Evaluación de los aceites esenciales (Alfa Pineno y Limonene) contra el crecimiento de Staphylococcus aureus productores de enterotoxinas in vitro Donaldo Enrique Cruz Villeda Escuela Agrícola Panamericana Zamorano, Honduras Octubre, 2014 i ZAMORANO CARRERA DE AGROINDUSTRIA ALIMENTARIA Evaluación de los aceites esenciales (Alfa Pineno y Limonene) contra el crecimiento de Staphylococcus aureus productores de enterotoxinas in vitro Proyecto especial de graduación presentado como requisito parcial para optar al título de Ingeniero en Agroindustria Alimentaria en el Grado Académico de Licenciatura Presentado por: Donaldo Enrique Cruz Villeda Zamorano, Honduras Octubre, 2014 ii Evaluación de los aceites esenciales (Alfa Pineno y Limonene) contra el crecimiento de Staphylococcus aureus productores de toxinas in vitro Presentado por: Donaldo Enrique Cruz Villeda Aprobado: ______________________________ ______________________________ Mayra Márquez, Ph.D. Luis Fernando Osorio, Ph.D. Asesora Principal Director Departamento de Agroindustria Alimentaria ______________________________ ______________________________ Jorge Cardona, Ph.D. Raúl H. Zelaya, Ph.D. Asesor Decano Académico iii Evaluación de los aceites esenciales (Alfa Pineno y Limonene) contra el crecimiento de Staphylococcus aureus productores de toxinas in vitro Donaldo Enrique Cruz Villeda Resumen: Dentro de los diversos factores de virulencia que produce Staphylococcus aureus se encuentran las enterotoxinas, que están directamente relacionadas con intoxicación alimentaria. Utilizando la técnica de reacción en cadena de polimerasa se detectó al menos uno de los genes productores de toxinas seA-seE y seG, seH y seI en diez cepas analizadas. Por otra parte, la industria alimentaria está en busca de nuevos antimicrobianos para el control de S. aureus debido a que esta bacteria ha desarrollado resistencia a un considerable número de antibióticos en las últimas décadas. El objetivo de esta sección fue evaluar el efecto de dos aceites esenciales (α-pineno y limoneno), a una concentración de 0.5 y 1.5%, solos y en combinación, para determinar cuál de los dos presenta un mayor efecto inhibitorio sobre las diferentes cepas de S. aureus a dos temperaturas (37 y 25 °C). Todos los tratamientos mostraron inhibición contra el microorganismo. En ambas temperaturas fue más notable la acción inhibitoria de alfa pineno a una concentración de 1.5%. A 37 °C α-pineno aumentó el tiempo de generación en promedio a 9.6 horas en cepas resistentes a antibióticos (MRSA) y 7 horas en cepas sensibles (MSSA). A 25 °C el compuesto prolongó el tiempo de generación de 5 a 17 horas para las cepas MRSA y de 4.6 a 13 horas para las cepas MSSA. En este experimento ocurrió antagonismo por parte de limoneno para α-pineno. Es necesario realizar más investigaciones para incorporar de manera definitiva estos antimicrobianos en productos alimenticios. Palabras clave: Antimicrobiano, enterotoxinas, resistencia antibióticos, tiempo de generación. Abstract: Enterotoxins are found among the different virulence factors produced by Staphylococcus aureus, which are closely related to food borne diseases. Staphylococcal genes seA-seE and seG, seH and seI were identified in most of S. aureus strains using the Polymerase Chain Reaction technique. Conversely, food industry is in the search of new antimicrobials for the control of S. aureus due that this microorganism has developed multi-antibiotic resistance in the last decades. The objective of this section was to evaluate the effect of two essential oils in concentrations of 0.5 and 1.5%, alone and in combination, to determine which has a higher inhibitory effect against the different S. aureus strains at two temperatures (37 °C and 25 °C). All treatments showed inhibition against the microorganism. At both temperatures, α-pinene at 1.5 % had a higher inhibition than limonene and the combinations. At 37 °C, α-pinene increased the strains’ specific growth rate up to 9.6 hours (MRSA) and 7 hours (MSSA) and at 25 °C it increased the specific growth rate up to 17 hours (MRSA) and 13 hours (MSSA). Antagonism was observed when combining essential oils. It is necessary to do more research to definitely incorporate these antimicrobials in food products. Key words: Antimicrobial, enterotoxins, antibiotic resistances, growth rate. iv CONTENIDO Portadilla……………………………………………………………….......... i Página de firmas……………………………………………………………... ii Resumen……………………………………………………………………... iii Contenido……………………………………………………………………. iv Índice de Cuadros, Figuras y Anexos………………………………….......... v 1 INTRODUCCIÓN ........................................................................................ 1 2 MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................... 3 3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................. 6 4 CONCLUSIONES ........................................................................................ 12 5 RECOMENDACIONES .............................................................................. 13 6 LITERATURA CITADA ............................................................................. 14 7 ANEXOS ........................................................................................................ 18 v ÍNDICE DE CUADROS Y FIGURAS Cuadros Página 1. Formulación de los reactivos para amplificación de ADN de las cepas de S. aureus. ....................................................................................................... 4 2. Descripción de los tratamientos del crecimiento de S. aureus en presencia de aceites esenciales. ..................................................................................... 5 3. Caracterización vía PCR de los genes que codifican para la producción de enterotoxina en diferentes cepas de S. aureus. .............................................. 7 4. Tiempo de generación (en horas) de Staphylococcus aureus en presencia de los compuestos de aceites esenciales a 37 °C. .......................................... 9 5. Tiempo de generación (en horas) de Staphylococcus aureus en presencia de los compuestos de aceites esenciales a 25 °C. .......................................... 10 Anexos 1. Interacción de factores que tuvieron influencia en el comportamiento de las cepas de Staphylococcus aureus utilizando los compuestos α-pineno y R-(+)-limonene. ............................................................................................. 18 2. Gráficas de crecimiento de cepas de S. aureus #24 en presencia de aceites esenciales y su combinación a 37 °C. ............................................................ 19 3. Gráficas de crecimiento de cepas de S. aureus #36 en presencia de aceites esenciales y su combinación a 37 °C. ............................................................ 20 4. Gráficas de crecimiento de cepas de S. aureus ATCC 6538 en presencia de aceites esenciales y su combinación a 37 °C. ........................................... 21 5. Gráficas de crecimiento de cepas de S. aureus ATCC 25923 en presencia de aceites esenciales y su combinación a 37 °C. ........................................... 22 6. Gráficas de crecimiento de cepas de S. aureus #56 en presencia de aceites esenciales y su combinación a 37 °C. ............................................................ 23 7. Gráficas de crecimiento de cepas de S. aureus Mu50 en presencia de aceites esenciales y su combinación a 37 °C. ................................................ 24 8. Gráficas de crecimiento de cepas de S. aureus COL en presencia de aceites esenciales y su combinación a 37 °C. ................................................ 26 Página vi Anexos Página 9. Gráficas de crecimiento de cepas de S. aureus ATCC 6538 en presencia de aceites esenciales y su combinación a 25 °C. ........................................... 27 10. Gráficas de crecimiento de cepas de S. aureus ATCC 25923 en presencia de aceites esenciales y su combinación a 25 °C. ........................................... 28 11. Gráficas de crecimiento de cepas de S. aureus #24 en presencia de aceites esenciales y su combinación a 25 °C. ............................................................ 29 12. Gráficas de crecimiento de cepas de S. aureus #36 en presencia de aceites esenciales y su combinación a 25 °C. ............................................................ 30 13. Gráficas de crecimiento de cepas de S. aureus #56 en presencia de aceites esenciales y su combinación a 25 °C. ............................................................ 31 14. Gráficas de crecimiento de cepas de S. aureus Mu50 en presencia de aceites esenciales y su combinación a 25 °C. ................................................ 32 15. Gráficas de crecimiento de cepas de S. aureus N315 en presencia de aceites esenciales y su combinación a 25 °C. ................................................ 33 16. Gráficas de crecimiento de cepas de S. aureus COL en presencia de aceites esenciales y su combinación a 25 °C. ................................................ 34 1 1. INTRODUCCIÓN Staphylococcus aureus es un microorganismo Gram positivo, coagulasa positivo o negativo, oportunista (Walker et al. 2013) y miembro de la familia Micrococcaceae. Esta bacteria es altamente adaptativa, siendo capaz de crecer bajo condiciones aeróbicas y anaeróbicas (Francois et al. 2014). S. aureus es responsable de un amplio espectro de enfermedades en seres humanos incluyendo desde infecciones benignas en la piel hasta enfermedades que atentan contra la vida como ser septicemia (Francois et al. 2014). Además, la intoxicación estafilocócica es una de las causas más comunes de las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) debido al consumo de alimentos contaminados con enterotoxinas producidas por la bacteria (Stressl y Wagner 2013). El desarrollo de resistencia a antibióticos y la habilidad para colonizar e infectar a los humanos y productos alimenticios, por parte de S. aureus, se ha convertido en una seria amenaza para la salud humana y la industria de alimentos (Pegram 1981). Las toxinas estafilocócicas son toxinas eméticas, clasificadas como miembros de la familia pirogénica súperantígena debido a su actividad biológica y su cercana relación estructural (Blaiotta et al. 2004). Es de mucha importancia recalcar que no todas las toxinas producidas por S. aureus cumplen la misma función. Entre las más importantes se encuentran las hemolisinas, las leucocidinas, toxinas exfoliativas, toxina del síndrome de shock tóxico (TSST, por sus siglas en inglés) y las enterotoxinas (Fueyo 2005). Es muy importante mencionar que la patogénesis o etiología de S. aureus está directamente relacionada a la abundante excreción de enterotoxinas, causando daño incluso en las células inmunológicas del huésped (Enany et al. 2013, Francois et al. 2014). Por otra parte, es de vital importancia conocer que estás proteínas están directamente asociadas a la intoxicación estafilocócica en alimentos, la cual ocurre después de haber sido ingerido el alimento, manifestándose particularmente en carnes procesadas y productos lácteos (Argudín et al. 2010). Entre las enterotoxinas más comunes en las intoxicaciones se encuentran: SEA-SEE, SEG, SEH, SEI, SER-SET (Blaiotta et al. 2004, Klotz et al. 2003). Adicionalmente, las enterotoxinas, al ser proteínas, producen compuestos que se asocian a la pared celular de las células del huésped. Aunque esto no es requerido para su crecimiento o división celular bajo condiciones ordinarias, permiten al microorganismo a adaptarse a condiciones de medio especiales, incluyendo varios tipos de estrés así como diferente tipos de sustratos nutricionales (Herbert et al. 2001). Estas secreciones constituyen un reservorio de factores de virulencia (Kusch y Engelmann 2014), los cuales son necesarios para la bacteria pueda colonizar el tejido del huésped y adquirir protección contra cualquier defensa del huésped (Enany et al. 2013). Estas secreciones constituyen un reservorio de factores de virulencia (Kusch y Engelmann 2014), los cuales son necesarios para la bacteria pueda colonizar el tejido del huésped y adquirir protección contra cualquier defensa del huésped (Enany et al. 2013). 2 Las cepas de S. aureus resistentes a antibióticos son más conocidas como Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA, por sus siglas en inglés), siendo estas más difíciles de controlar (Walker et al. 2013). De acuerdo al Instituto Nacional de Vigilancia de Infecciones Nosocomiales (NNIS, por sus siglas en inglés) (2002) el 52.3% de las infecciones nosocomiales en las unidades de cuidados intensivos en los hospitales de Estados Unidos se deben a MRSA. Esto demuestra un incremento de 37% de 1994 hasta 1998, lo que refleja un serio problema en el control de este microorganismo. Los costos de hospitalización asociados a infecciones causados por MRSA ascienden hasta $ 35,000/infección (Ravipaty y Reilly 2010). La Autoridad Europea para la Inocuidad de Alimentos (EFSA, por sus siglas en inglés) informó acerca de la presencia una cepa MRSA (CC398) en animales de producción de carne para consumo humano (cerdos, terneros y pollos) (Mulders et al. 2010), sin embargo esto no se ha asociado a enfermedades transmitidas por alimentos. Aun cuando no todas estas infecciones son causadas por MRSA en alimentos, la industria alimentaria está obligada a buscar nuevas alternativas a los antibióticos convencionales. Es debido a esto que surge una nueva alternativa a los antibióticos convencionales, los aceites esenciales. Los aceites esenciales, también llamados esencias aromáticas de plantas, son sustancias aceitosas, volátiles, producidas por un amplio espectro de familia de plantas que demuestran tener propiedades antimicrobianas. Para los propósitos de este estudio, se utilizaron dos aceites esenciales, R-(+)-limonene y α-Pineno. R-(+)-limonene es un aceite esencial extraído en su mayoría de plantas cítricas, es parte de una larga lista de compuestos llamados hidrocarburos terpénicos monocíclicos. Estos compuestos han demostrado poseer características antibacterianas, antifúngicos e insecticidas (Carson y Hammer 2011). Este aceite se ha mostrado activo frente a bacterias que contaminan alimentos (Imbesi y De Pasquale 2003). Por otra parte, α-Pineno es considerado el monoterpeno más abundante y químicamente explotado por la industria, el cual es extraído de una gran variedad de pinos (Liu 2005). En el presente proyecto se caracterizaron genéticamente diez cepas de S. aureus para identificar el tipo de enterotoxinas que producen y se demuestra el efecto de los aceites esenciales en el crecimiento de diez cepas de S. aureus. Los objetivos de este proyecto fueron:  Detectar los genes de producción de enterotoxinas en diversas cepas de Staphylococcus aureus.  Evaluar el efecto de compuestos aceites esenciales puros (R-(+)-limonene y α- Pineno) en el crecimiento de Staphylococcus aureus.  Evaluar el efecto de combinaciones de compuestos de aceites esenciales (R-(+)- limonene y α-pineno) en el crecimiento de Staphylococcus aureus. 3 2. MATERIALES Y MÉTODOS Ubicación del ensayo. El estudio se llevó a cabo en el Centro de Investigación de Biomasa, en el departamento de Ciencia de Alimentos de la Universidad de Arkansas, localizada en Fayetteville, Arkansas, Estados Unidos de América. Cepas bacterianas. S. aureus ATCC 25923 y S. aureus ATCC 6538 (sensibles a antibióticos), S. aureus N315 (MRSA), S. aureus COL (MRSA) y S. aureus MU50 (Resistente intermedio a Vancomicina) facilitadas por el Laboratorio Dr. Wilkinson de la Universidad Estatal de Illinois. Las cepas restantes S. aureus #24, #36, #37, #43 (sensibles a antibióticos) y #56 (MRSA) procedentes de aislados de hisopos nasales, fueron facilitadas por el Dr. Dave Gilmore de la Universidad Estatal de Arkansas. Cultivo de bacterias. Los inóculos de Staphylococcus fueron preparados en 5 ml de caldo de soya tríptico (CST) adicionándole una colonia extraída de las placas de agar soya tríptico (AST), las cuales contenían las cepas. Los cultivos fueron incubados a 37 °C y 150 RPM durante 24 horas. Extracción de ADN. Al siguiente día, se tomó 1 ml de cada cultivo y se transfirieron a tubos de microcentrífuga. Los cultivos fueron centrifugados a 10 °C a 10,000 X g por 10 minutos para obtener el pellet de células de la bacteria. Luego de centrifugar, se lavó el pellet utilizando 100 μl de buffer TE (Tris-EDTA) y se suspendió en 200 μl del mismo buffer. La extracción del ADN genómico se realizó siguiendo el protocolo del manufacturador (QiAGEN DNA mini kit). La porción final de ADN se disolvió en 100 μl de buffer TE y fue almacenada a en el congelador a -22 °C. La concentración de ADN genómico en las muestras se midió al siguiente día utilizando el espectrofotómetro (Nanodrop 1000) obteniendo un resultado en ηg/L. Detección de los genes en las cepas bacterianas. Se realizó la detección utilizando la técnica de reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés). En un tubo de microcentrífuga se agregaron los reactivos necesarios para la amplificación (Cuadro 1). 4 Cuadro 1. Formulación de los reactivos para amplificación de ADN de las cepas de S. aureus. Reactivos Volumen (µl) Taq polimerasa 12.5 Potenciador 360 GC 0.5 F Primer 10 µM 0.5 R Primer 10 µM 0.5 Agua desionizada estéril 9.0 Muestra de ADN 2.0 Volumen total 25.0 Posteriormente se colocaron las muestras en el termociclador (Artik Cycler), utilizando un programa de amplificación con las siguientes condiciones: 5 minutos a 95 °C para la etapa inicial, 40 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 52 °C y 30 segundos a 72 °C para la etapa de desnaturalización y 5 minutos a 72 °C para la etapa de elongación y extensión. Luego, se agregaron las muestras extraídas del termociclador a un gel de agarosa (1.5%) para llevar a cabo la electroforesis, la cual se programó a 50 V durante 2 horas. Preparación de aceites esenciales. Los aceites a utilizar, R-(+)-limonene (Sigma Aldrich) y α-Pineno (Sigma Aldrich), se prepararon en dos concentraciones (0.5 y 1.5% v/v). Estos aceites se prepararon en Tween 80 debido a que no son hidrosolubles. Para la concentración 0.5% se agregaron 50 μl del aceite esencial (α-pineno o R-(+)-limonene) en 10 ml de Tween 80. Para la concentración de 1.5% se agregaron 150 μl del aceite esencial en 10 ml de Tween 80. La combinación de los aceites se realizó tomando 5 ml de cada stock de los aceites previamente prepararados y se mezclaron en un tubo nuevo, para cada una de las concentraciones. Crecimiento de S. aureus en presencia de aceites esenciales. Se realizó un precultivo de cada cepa, este se llevó a cabo tomando una colonia de la cepa e inoculándola en 5 ml de CST a 37 °C con una agitación de 150 RPM. Al siguiente día, se tomó 1 ml de cada cultivo y se diluyó en 25 ml de CST para obtener así una baja densidad óptica (DO~0.2 @ 600ηm). La incubación de las cepas se llevó a cabo utilizando el lector de microplacas TECAN®. Se realizaron un total de 4 rondas de incubación. Se colocaron 5 cepas por cada ronda de incubación a 37 °C durante 48 h y 25 °C durante 72 h de modo de que todas las cepas recibieran todos los tratamientos (Cuadro 2). 5 Cuadro 2. Descripción de los tratamientos del crecimiento de S. aureus en presencia de aceites esenciales. Ronda Cepas Condiciones 1 24, 36, 37, 43 and 56 37 °C durante 48 horas 2 24, 36, 37, 43 and 56 25 °C durante 72 horas 3 N315, Col, Mu50, ATCC 6538, ATCC 25923 25 °C durante 72 horas 4 N315, Col, Mu50, ATCC 6538, ATCC 25923 37 °C durante 48 horas Después de la incubación se realizaron las curvas de crecimiento y se calcularon los tiempos de generación para cada cepa para compararlos con los tiempos de generación de los controles positivos. Para el cálculo del tiempo de generación se calculó el tiempo de duplicación (td) de las células en relación a la densidad óptica (DO) y el tiempo. Esto se realizó utilizando la ecuación 1 planteada por Widdel (2007): 𝑡𝑑 = 2.303(log𝑂𝐷2 − log𝑂𝐷1) (𝑡2 − 𝑡1) Una vez calculado td, se insertó en la ecuación 2 para obtener el tiempo de generación de cada cepa: µ = ln 2 𝑡𝑑 Diseño experimental. Se utilizó el programa estadístico SAS® versión 9.3, se realizó un Diseño Completamente al Azar (DCA), un análisis de varianza (ANOVA) con un arreglo factorial de 2×3×2 (2 tipos de cepas, 3 aceites esenciales, 2 concentraciones) con dos repeticiones para cada una de las temperaturas (37 °C y 25 °C), separación de medias LS means con un nivel de significancia de 0.05. [1] [2] 6 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Detección de los genes estafilocócicos en las cepas bacterianas. Los resultados de los ensayos de PCR en las cepas de S. aureus se muestran en el cuadro 3. Se pudo observar que la mayoría de las cepas sometidas a la prueba fueron positivas para la mayoría de los genes estafilocócicos (GE) clásicos (seA-seE), con la excepción de los genes seB y seD para los cuales ninguna fue positiva a excepción del control positivo. Para el gen seA fueron positivas 9 cepas (90%), exceptuando la cepa #37. Los resultados del gen seC demostraron que las 9 cepas (90%) menos 1 (#37) fueron positivas y para el gen seE 8 cepas (80%) fueron positivas, excluyendo las cepas ATCC 6538 y N315. Los genes que codifican la enterotoxina estafilocócica G (seG) fueron detectados en las 10 cepas (100%) analizadas en este ensayo. Por su parte, el gen seH solamente se detectó en 2 cepas (20%) Mu50 y #43 y el gen seI se manifestó en 8 cepas exceptuando ATCC 6538 y N315. De las siete enterotoxinas incluídas en la investigación, la enterotoxina del serotipo A es la que está relacionada más cercanamente con los brotes por intoxicación alimentaria, siguiéndole en orden decreciente las C, B, D y E (Bécquer et al. 1996 y Normanno et al. 2007). Se observó que solo una cepa (10%) fue positiva para la enterotoxina B, Márquez (2012) detectó la enterotoxina B en el 11% de muestras de queso blanco artesanal se analizaron en su investigación. La enterotoxina C ha sido identificado en la mayoría de las cepas en esta investigación y Normanno et al. (2007) estudió previamente que este gen está sumamente asociado a intoxicaciones por consumo de productos lácteos contaminados. El 80% de las cepas sometidas a la detección fueron positivas para la enterotoxina E. En muchos casos la enterotoxina E ha sido detectada en muestras de pollo (Jarraud et al. 1999). Por su parte las enterotoxinas del serotipo G, H e I han demostrado ser inductoras de síndromes gastroentéricos en las personas que resultan intoxicadas por estas (Klotz et al 2003). De acuerdo a Sakai et al. (2008), la enterotoxina del tipo H es muy similar a la enterotoxina A, por lo cual se supone que está involucrada en casos de intoxicación alimentaria por Staphylococcus. 7 Cuadro 3. Caracterización vía PCR de los genes que codifican para la producción de enterotoxina en diferentes cepas de S. aureus. Cepas Tipo seA seB seC seD seE seG seH seI 56 MRSA + - + - + + - + COL MRSA +* +* + - + + - + Mu50 MRSA + - +* - + +* + + N315 MRSA +* - +* - - +* - - 24 MSSA + - + - + + - + ATCC 6538 MSSA + - + - - + - - 43 MSSA + - + - + + + + 37 MSSA - - + - + + - + 36 MSSA + - - - + + - + ATCC 25923 MSSA + - + - + + - +* NRS 382 - +* NRS 123 - +* NRS 111 - +* (*): Cepas de referencia utilizadas como control positivo. se: gen estafilocócico MSSA: Staphylococcus aureus sensible a antibióticos. MRSA: Staphylococcus aureus resistente a antibióticos. Crecimiento de S. aureus en presencia de aceites esenciales. En el análisis del efecto de los aceites sobre el crecimiento de las diez cepas de S. aureus se pudo observar que los aceites, puros y en combinación, tuvieron un efecto inhibitorio en el crecimiento de las cepas. A 37 °C, siendo la temperatura óptima de crecimiento de las bacterias, el aceite que mostró la mejor acción inhibitoria fue α-pineno a una concentración de 1.5%. Este tratamiento aumentó el tiempo de generación en promedio a 9.6 horas (MRSA) y 7 horas (MSSA), aproximadamente a 4 veces más que el control positivo. También tuvo un efecto considerable en el tiempo de generación el compuesto R-(+)-limonene a una concentración de 1.5%, hubo una mejor respuesta de las cepas tipo MRSA al tratamiento, dando como resultado un tiempo de generación de 6 horas en promedio. Como se esperaba ambos aceites a una concentración de 0.5% fueron menos efectivos en la inhibición del crecimiento de las bacterias dando como resultado tiempos de generación en un rango de 3-3.6 horas de tiempo de generación para ambos tipos de cepa. No hubo diferencias significativas entre en los tratamientos a 0.5% y el control (Cuadro 4). Al combinar los compuestos, la concentración que tuvo mayor efecto inhibitorio sobre el crecimiento de la bacteria fue la de 1.5%, pero mostró menor inhibición que el compuesto 8 α- pineno puro a 1.5% y un comportamiento estadísticamente igual al (-D) limonene a 1.5%. En los ensayos a 25 °C los tiempos de generación de las bacterias aumentaron significativamente como era esperado. El compuesto que mostró mejor inhibición fue α- pineno puro a 1.5 % prolongando el tiempo de generación de 5 a 17 horas en promedio para las cepas MRSA y de 4.6 a 13 horas para las cepas MSSA, siendo estadísticamente diferente a los demás tratamientos y al control. El tratamiento con (-D) limonene a 1.5% fue menos efectivo que α- pineno a 1.5% (10.7 y 7.5 horas de tiempo de generación para MRSA y MSSA, respectivamente) pero también mostró un aumento significativo en el tiempo de generación con respecto al control. El tratamiento con los compuestos en combinación a 1.5% fue estadísticamente igual al tratamiento con (-D) limonene a 1.5% pero fue a su vez inferior al tratamiento con α- pineno a 1.5%. Los tratamientos con los compuestos concentrados al 0.5% fueron significativamente inferiores a los tratamientos a 1.5% como se esperaba. Los resultados de todos los tratamientos para las cepas MRSA fueron mayores que para las cepas MSSA (Cuadro 5). Se atribuye la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales a los diversos efectos que estos pueden causar en la célula del microorganismo como ser: cambios en la morfología, inhibición de la respiración de la célula, ruptura de la pared celular de la célula y división de la célula (Al Yousef 2014, Medeiros 2007). Se ha demostrado que la mayor parte de la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales proviene de los terpenos oxigenados (terpenos fenólicos y alcoholes), siendo α- pineno y (-D) limonene parte de estos (Bassolé y Juliani 2012). Α- pineno y otros aceites esenciales han demostrado tener actividad inhibitoria contra MRSA en experimentos previos (Raman et al. 1995, Rivas et al. 2012, Dhar et al. 2014). El compuesto (-D) limonene también ha demostrado tener actividad inhibitoria contra S. aureus en estudios previos, siendo siempre menos efectivo que α- pineno (Imbesi y De Pasquale 2002, Lee 2007). La razón de poseer una menor actividad inhibitoria se puede atribuir a que potencialmente exista un contenido demasiado alto de hidrocarburos en este compuesto (Bassolé y Juliani 2012). 9 Cuadro 4. Tiempo de generación (en horas) de Staphylococcus aureus en presencia de los compuestos de aceites esenciales a 37 °C. R-(+)-limonene α-pineno α-pineno + R-(+)-limonene Tipo de Cepa Control (+) 0.5 % 1.5% 0.5 % 1.5 % 0.5 % 1.5 % Media ±DE Media ±DE Media ±DE Media ±DE Media ±DE Media ±DE MRSA 2.44±0.207 Ay 3.45 ±0.48 Ay 6.14±1.20 Ax 3.50±0.53 Ay 9.64±1.39 Aw 3.62±0.69 Ay 7.02±1.34 Ax MSSA 2.28±0.242 Ay 2.97±0.23 Ay 4.09±0.23 Bx 3.17±0.30 Ay 6.93±1.20 Bw 3.28±0.38 Axy 5.06±0.74 Bx CV (%) 9.85 13.61 15.33 23.40 20.80 16.42 24.06 MSSA: Staphylococcus aureus sensible a antibióticos. MRSA: Staphylococcus aureus resistente a antibióticos. DE: Desviación estándar CV: Coeficiente de variación Medias con letras mayúsculas diferentes en cada columna (A-B) son estadísticamente diferentes (P≤0.05) y letras minúsculas diferentes en cada fila (w-y) son estadísticamente diferentes (P≤0.05). 10 Cuadro 5. Tiempo de generación (en horas) de Staphylococcus aureus en presencia de los compuestos de aceites esenciales a 25 °C. R-(+)-limonene α-pineno α-pineno + R-(+)-limonene Tipo de Cepa Control (+) 0.5 % 1.5% 0.5 % 1.5 % 0.5 % 1.5 % Media ±DE Media ±DE Media ±DE Media ±DE Media ±DE Media ±DE MRSA 5.02±0.67 Az 7.88±1.92 Ay 10.79±3.30 Ax 8.16±3.01 Ay 17.082±3.02 Aw 7.98±1.85 Ay 12.08±1.34 Ax MSSA 4.64±0.29 Ayz 5.45±0.45 By 7.45±1.18 By 6.28±0.30 By 15.216±0.00 Bw 5.86±0.48 By 9.21±2.39 Bx CV (%) 11.10 11.04 18.06 6.60 22.02 20.21 20.10 MSSA: Staphylococcus aureus sensible a antibióticos. MRSA: Staphylococcus aureus resistente a antibióticos. DE: Desviación estándar CV: Coeficiente de variación Medias con letras mayúsculas diferentes en cada columna (A-B) son estadísticamente diferentes (P≤0.05) y letras minúsculas diferentes en cada fila (w-y) son estadísticamente diferentes (P≤0.05). 11 Al combinar los compuestos de aceites esenciales se debe tener en cuenta que pueden ocurrir cuatro fenómenos producto de la combinación, estos son: antagonismo, indiferencia, adición y sinergismo (Burt 2004). Se puede decir que en este experimento ocurrió antagonismo por parte de R-(+)-limonene para α-pineno. Es decir, al combinarlos el efecto inhibitorio fue menor al que mostró α-pineno individualmente. El efecto de antagonismo puede ocurrir dependiendo de la proporción en que se utilicen los aceites esenciales (Van Vuuren et al. 2009, Bassolé y Juliani 2012) En todos los tratamientos de los compuestos de aceites esenciales al 1.5 % existió diferencia significativa en el tiempo de generación entre los tipos de cepa (MRSA y MSSA) demostrando mayor sensibilidad al compuesto las cepas resistentes. No hubo diferencia para el tiempo de generación en los tratamientos a 0.5%. Esto se puede atribuir potencialmente, a la alta sensibilidad que poseen algunas cepas de S. aureus a diferentes aceites como ser el de eucalipto, oréganos y romero, estando compuesto este último en mayor porcentaje por α-pineno, 1,8 cineole y alcanfor (Smith-Palmer et al. 1998, Issabeagloo et al. 2012) Se ha demostrado que un amplio espectro de aceites esenciales posee actividad antimicrobiana ante una diversidad de microorganismos, sin embargo, su aplicación en alimentos sigue careciendo de investigación (Edward-Jones et al. 2004). Una de las principales características de un alimento que se verían afectadas por el uso de aceites esenciales sería el sabor, por lo cual se ha planteado utilizar estos aceites en bajas concentraciones para minimizar el efecto antes mencionado (Reyes-Jurado et al. 2012). Debido a que su uso se da principalmente en fragancias y como saborizantes, también existe poca información acerca de la regulación del uso los aceites esenciales como antimicrobianos en la industria alimentaria (Brud 2010). El Código de Regulaciones Federales de Estados Unidos (CFR, por sus siglas en inglés), establece que para sustancias producidas naturalmente se debe aplicar el criterio “… no debe provocar que el alimento se vuelva dañino a la salud” (CFR 2013). Los aceites esenciales, en su mayoría, son extraídos de plantas o fuentes comestibles pero no son comestibles por su cuenta (Adams y Taylor 2010), por lo cual al momento de ser reguladas resulta difícil aplicar un estándar para garantizar que el compuesto es seguro para el consumo. 12 4. CONCLUSIONES  Se detectaron la mayoría de los genes que codifican a las enterotoxinas directamente relacionadas con intoxicaciones alimentarias en la mayoría de las cepas analizadas.  El α-pineno a 1.5% tuvo el mejor efecto inhibitorio en las cepas de S. aureus a 37 °C y 25 °C.  Las cepas resistentes a antibióticos (MRSA) mostraron una mayor sensibilidad a los compuestos de aceites esenciales.  Los resultados de inhibición utilizando los compuestos en combinación, resultó en antagonismo de los aceites esenciales, mostrando menor inhibición que α-pineno utilizado individualmente.  Los aceites esenciales α-pineno y R-(+)-limonene, en forma individual, podrían ser utilizados en la industria de alimentos como compuestos antimicrobianos. 13 5. RECOMENDACIONES  Realizar ensayo de detección de factores de virulencia como ser el agr (gen regulador) y el egc (grupo de genes de enterotoxinas) para obtener mayor información acerca de las cepas analizadas.  Evaluar la efectividad de los mejores tratamientos de los compuestos de aceites esenciales a temperaturas de refrigeración  Determinar la aplicabilidad de los compuestos de aceites esenciales de forma directa en alimentos. 14 6. LITERATURA CITADA Adams, T. y Taylor, S. 2010. Handbook of Essential Oils: Safety Evaluation of Essential Oils: a Constituent-Based approach. Ed. K. Hüsnü y G. Buchbauer. USA. Editorial CRC press. 185-208 p. Al Yousef, S. 2014. Essential oils: their antimicrobial activity and potential application against pathogens by gaseous contact – a review. Egypt. Acad. J. Biolog. Sci. Vol. 6 (1): 37 – 54 p. Argudín, M., Mendoza, M. y Rodicio, M. 2010. Food Poisoning and Staphylococcus aureus Enterotoxins. Toxins. Vol. 2(7): 1751–1773. 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Interacción de factores que tuvieron influencia en el comportamiento de las cepas de Staphylococcus aureus utilizando los compuestos α-pineno y R-(+)-limonene. INTERACCIÓN P≤0.05 TEMP <.0001 CEPA <.0001 ACEITE <.0001 CONC <.0001 REP 0.2647 TEMP*CEPA*ACEIT*CONC <.0001 19 Anexo 2. Gráficas de crecimiento de cepas de S. aureus #24 en presencia de aceites esenciales y su combinación a 37 °C. OD: Densidad óptica. Alfa: α-pineno Lim: R-(+)-limonene A + L: α-pineno + R-(+)-limonene -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus 24 A + L 0.5% A + L 0.5% A + L 1.5% A + L 1.5% Control (+) Control (+) -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus 24 Alfa 0.5 % Alfa 0.5 % Alfa 1.5 % Alfa 1.5 % Control (+) Control (+) -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus 24 Lim 0.5 % Lim 0.5 % Lim 1.5% Lim 1.5% Control (+) Control (+) 20 Anexo 3. Gráficas de crecimiento de cepas de S. aureus #36 en presencia de aceites esenciales y su combinación a 37 °C. OD: Densidad óptica. Alfa: α-pineno Lim: R-(+)-limonene A + L: α-pineno + R-(+)-limonene -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus 36 Alfa 0.5% Alfa 0.5% Alfa 1.5% Alfa 1.5% Control (+) Control (+) -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus 36 Lim 0.5% Lim 0.5% Lim 1.5% Lim 1.5% Control (+) Control (+) -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus 36 A + L 0.5% A + L 0.5% A + L 1.5% A + L 1.5% Control (+) Control (+) 21 Anexo 4. Gráficas de crecimiento de cepas de S. aureus ATCC 6538 en presencia de aceites esenciales y su combinación a 37 °C. OD: Densidad óptica. Alfa: α-pineno Lim: R-(+)-limonene A + L: α-pineno + R-(+)-limonene -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 L o g O D ( 6 0 0 n m ) S. aureus 6538 Alfa 0.5% Alfa 0.5% Alfa 1.5% Alfa 1.5% Control (+) Control (+) -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 L o g O D ( 6 0 0 n m ) S. aureus 6538 A + L 0.5% A + L 0.5% A + L 1.5% A + L 1.5% Control (+) Control (+) -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 L o g O D ( 6 0 0 n m ) S. aureus 6538 Control (+) Control (+) Lim 0.5% Lim 0.5% Lim 1.5% Lim 1.5% 22 Anexo 5. Gráficas de crecimiento de cepas de S. aureus ATCC 25923 en presencia de aceites esenciales y su combinación a 37 °C. OD: Densidad óptica. Alfa: α-pineno Lim: R-(+)-limonene A + L: α-pineno + R-(+)-limonene -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus 25923 Alfa 0.5% Alfa 0.5% Alfa 1.5% Alfa 1.5% Control (+) Control (+) -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus 25923 Lim 0.5% Lim 0.5% Lim 1.5% Lim 1.5% Control (+) Control (+) -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus 25923 A + L 0.5% A + L 0.5% A + L 1.5% A + L 1.5% Control (+) Control (+) 23 Anexo 6. Gráficas de crecimiento de cepas de S. aureus #56 en presencia de aceites esenciales y su combinación a 37 °C. OD: Densidad óptica. Alfa: α-pineno Lim: R-(+)-limonene A + L: α-pineno + R-(+)-limonene -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus 56 Alfa 0.5% Alfa 0.5% Alfa 1.5% Alfa 1.5% Control (+) Control (+) -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus 56 Lim 0.5% Lim 0.5% Lim 1.5% Lim 1.5% Control (+) Control (+) -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus 56 A + L 0.5% A + L 0.5% A + L 1.5% A + L 1.5% Control (+) Control (+) 24 Anexo 7. Gráficas de crecimiento de cepas de S. aureus Mu50 en presencia de aceites esenciales y su combinación a 37 °C. OD: Densidad óptica. Alfa: α-pineno Lim: R-(+)-limonene A + L: α-pineno + R-(+)-limonene -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus Mu50 Alfa 0.5% Alfa 0.5% Alfa 1.5% Alfa 1.5% Control (+) Control (+) -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus Mu50 Lim 0.5% Lim 0.5% Lim 1.5% Lim 1.5% Control (+) Control (+) -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus Mu50 A + L 0.5% A + L 0.5% A + L 1.5% A + L 1.5% Control (+) Control (+) 25 Anexo 8. Gráficas de crecimiento de cepas de S. aureus N315 en presencia de aceites esenciales y su combinación a 37 °C. OD: Densidad óptica. Alfa: α-pineno Lim: R-(+)-limonene A + L: α-pineno + R-(+)-limonene -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus N315 Alfa 0.5% Alfa 0.5% Alfa 1.5% Alfa 1.5% Control (+) Control (+) -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus N315 Lim 0.5% Lim 0.5% Lim 1.5% Lim 1.5% Control (+) Control (+) -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus N315 A + L 0.5% A + L 0.5% A + L 1.5% A + L 1.5% Control (+) Control (+) 26 Anexo 9. Gráficas de crecimiento de cepas de S. aureus COL en presencia de aceites esenciales y su combinación a 37 °C. OD: Densidad óptica. Alfa: α-pineno Lim: R-(+)-limonene A + L: α-pineno + R-(+)-limonene -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus COL Alfa 0.5% Alfa 0.5% Alfa 1.5% Alfa 1.5% Control (+) Control (+) -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus COL Lim 0.5% Lim 0.5% Lim 1.5% Lim 1.5% Control (+) Control (+) -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus COL A + L 0.5% A + L 0.5% A + L 1.5% A + L 1.5% Control (+) Control (+) 27 Anexo 10. Gráficas de crecimiento de cepas de S. aureus ATCC 6538 en presencia de aceites esenciales y su combinación a 25 °C. OD: Densidad óptica. Alfa: α-pineno Lim: R-(+)-limonene A + L: α-pineno + R-(+)-limonene -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus 6538 Alfa 0.5% Alfa 0.5% Alfa 1.5% Alfa 1.5% Control (+) Control (+) -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus 6538 Lim 0.5% Lim 0.5% Lim 1.5% Lim 1.5% Control (+) Control (+) -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus 6538 A + L 0.5% A + L 0.5% A + L 1.5% A + L 1.5% Control (+) Control (+) 28 Anexo 11. Gráficas de crecimiento de cepas de S. aureus ATCC 25923 en presencia de aceites esenciales y su combinación a 25 °C. OD: Densidad óptica. Alfa: α-pineno Lim: R-(+)-limonene A + L: α-pineno + R-(+)-limonene -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus 25923 Alfa 0.5% Alfa 0.5% Alfa 1.5% Alfa 1.5% Control (+) Control (+) -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus 25923 Lim 0.5% Lim 0.5% Lim 1.5% Lim 1.5% Control (+) Control (+) -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus 25923 A + L 0.5% A + L 0.5% A + L 1.5% A + L 1.5% Control (+) Control (+) 31 Anexo 12. Gráficas de crecimiento de cepas de S. aureus #24 en presencia de aceites esenciales y su combinación a 25 °C. OD: Densidad óptica. Alfa: α-pineno Lim: R-(+)-limonene A + L: α-pineno + R-(+)-limonene -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus 24 Alfa 0.5% Alfa 0.5% Alfa 1.5% Alfa 1.5% Control (+) Control (+) -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus 24 Lim 0.5% Lim 0.5% Lim 1.5% Lim 1.5% Control (+) Control (+) -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus 24 A + L 0.5% A + L 0.5% A + L 1.5% A + L 1.5% Control (+) Control (+) 30 Anexo 13. Gráficas de crecimiento de cepas de S. aureus #36 en presencia de aceites esenciales y su combinación a 25 °C. OD: Densidad óptica. Alfa: α-pineno Lim: R-(+)-limonene A + L: α-pineno + R-(+)-limonene -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus 36 Alfa 0.5% Alfa 0.5% Alfa 1.5% Alfa 1.5% Control (+) Control (+) -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus 36 Lim 0.5% Lim 0.5% Lim 1.5% Lim 1.5% Control (+) Control (+) -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus 36 A + L 0.5% A + L 0.5% A + L 1.5% A + L 1.5% Control (+) Control (+) 31 Anexo 14. Gráficas de crecimiento de cepas de S. aureus #56 en presencia de aceites esenciales y su combinación a 25 °C. OD: Densidad óptica. Alfa: α-pineno Lim: R-(+)-limonene A + L: α-pineno + R-(+)-limonene -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus 56 Alfa 0.5% Alfa 1.5% Alfa 0.5% Alfa 1.5% Control (+) Control (+) -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus 56 Lim 0.5% Lim 0.5% Lim 1.5% Lim 1.5% Control (+) Control (+) -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus 56 A + L 0.5% A + L 0.5% A + L 1.5% A + L 1.5% Control (+) Control (+) 32 Anexo 15. Gráficas de crecimiento de cepas de S. aureus Mu50 en presencia de aceites esenciales y su combinación a 25 °C. OD: Densidad óptica. Alfa: α-pineno Lim: R-(+)-limonene A + L: α-pineno + R-(+)-limonene -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus Mu50 Alfa 0.5% Alfa 0.5% Alfa 1.5% Alfa 1.5% Control (+) Control (+) -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus Mu50 Lim 0.5% Lim 0.5% Lim 1.5% Lim 1.5% Control (+) Control (+) -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus Mu50 A + L 0.5% A + L 0.5% A + L 1.5% A + L 1.5% Control (+) Control (+) 33 Anexo 16. Gráficas de crecimiento de cepas de S. aureus N315 en presencia de aceites esenciales y su combinación a 25 °C. OD: Densidad óptica. Alfa: α-pineno Lim: R-(+)-limonene A + L: α-pineno + R-(+)-limonene -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 L o f O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus N315 Alfa 0.5% Alfa 0.5% Alfa 1.5% Alfa 1.5% Control (+) Control (+) -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 L o f O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus N315 Lim 0.5% Lim 0.5% Lim 1.5% Lim 1.5% Control (+) Control (+) -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 L o f O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus N315 A + L 0.5% A + L 0.5% A + L 1.5% A + L 1.5% Control (+) Control (+) 34 Anexo 17. Gráficas de crecimiento de cepas de S. aureus COL en presencia de aceites esenciales y su combinación a 25 °C. OD: Densidad óptica. Alfa: α-pineno Lim: R-(+)-limonene A + L: α-pineno + R-(+)-limonene -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus COL Alfa 0.5% Alfa 0.5% Alfa 0.5% Alfa 0.5% Control (+) Control (+) -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus COL Lim 0.5% Lim 0.5% Lim 1.5% Lim 1.5% Control (+) Control (+) -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 L o g O D ( 6 0 0 n m ) Tiempo (h) S. aureus COL A + L 0.5% A + L 0.5% A + L 1.5% A + L 1.5% Control (+) Control (+) Portada Portadilla Resumen Tabla de contenido Índice de cuadros, figuras y anexos Introducción Materiales y métodos Resultados y discusión Conclusiones Recomendaciones Literatura Citada Anexos