de muestreo. Honduras. Marzo-junio (2001). Otros cultivos Lugar de muestreo Número de muestras Berenjena Comayagua 1 Melón Choluteca 2 Valle 2 Okra china Comayagua 1 Pepino Zamorano 1 Pepino peludo Comayagua 1 Total 8 Las muestras de melón se encontraban como malezas en plantaciones de sandía en Valle y alrededor de plantaciones de tomate en Choluteca. Las muestras de berenjena, pepino, okra china y pepino peludo se encontraban en plantaciones propias (cuadro 9). Las plantaciones visitadas fueron de pequeños productores que tenían en promedio 0.5 ha, a excepción de las fincas de “Chestnut Hill” en Comayagua cuya área muestreada aproximadamente fue de 10 ha de chile jalapeño. Todas las malezas recolectadas presentaban síntomas virales. 3.2.2 Recolección e identificación de las muestras 48 En cada plantación se identificaron visualmente plantas con sintomatología viral, mostrando uno o varios de los siguientes síntomas: mosaico, moteado, arrugamiento, deformación, achaparramiento, clorosis o amarillamiento entre otros, de las hojas y la planta. La recolección del material vegetal se hizo usando la bolsa como guante para evitar contaminación de savia entre plantas; se recolectó material vegetal joven seleccionando los brotes terminales con síntomas virales en crecimiento activo y que no mostraran daño por otro patógeno no viral. Las muestras se guardaron en una hielera hasta llegar a Zamorano, donde se almacenaron a 4ºC. Las muestras con síntomas más representativos se fotografiaron. A las muestras se les asignó la nomenclatura usada en el laboratorio de diagnóstico de Zamorano. Por ejemplo: la muestra 3CNC-280 significa: 3 = el año de estudio desde que empezó el proyecto CN = Comayagua norte (el lugar de recolección) C = el cultivo, chile. 280 = el número correlativo de muestra recolectada en el proyecto. Las muestras de chile y sandía de Copán, chile y sandía de Choluteca localidad Azacualpa, las muestras de tomate, berenjena, okra china y pepino peludo de Comayagua fueron recolectadas y traídas al laboratorio por la Ing. Lorena Lastres. La identificación de las malezas se hizo con la ayuda de la Ing. L. Lastres. En el Anexo 6 se encuentra la descripción de las muestras de acuerdo al cultivo y lugar. 3.3 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS EN EL LABORATORIO 3.3.1 Preservación del tejido foliar Una parte de cada muestra fue cortada en pedazos pequeños desinfectando las herramientas entre muestras con cloro y agua destilada para evitar contaminación. El tejido fue envuelto en papel toalla, sellado con cinta adhesiva, numerado y almacenado a 4 °C en bolsas plásticas conteniendo sílica gel, renovando la sílica de acuerdo a la necesidad. Esto se realizó con el fin de secar el tejido y evitar necrosis de las muestras, como un método de preservación en seco, para su posterior utilización en las pruebas ELISA. Cada muestra fue dividida, la otra parte de cada muestra se utilizó como tejido foliar fresco para el diagnóstico de geminivirus mediante la extracción y purificación de ADN. 3.3.2 Diagnóstico de virus de ADN : geminivirus 3.3.2.1 Método de extracción y purificación de ADN Se extrajo el ADN de todas las muestras, para determinar el porcentaje de infección causada por geminivirus. Para realizar la extracción y purificación de ADN se utilizó el protocolo de ADN total (planta y viral) de Doyle & Doyle. (Anexo 1). 49 3.3.2.2 Método de amplificación de ADN Para la amplificación del ADN de geminivirus a partir del ADN total (planta y viral) extraído, se utilizó la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa, más conocida por sus siglas en inglés como PCR (“Polymerase Chain Reaction”), cuyo principio fundamental es la amplificación de un fragmento específico de ADN a través de ciclos sucesivos de temperatura y tiempo determinados, hasta obtener suficiente producto para ser visualizado (Harris, 1998). Para la detección y amplificación de geminivirus en este estudio, se utilizaron los "primers" AV 514 y AC 1048 para geminivirus universal. También se utilizaron perlas de PCR (Amersham Pharmacia Biotech, Inc.) conteniendo ~ 1.5 unidades de Taq ADN Polimerasa, 10mM Tris-HCl (pH 9.0), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 µM de cada dNTP (bases nitrogenadas) y estabilizadores, incluyendo ASB (Albúmina de suero bovino). Cada perla se reconstituyó en 24 µl de agua destilada estéril y 0.5 µl de cada primer para obtener un volumen final de 25 µl. Cada perla reconstituida se dividió en dos partes, transfiriendo 12.5 µl a otro tubo. A cada tubo se agregó 1.0 µl de ADN de una muestra respectiva, esto con el fin de utilizar una perla para dos pruebas. La amplificación de ADN fue realizada en un termociclador (Perkin Elmer 480) durante 30 ciclos, donde cada ciclo consta de tres fases. Inicialmente se somete a un ciclo de desnaturalización o separación preliminar conocido como “hot start” a 94 ºC durante 3 minutos. Se incluye un diagrama mostrando las fases de la reacción (Anexo 2). 1. Fase de desnaturalización: 94 ºC durante 1 minuto. A esa temperatura se separa la molécula doble de ADN en dos cadenas sencillas, que servirán como molde para la síntesis del fragmento específico. 2. Fase de ligamiento: 58 ºC durante 1 minuto. En esta etapa la temperatura se reduce para permitir el alineamiento de los “primers” en la región común de las cadenas de ADN molde. 3. Fase de extensión: 72 °C durante 1 minuto. En esta etapa la enzima Taq polimerasa realiza la extensión de los “primers” haciendo una copia completa del ADN viral. Al final existe un ciclo de extensión prolongada a 72 °C durante 5 minutos. Al final del primer ciclo se obtiene el doble del ADN viral, al realizarse durante 30 ciclos permite aumentar de manera exponencial la cantidad de ADN viral, acumulándose alrededor de 106 a 108 moléculas de ADN, las cuales pueden ser visualizadas en una gel de agarosa (Moctezuma y Kahl, 2000). Además de las muestras se amplificó un control positivo y uno negativo de geminivirus de tomate de Zamorano con la nomenclatura Inv F2 (Invernadero F2) y HP5 respectivamente. 50 3.3.2.3. Método de electroforesis El producto de PCR se analizó por el método de electroforesis. Esta técnica se basa en la separación de moléculas de ADN de acuerdo a su tamaño y peso molecular a través de una matriz semisólida (gel de agarosa o poliacrilamida) mediante la aplicación de un campo eléctrico. La movilidad del ADN a través de la matriz está en función de la carga negativa del ADN, por lo que los fragmentos migrarán hacia el polo positivo del tanque de electroforesis y la velocidad de migración dependerá del tamaño y forma de la partícula (Moctezuma y Kahl, 2000). Se utilizaron geles de agarosa al 0.75%, éstas fueron colocadas en un tanque de electroforesis (Hoefer HE 33), cargadas con 6 ul de muestra por pozo, colocando además de las muestras un marcador molecular (ADN de diferentes tamaños específicos), un control positivo y uno negativo (amplificados previamente) para asegurar resultados confiables. Las geles se corrieron a 80 voltios utilizando una fuente de poder (Bio-Rad 1000/500) aproximadamente por 60 minutos. Para poder visualizar las bandas de ADN en las geles, éstas fueron teñidas con una solución de 1mg/ml de bromuro de etidio durante 15 minutos. El bromuro de etidio es un colorante cancerígeno que tiene la capacidad de intercalarse entre los pares de bases de la doble cadena de ADN y fluorecer bajo luz ultravioleta (Moctezuma y Kahl, 2000). Luego las geles fueron desteñidas en agua durante 15 minutos, observadas en un transiluminador de rayos ultravioleta (UVP) y fotografiadas con una cámara Polaroid (DS34). 3.3.3 Diagnóstico de virus de ARN 3.3.3.1 Pruebas ELISA La prueba ELISA permite detectar un virus en una planta por la identificación de la proteína viral, se realiza en un soporte sólido (placas microtituladoras de poliestiereno) y se basa en el reconocimiento del antígeno (virus) por un anticuerpo específico y la unión de este complejo con una enzima (fosfatasa alcalina), con la que se tiene un conjugado que retiene simultáneamente la actividad inmunológica y enzimática de los componentes. Si los anticuerpos específicos se unen con su respectivos antígenos se produce una reacción la cual puede ser visible observándose la presencia de un color amarillo (Castaño-Zapata, 1994) (Anexo 4). Se compraron “Kits” comerciales para grupo Potyvirus, “cucumber mosaic virus” y “tomato spotted wilt virus”. Las 204 muestras (tomate, chile, sandía y malezas) recolectadas entre marzo y junio del 2001, fueron probadas para grupo potyvirus y el “cucumber mosaic virus” (CMV) (virus del mosaico del pepino), usando la técnica de ELISA. Se seleccionaron 92 muestras entre chile y tomate las que se probaron para el “Tomato spotted wilt virus” (TSWV) (virus de la marchitez manchada del tomate). Para 51 la prueba de ELISA se siguió el protocolo proporcionado en cada “Kit” comercial de AGDIA (Anexo 3). Los resultados fueron evaluados visualmente y utilizando un lector Bio-Tek Instruments EL311 de platos de microtitulación. 4. RESULTADOS Y DISCUSION 52 4.1 RESULTADOS DEL DIAGNOSTICO PRELIMINAR 4.1.1 Resultados del diagnóstico preliminar en tomate Tres muestras de tomate (33%) se diagnosticaron positivas a geminivirus. Las 9 muestras de tomate se diagnosticaron negativas a todos los virus probados mediante la prueba de ELISA. 4.1.2 Resultados del diagnóstico preliminar en chile De las 19 muestras de chile, nueve (47%) se diagnosticaron positivas a geminivirus. Solamente dos muestras foliares de chile recolectadas en la finca de “Chestnut Hill” y un fruto traído de Nicaragua se diagnosticaron positivas a grupo potyvirus y al “Pepper mottle vir